一種使植物器官變小的方法

2023-09-15 23:32:05 3

專利名稱：一種使植物器官變小的方法
技術領域：
本發明涉及ー種使植物器官變小的方法。
背景技術：
隨著人口的不斷増加，耕地的逐漸減少，如何提高作物產量已經成為ー個世界性的、汲待解決的重大問題。植物器官大小直接關係到植物的產量。器官大小不僅受環境因素影響，而且受內源基因的調控。所以，研究植物體如何實現自身對器官大小的控制已經成為提高作物產量的重要策略之一。轉錄中介體是存在與所有真核生物中的一個多亞基蛋白複合體，是介於轉錄因子和基礎轉錄機器之間的橋梁。幾乎所有基因的表達都需要轉錄中介體的調節。

發明內容
本發明的ー個目的是提供ー種使植物器官變小的方法。本發明所提供的使植物器官變小的方法，包括如下步驟向出發植物中導入SEQ IDNO :1所示蛋白的編碼基因，得到目的轉基因植物，所述目的轉基因植物的器官小於所述出發植物的器官。上述方法中，所述基因是通過重組表達載體導入的。上述方法中，所述重組表達載體是向質粒pGreen-35S的多克隆位點間插入所述編碼基因得到的。上述方法中，所述多克隆位點為EcoRI酶切位點。上述方法中，所述SEQ ID NO 1所示蛋白的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。上述方法中，所述出發植物為雙子葉植物。上述方法中，所述雙子葉植物為擬南芥(Arabidopsis thaliana)。上述方法中，所述器官變小為花變小和/或葉片變小。上述方法中，所述花器官變小為花瓣面積變小、花瓣細胞面積變小和/或花瓣細胞的數目減少，所述葉片變小為葉片面積變小、葉片細胞面積變小和/或葉片細胞數目減少。SEQ ID NO 1所示蛋白在使植物器官變小中的應用也屬於本發明的保護範圍。SEQ ID NO :2所示編碼基因在使植物器官變小中的應用也屬於本發明的保護範圍。上述應用中，所述出發植物為雙子葉植物。上述應用中，所述雙子葉植物為擬南芥(Arabidopsis thaliana)。上述應用中，所述器官變小為花變小和/或葉片變小。上述應用中，所述花器官變小為花瓣面積變小、花瓣細胞面積變小和/或花瓣細胞的數目減少，所述葉片變小為葉片面積變小、葉片細胞面積變小和/或葉片細胞數目減
3少。本發明方法可以實現對作物器官的定向控制。通過本發明方法，可以根據實際需要來控制植物器官大小，為改變作物產量、優化改良作物農藝性狀及植物的遺傳育種奠定了堅實基礎，提供了有利工具，具有重要意義。


圖1為轉基因植株的表型。圖2為轉基因植株的PCR鑑定。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例1、使植物器官變小的方法一、RNA提取及反轉錄新鮮的野生型擬南芥(Arabidopsis thaliana) (Col-O)幼苗(萌發後14天)在液氮中研碎。取IOOmg研碎的材料，用植物總RNA提取試劑盒(TIANGEN)提取總RNA。提取完成後，用分光光度計檢測總RNA的濃度。取5 μ g總RNA，用反轉錄試劑盒(INVITR0GEN) 進行反轉錄，得到cDNA。ニ、E0D8編碼基因的獲得以cDNA為模板，用如下引物進行PCR擴增。PCR反應使用高保真DNA聚合酶試劑盒(Τ0Υ0Β0)，PCR延伸時間為2. 5分鐘，32個循環。反應完成後用rhq (TAKALA)加A。E0D8-F :ATGTCGTCGGAGGTGAAACAGE0D8-R TTTATCCCATGAAGCCAGCTCPCR擴增後，DNA瓊脂糖凝膠電泳，得到約2. 5kb的DNA條帶。用凝膠回收試劑盒 (TIANGEN)回收該片段。回收的片段連入T載體pGEM-T (PR0MEGA)中，得到質粒pGEM_E0D8。然後測序(北京擎科生物技術公司)。測序結果標明，該片段大小為2511bp，核苷酸序列如SEQ ID NO 2 所示，是E0D8的編碼序列(⑶S)。該基因編碼的蛋白如SEQ ID NO 1所示.三、植物表達載體構建質粒PGreen-35S 和農桿菌 GV3IOl 均在文獻「 Li，Y. , Zheng, L.，Corke，F. ,Smith, C. , and Bevan, Μ. W. (2008). Control of f final seed and organ size by theDAl gene family in Arabidopsis thaliana. Genes Dev 22，1331-1336」 中公開過，公眾可從中國科
學院遺傳與發育生物學研究所獲得。EcoRI酶切質粒pGEM-E0D8，回收251 Ibp的E0D8編碼序列片段，插入到EcoRI酶切並去磷酸化的質粒pGreen-35S上。然後用HindIII鑑定片段出入方向。正向插入可以切出21Λ和0. 5kb的條帶(不包括骨架條帶)。反向插入可以切出0. 2kp和0. 5kp的條帶 (不包括骨架條帶)。正向插入得到的重組質粒命名為35SpGreen-E0D8_S，用於過表達E0D8。再將質粒35SpGreen-E0D8_S進行測序驗證，結果在pGreen_35S的EcoRI位點間插入的核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。重組質粒中E0D8基因受35S啟動子控制，終止子為CaMV 35S poly-A terminator。將35SpGreen-E0D8-S 導入農桿菌 GV3101，得到含有 35SpGreen-E0D8_S 的農桿菌菌株，將該菌株命名為GV3101-E0D8-S。四、轉基因植株的獲得用GV3101-E0D8-S 農桿菌轉化擬南芥(Arabidopsis thaliana)，以獲得轉 E0D8 基因植株。具體操作如下YEP培養基配製酵母提取物(OXOID) 10g/L，大豆蛋白腖(北京雙旋微生物生物培養基製品廠)10g/L, NaCl 5g/L，其餘為水；調PH值到7. 0。侵染農桿菌菌液製備用YEP培養基28攝氏度搖床培養農桿菌，直到0D600 = 2. 0-3.0。然後，14攝氏度，4000轉離心10分鐘收集菌體，以等體積的懸浮液(0. 5g/L MES, 2. 2g/L MS，5%蔗糖，其餘為水)懸浮菌體，調PH值到5. 7後，加入萬分之三體積的Silwet L-77(LEHLE SEEDS，貨號VIS_02)溶液，混勻後進行浸染(花序在菌液中浸泡2分鐘)。將花序被菌液侵染後的擬南芥植株在溫室中生長，幼苗抽苔IOcm左右時(約生長 4周)，把主莖花絮去棹。二次抽苔(約1周左右)後，用農桿菌侵染正在盛開的花序；侵染條件為遮光密閉M小吋。再將花序被菌液侵染後的擬南芥植株在溫室中生長1個月收種。擬南芥培養條件為長光照(16小時光照)，強度為4000LUX，溫度22攝氏度士 1 攝氏度，溼度60-80%。培養介質為按2 1體積混勻的蛭石和營養土。卡那黴素抗性培養基組成由葡萄糖、卡那黴素和1/2MS固體培養基組成，葡萄糖、卡那黴素和1/2MS固體培養基的配比為IOg葡萄糖50μ g卡那黴素1L 1/2MS固體培
ο所收種子在卡那黴素抗性培養基上篩選得到Tl代轉基因苗。方法為異丙醇表面消毒ι分鐘，10%次氯酸鈉表面消毒10分鐘，無菌雙蒸水衝洗5遍，播種於卡那黴素抗性培養基上，4攝氏度春花3天後置於正常培養間長光照培養，約十天後將抗性苗移栽到蛭石和營養土混合基質中，常規培養，10周左右收種，記為Tl代結的種子。共得到50個株系的Tl 代轉E0D8基因擬南芥。同時轉入空載體pGreen-35S的擬南芥為轉空載體對照。轉E0D8基因擬南芥的鑑定得到的Tl代轉基因植株通過PCR來進ー步鑑定。以新鮮的轉基因植株葉片的基因組DNA為模板，用引物對Atlg22M0CAPS-F/Atlg22540CAPS-R 進行PCR擴增。引物如下Atlg22540CAPS-F GAAAGCCCAATCAACAAAGTGAtlg22540CAPS-R TTCACAGTAGCAGTTGGAACT。檢測結果如圖2所示。轉基因植株可以擴增出兩條帯，一條是基因組DNA中E0D8 基因對應的條帶，一條是轉基因中E0D8基因cDNA對應的條帶。圖中，泳道1_16為轉基因擬南芥，泳道17為野生型擬南芥(Col-O)，泳道18為質粒35SpGreen-E0D8-S。轉空載體對照與野生型對照結果一祥。五、表型鑑定一、方法
得到的轉基因株系在正常條件下培養，期間觀察記錄表型，測量相應參數。花瓣和葉片面積的測量拍照後用Image J軟體測量。細胞學分析首先用透明液(8g水合氯醛，Ilml雙蒸水，Iml甘油)透明花瓣和葉片。透明時間為2天。然後用差相顯微鏡(DIC) (LEICA DM2500)觀察並通過CCD (SPOT FLEX)拍照。最後花瓣的內側表皮細胞和葉子的葉肉細胞被測量和統計。細胞面積測量使用Image J軟體。表達量分析通過real-time PCR(Lightcycler 480，ROCHE)來分析轉基因植株表達量。螢光染料為 Lightcycler 480 SYBR Green | Master (ROCHE)。內參為 ACTIN2。 real-time PCR 弓|物如下Atlg22540CAPS-F GAAAGCCCAATCAACAAAGTGAtlg22540CAPS-R TTCACAGTAGCAGTTGGAACT。ACTIN2F GAAATCACAGCACTTGCACCACTIN2R :AAGCCTTTGATCTTGAGAGC。ニ、結果見圖1。圖IA I為萌發後27天的野生型擬南芥植株(Col-O)，II為萌發後27天的轉E0D8 基因擬南芥植株(35S::E0D8#14)。表明，轉基因擬南芥的葉子明顯比野生型植株小。圖IB 1為萌發後35天的Col_0，II為萌發後35天的35S: :E0D8#14。此時植株均已抽薹，轉基因擬南芥的植株及葉子明顯比野生型植株小。圖IC :1為Col-O的花，II為35S: :E0D8#14的花。表明，轉基因擬南芥的花明顯
比野生型花小。圖ID 第五片葉子面積的測量，I為Col-0, II為35S: :E0D8#14。縱坐標指轉基因株系35S: :E0D8#14相對於Col-O第五片葉子最終面積的百分數；橫坐標指第五片葉子長出來的天數。表明，轉基因擬南芥的第五片葉子明顯比野生型小。圖IE 第5片葉子的葉片細胞大小和細胞數目的測量。縱坐標指轉基因株系 35S::E0D8#14相對於Col-O第五片葉子的葉片細胞大小和細胞數目的百分數；CA，細胞面積；CN，細胞數目。I 指 Col-0，II 指;35S: :E0D8#14。轉基因擬南芥的第5片葉子的葉片細胞面積平均為野生型的30. 94%。轉基因擬南芥的第5片葉子的葉片細胞數目平均為野生型的62. 59%。圖1F-1G =IF為Col-O第5片葉子的葉片細胞；圖IG為35S: :E0D8#14第5片葉子的葉片細胞。圖IH 花參數的測量。縱坐標指轉基因株系相對Col-O的百分比。PA，花瓣面積； CA，花瓣細胞面積；CN in LD，花瓣長向上的細胞數目；CN in WD ；花瓣寬向上的細胞數目。 I為Col-0, II為轉基因擬南芥35S: :E0D8#14, III為轉基因擬南芥35S: :E0D8#6。花瓣長向上的細胞數目的解釋沿花瓣的最長的方向上畫一條直線，該直線經過的細胞的數目。花瓣寬向上的細胞數目的解釋沿花瓣的最寬的方向上畫一條直線，該直線經過的細胞的數目。結果花瓣面積轉基因擬南芥35S: :E0D8#14平均為Col-O的84. 34% ；轉基因擬南芥35S: :E0D8#6 平均為 Col-O 的 80. 29%。花瓣細胞面積轉基因擬南芥35S::E0D8#14平均為Col-O的86. 52% ；轉基因擬南芥 35S: :E0D8#6 平均為 Col-O 的 80. 21%。花瓣長向上的細胞數目轉基因擬南芥35S::E0D8#14平均為Col-O的89. 17% ； 轉基因擬南芥:35S: :E0D8#6平均為Col-O的82. 65%。花瓣寬向上的細胞數目轉基因擬南芥35S::E0D8#14平均為Col-O的94. 38% ； 轉基因擬南芥35S: :E0D8#6平均為為Col-O的90. 21%。圖II :E0D8基因在轉基因植株中的表達量。縱坐標指轉基因株系相對Col-O的百分比。I為Col-0, II為轉基因擬南芥35S: :E0D8#14, III為轉基因擬南芥35S: :E0D8#6。轉空載體對照與野生型對照結果相同。結果表明，過表達E0D8基因使擬南芥整個植株變小，包括花和葉子。而變小的原因是數目的減少和細胞的變小共同作用的結果。
權利要求
1.ー種使植物器官變小的方法，包括如下步驟向出發植物中導入SEQ ID N0:1所示蛋白的編碼基因，得到目的轉基因植物，所述目的轉基因植物的器官小於所述出發植物的器官。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述編碼基因是通過重組表達載體導入的。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於所述重組表達載體是向質粒 pGreen-35S的多克隆位點間插入所述編碼基因得到的。
4.根據權利要求1-3中任一所述的方法，其特徵在於所述多克隆位點為EcoRI酶切位點。
5.根據權利要求1-4中任一所述的方法，其特徵在幹所述SEQID NO :1所示蛋白的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。
6.根據權利要求1-5中任一所述的方法，其特徵在於所述出發植物為雙子葉植物。
7.根據權利要求1-6中任一所述的方法，其特徵在於所述雙子葉植物為擬南芥 (Araoidopsis thaiiana)。
8.根據權利要求1-7中任一所述的方法，其特徵在於所述器官變小為花變小和/或葉片變小。
9.根據權利要求1-8中任一所述的方法，其特徵在於所述花器官變小為花瓣面積變小、花瓣細胞面積變小和/或花瓣細胞的數目減少，所述葉片變小為葉片面積變小、葉片細胞面積變小和/或葉片細胞數目減少。
10.SEQ ID NO :1所示蛋白和/或SEQ ID NO :2所示編碼基因在使植物器官變小中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種使植物器官變小的方法。該方法是向出發植物中導入SEQ IDNO1所示蛋白的編碼基因，得到目的轉基因植物，所述目的轉基因植物的器官小於所述出發植物的器官。本發明方法為改變作物產量、優化改良作物農藝性狀及植物的遺傳育種奠定了堅實基礎，提供了有利工具，具有重要意義。
文檔編號C12N15/63GK102586265SQ20111000170
公開日2012年7月18日 申請日期2011年1月6日 優先權日2011年1月6日
發明者徐冉, 李雲海 申請人:中國科學院遺傳與發育生物學研究所