次卟啉衍生物、其製備方法及注射用凍幹製劑的製作方法

2023-09-16 00:38:55

專利名稱：次卟啉衍生物、其製備方法及注射用凍幹製劑的製作方法
技術領域：
本發明屬醫藥技術領域，具體涉及光動力治癌藥物次卟啉衍生物。
目前國內外臨床使用的光動力治癌藥物血卟啉衍生物(HematoporphyrinDerivative,HpD)和光敏素Ⅱ或卟非姆鈉(Photofrin Ⅱ or Sodium Pofimer)均為組成不定的混合卟啉製劑，其腫瘤光生物活性成分不明確，並含有大量在體內均勻分布和清除緩慢的強光敏化卟啉，如血卟啉、羥乙基乙烯基次卟啉、原卟啉等。其共同缺點是(1)由於組成不定，無法制定製劑質量的控制標準；(2)因有效成分不明而影響光動力療效的穩定性；(3)由於製劑中存在大量在體內緩慢清除的強光敏化卟啉而造成機體正常組織的嚴重光毒反應。上述缺點從製劑質量、療效、及毒副反應三個方面限制了它們作為創新藥物發展的基本前提(許德餘腫瘤光動力療法原理、藥物和臨床應用導論KesselD和Dougherty TJ:Porphyrin Photosensitization.Plenum Press,NewYork,1983；Spinelli P等Photodynamic Therapy and Biomedical Lasers.Amsterdam-London-New York-Tokyo,Excerpta Medica,1992)。
本發明的目的在於提供一種腫瘤光生物活性成分明確、製劑質量易於控制、療效穩定和正常組織光毒副反應相對輕微的光動力治癌藥次卟啉衍生物(DpD)。
本發明的目的還在於提供製備這種次卟啉衍生物的方法。
本發明的進一步目的在於提供注射用次卟啉衍生物鈉凍幹製劑。
本發明的光動力治癌藥物次卟啉衍生物包含組成比例穩定的四種卟啉(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ)的混合物 (Ⅱ)3-或8-甲氧基乙基-(Ⅲ)3,8-二甲氧基乙基次卟啉Ⅸ8-或3-閎乙基次卟啉Ⅸ (Ⅳ)3-或8-甲氧基乙基-8-或3- (Ⅴ)3-或8-羥乙基-8-或3-乙烯基乙烯基次卟啉Ⅸ次卟啉Ⅸ上述四種卟啉的重量比(W/W)為3-或-8甲氧基乙基-8或3-羥乙基次卟啉Ⅸ(Ⅱ)55±5％3,8-二甲氧基乙基次卟啉Ⅸ(Ⅲ)20±3％3-或8-甲氧基乙基-8-或3-乙烯基次卟啉Ⅸ(Ⅳ) 15±2％3-或8-羥乙基-8-或3-乙烯基次卟啉Ⅸ(Ⅴ) 10±2％本發明的次卟啉衍生物製備方法的特徵在於(1)以氯化血紅素為基始原料，在溴化氫飽和冰醋酸溶液中密閉攪拌反應得到中間體3,8-二溴乙基次卟啉(Ⅰ)，該中間體於室溫下與85％甲醇水溶液反應，生成包含血卟啉Ⅸ(Ⅵ)、原卟啉Ⅸ(Ⅶ)、3-或-8甲氧基乙基-8或3-羥乙基次卟啉Ⅸ(Ⅱ)、3,8-二甲氧基乙基次卟啉Ⅸ(Ⅲ)、3-或8-甲氧基乙基-8-或3-乙烯基次卟啉Ⅸ(Ⅳ)和3-或8-羥乙基-8-或3-乙烯基次卟啉Ⅸ(Ⅴ)的次卟啉衍生物粗品； (2)上述次卟啉衍生物粗品經矽膠柱層析分離除去血卟啉及原卟啉，得到如下具有穩定組成的次卟啉衍生物3-或-8甲氧基乙基-8或3-羥乙基次卟啉Ⅸ(Ⅱ)55±5％3,8-二甲氧基乙基次卟啉Ⅸ(Ⅲ)20±3％
3-或8-甲氧基乙基-8-或3-乙烯基次卟啉Ⅸ(Ⅳ)15±2％3-或8-羥乙基-8-或3-乙烯基次卟啉Ⅸ(Ⅴ)10±2％本發明的注射用次卟啉衍生物鈉凍幹製劑由上述次卟啉衍生物溶於稀NaOH溶液後冷凍乾燥而製成。
以下對本發明作詳細描述。
本發明的次卟啉衍生物是由3-或-8(1-甲氧基乙基)-8或3-(1-羥乙基)次卟啉(3-or 8-(1-methoxyethyl)-8-or 3(1-hydroxyethyl)-deuteroporphyrin Ⅰ,55±5％)、3,8-二甲氧基乙基次卟啉(3,8-dimethoxyethyl-deuteroporphyrin Ⅱ,20±3％)、3-或8-(1-甲氧基乙基)-8-或3-乙烯基次卟啉(3-或8-(1-methoxyethyl)-8-或3-vinyl-deuteroporphyrin Ⅲ,15±2％)和3-或8-(1-羥乙基)-8-或3-乙烯基次卟啉(3-或8-(1-hydroxyethyl)-8-or 3-vinyl-deuteroporphyrin Ⅳ,10±2％)所組成。
本發明的次卟啉衍生物製備方法包括以下操作步驟(1)以氯化血紅素為基始原料，在溴化氫飽和冰醋酸溶液中密閉攪拌反應得到中間體3,8-二溴乙基次卟啉(Ⅰ)，該中間體於室溫下與85％甲醇水溶液反應，生成包含血卟啉Ⅸ(Ⅵ)、原卟啉Ⅸ(Ⅶ)、3-或-8甲氧基乙基-8或3-羥乙基次卟啉Ⅸ(Ⅱ)、3,8-二甲氧基乙基次卟啉Ⅸ(Ⅲ)、3-或8-甲氧基乙基-8-或3-乙烯基次卟啉Ⅸ(Ⅳ)和3-或8-羥乙基-8-或3-乙烯基次卟啉Ⅸ(Ⅴ)的次卟啉衍生物粗品； (2)上述次卟啉衍生物粗品經矽膠柱層析分離除去血卟啉及原卟啉，得到如下具有穩定組成的次卟啉衍生物3-或-8甲氧基乙基-8或3-羥乙基次卟啉Ⅸ(Ⅱ)55±5％3,8-二甲氧基乙基次卟啉Ⅸ(Ⅲ)20±3％
3-或8-甲氧基乙基-8-或3-乙烯基次卟啉Ⅸ(Ⅳ)15±2％3-或8-羥乙基-8-或3-乙烯基次卟啉Ⅸ(Ⅴ)10±2％上述步驟(1)中二溴乙基次卟啉(Ⅰ)在冰醋酸溴化氫飽和溶液中的濃度以2.5％為佳，與85％甲醇水溶液反應的體積比為1∶0.5-1∶5，以1∶0.55為佳。
上述步驟(2)中所用矽膠為300目以上的層析矽膠或矽膠H；所用洗脫劑為氯仿/丙酮/甲醇/甲酸(10∶1∶1∶0.1)或氯仿/甲醇/甲酸(10∶1∶0.1)。
．用本發明方法製備的次卟啉衍生物粗品為紫紅色固體，不溶於水，溶於氯仿、四氫呋喃、甲醇等有機溶劑。因其組成分均為卟啉化合物，分子中存在可質子化氮原子和游離羧基，故能與酸或鹼生成水溶性鹽。此外，卟啉化合物具有光敏化作用，對可見光敏感，特別是在有氧條件下，可因自身光動力氧化效應而導致破壞。
本發明的次卟啉衍生物原料藥的質量標準(1)性狀本品為暗紅色、無臭、無味的粉末狀固體。無熔點。易溶於四氫呋喃、氯仿、丙酮、甲醇等有機溶劑，不溶於水。能與強酸、強鹼水溶液作用生成鹽而溶於其中。將本品的強酸或強鹼水溶液調節pH至4-5時，因達到其等電點而從溶液中析出沉澱。
(2)鑑別a．薄層色譜(TCL)分析取矽膠H(粒度10-40μm)10g，加羧甲基纖維素(CMC)鈉水溶液(0.25％)28±1mL，調成糊狀，將其均勻塗布於載玻片上，矽膠厚度為0.25mm，置於水平臺面，自然晾乾後，105℃活化1小時，置乾燥器中備用。
取次卟啉衍生物加甲醇製成濃度為2mg/mL的溶液。用微量注射器或定量毛細管吸取該溶液1-2μL，點於備用的矽膠H薄板上，乾燥後置高效薄層色譜水平展開槽中，以氯仿/甲醇/甲酸(10∶1∶0.1V/V/V)為展開劑，自然或低溫乾燥。薄層板上顯示4個暗紅色班點，b．紫外吸收光譜分析取本品適量，精密稱定，加甲醇配成濃度為2μg/mL的溶液。按照中國藥典1995年版二部附錄18-19頁ⅣA紫外分關光度法測定，在396±1、498±1、532±1569±1621±1nm波長處，應出現特徵吸收峰。在396±1波長處有最大吸收峰。
c．螢光光譜分析取鑑別b項下的溶液適量，用甲醇稀釋，使成濃度為0.1μg/mL本品的溶液，在螢光分光度計上測定。激發光波長為395nm，發射光波長從500-700nm連續掃描。圖譜上除624±1和688±1波長處出現發射螢光峰外，其他波長處不得出現發射螢光峰。
(3)檢查a．乾燥失重取本品0.5g置於已恆種的稱量瓶中，精密稱定後，移至盛五氧化二磷的真空乾燥器中，常溫下避光減壓乾燥至恆重，減失重量不得超過5％。
b．含量測定避光操作。取乾燥本品適量，精密稱定，加甲醇溶解，使成2μg/mL的溶液。按紫外/可見分光光度法(中國藥典1995年版二部附錄18-19頁ⅣA)在3961波長處測定其吸收係數(E1cm1％)為2465計算，即得。
(4)貯藏密閉、避光，於-20℃貯存。
本發明的次卟啉衍生物對腫瘤組織具有選擇性攝入作用，在395-405nm波長光激發下產生桔紅色特徵發射螢光；在氬離子染料雷射或金蒸汽雷射(波長均為630nm)作用下，可敏化產生腫瘤光動力損傷效應而達到治療的目的。可用於惡性腫瘤的螢光定位診斷及光動力治療。亦可用於某些體液內癌細胞的檢測和鮮紅班痣的光動力治療以及用作腫瘤放射治療的增敏劑。
本發明的注射用次卟啉衍生物鈉凍幹製劑規格為100mg/瓶；200mg/瓶。
本發明的注射用次卟啉衍生物鈉凍幹製劑配製方法包括在無菌條件下進行的以下各步操作(1)原料的預處理取乾燥的本品200g置於經過消毒的1L耐酸玻璃濾器中，加新鮮注射用水充分研洗後，抽乾，反覆3-5次。連同濾器一起置於棕色真空乾燥器中，減壓/P2O5乾燥。
(2)次卟啉衍生物的溶解將上述經預處理的200g乾燥本品置於圓底三頸燒瓶中，裝上電動攪拌機，加入用注射用水配製的0.2N NaOH及生理鹽水，攪拌1-2小時使本品成鈉鹽後完全溶解。然後滴加入由注射用水配製的0.2NHCl調節溶液pH至7.2-7.5，所得即為本品鈉鹽中性溶液。
(3)溶液滲透壓的調節上述本品中性水溶液按下式用10％NaCl濃縮注射液調節至溶液中NaCl的濃度為0.9％V1=9V2-58×MeHCl/91
式中V1為調節溶液成等滲所加入的10％NaCl溶液的體積毫升數；V2為溶液調節等滲前的總體積毫升數；MeHCl為調節溶液pH所消耗的0.2N HCl毫克當量數；58為NaCl的分子量。
(4)注射用4％次卟啉鈉凍幹製劑的配製在上述次卟啉衍生物鈉等滲溶液中加入適量甘露醇等凍幹製劑支架物質，並用生理鹽水稀釋，使溶液總體積為5L。然後，經不鏽鋼濾菌器加壓過濾，所得溶液分裝於10mL玻璃安瓿，分裝量為5mL或2.5mL，經冰凍乾燥機減壓抽乾即得次卟啉衍生物鈉注射液凍幹製劑。
注射用次卟啉衍生物鈉凍幹製劑的質量標準本品為次卟啉衍生物鈉無菌注射液凍幹製劑，含次卟啉衍生物鈉應不低於標示量的90％。
(1)性狀本品為玫瑰紅色固體，呈圓柱狀附著於瓶底。
(2)鑑別取本品加10mL蒸餾水使成溶液。在此溶液中加入1N醋酸調節溶液pH至4-5，析出沉澱，放置過夜，濾集析出的沉澱，用蒸餾水洗3次，吸乾，置於棕色真空乾燥器中(P2O5)減壓乾燥後進行下列各項鑑別試驗a、薄層色譜所用測定方法、條件均與原料藥相同。在矽膠H板上展開後，顯示2個暗紅色斑點，其比移值(Rf)分別為0.49±0.03和0.39±0.03。
b、紫外吸收光譜測定取上述乾燥沉澱適量，加甲醇使之溶解並配成8μg/mL的溶液，於紫外分光光度計上測定，其紫外吸收光譜圖上在396±1、498±1、532±1、569±1及621±1nm波長處出現五個吸收峰，其中396±1nm波長處為最大吸收峰。
c、螢光光譜的測定同「b」項操作將本品配成0.1μg/mL的甲醇溶液，於螢光分光度計上測定，其激發螢光的波長為395nm，發射螢光從500-700nm掃描，所得螢光圖譜上除在624±1nm和688±1nm波長處出現兩個特徵發射螢光峰外，不出現其他螢光峰。624±1nm為其最大特徵發射螢光峰。
(3)檢查a、pH值按中國藥典1995版二部附錄Ⅵ pH測定，pH值在7.0-7.8之間。
b、無菌試驗和嵩詞匝榫ψ現洩涔95版二部附錄ⅪD和ⅪH的規定。
c、含量測定取次卟啉衍生物鈉注射液凍幹製劑一支加10mL蒸餾水溶解，用1N醋酸調節pH至4-5，放置過夜，濾集析出的沉澱，並用蒸餾水洗3次，吸乾，置真空乾燥器中減壓乾燥(乾燥劑為五氧化二磷)24小時。精確稱取乾燥沉澱10mg，加甲醇使成2μg/mL溶液，後者在紫外分光光度計上於396±1nm波長處測定其吸收度值。本品E1％1cm為2476±36，由E值計算得的本品含量不得低於標示量的90％。
(4)包裝 100mg/瓶和200mg/瓶，5瓶/盒。
(5)貯藏 避光低溫保存(在半年內使用者在普通冰箱的冷藏室中攝氏5度保存；如擬在半年以後使用者可在普通冰箱冷凍室攝氏-20度保存之。)。
本發明的由四種卟啉組成的次卟啉衍生物鈉凍幹製劑各成分含量比穩定，作為一種新型腫瘤光動力治療藥物，其實驗療效明顯優於目前臨床使用的光動力治癌藥物血卟啉衍生物(HpD)，毒性則顯低於後者。
以下用實施例和實驗例對本發明進行舉例說明，它們旨在闡述本發明的最佳實施方案。本領域技術人員根據本發明的啟示，結合本領域的常識所做的各種變更，均落在本申請權利要求的範圍內。
實施例1關鍵中間體3,8-二(1-溴乙基)次卟啉Ⅸ的製備將溴化氫氣體導入一2L三頸圓底燒瓶，其中裝有乾燥氯化血紅素(含量不低於90％)35g、工業冰醋酸1500mL、對苯二酚3g。通入的乾燥溴化氫氣泡起到自然的攪拌作用，直至飽和(此時可見，溴化氫氣體從反應瓶溢出。)。停止通溴化氫，在室溫下用電磁攪拌器繼續攪拌24小時。所得即為3,8-二溴乙基次卟啉氫溴酸鹽的溴化氫飽和冰醋酸溶液，毋需處理即可直接用於製備次卟啉衍生物。
實施例2次卟啉衍生物粗品的製備將上述3,8-二溴乙基次卟啉氫溴酸鹽的溴化氫飽和冰醋酸溶液按2∶1體積比於攪拌下緩緩滴加至85％甲醇水溶液中，控制反應溫升不超過20℃，加畢繼續攪拌30分鐘。然後加10N NaOH中和至pH 13，放置過夜。上述反應液於室溫下加稀醋酸中和至pH4-5，並加大量水稀釋，放置，待沉澱完全後，濾集析出的沉澱物，用水洗至洗液呈中性，減壓(P2O5)乾燥，得次卟啉衍生物粗品紫紅色固體30-32g(按氯化血紅素重量計收率85-91％)。上述次卟啉粗品經色譜分離得到6種不同的卟啉，後者經波譜測定及合成確認品的對照分析證明其化學結構分別為3-或-8甲氧基乙基-8或3-羥乙基次卟啉(3-or 8-methoxyethyl-8-or 3-hydroxyethyl-deuteroporphyrin Ⅱ)、3,8-二甲氧基乙基次卟啉(3,8-dimethoxyethyl-deuteroporphyrin Ⅲ)、3-或8-甲氧基乙基-8-或3-乙烯基次卟啉(3-Or 8-methoxyethyl-8-or 3-vinyl-deuteroporphyrin Ⅳ)和3-或8-羥乙基-8-或3-乙烯基次卟啉(3-or 8-hydroxyethyl-8-or 3-vinyl-deuteroporphyrin Ⅴ)、血卟啉Ⅸ(Hematoporphyrin Ⅸ,Ⅵ)和原卟啉Ⅸ(Protoporphyrin Ⅸ,Ⅶ)。
次卟啉衍生物的製備反應及各組成分的生成過程如下 上述次卟啉衍生物粗品為紫紅色固體，不溶於水，溶於氯仿、四氫呋喃、甲醇等有機溶劑。因其組成分均為卟啉化合物，分子中存在可質子化氮原子和游離羧基，故能與酸或鹼生成水溶性鹽。此外，卟啉化合物具有光敏化作用，對可見光敏感，特別是在有氧條件下，可因自身光動力氧化效應而導致破壞。
實施例3次卟啉衍生物的分離上述次卟啉衍生物粗品8g與300目層析矽膠24g充分研勻後，置於裝有200g層析矽膠的60×500mm玻璃柱內矽膠的上層，用氯仿/甲醇/甲酸(10∶1∶0.1V/V)混合液作洗脫劑，洗脫液用薄層色譜檢測，收集由3-或-8甲氧基乙基-8或3-羥乙基次卟啉(3-or 8-methoxyethyl-8-or 3-hydroxyethyl-deuteroporphyrin Ⅱ)、3,8-二甲氧基乙基次卟啉(3,8-dimethoxyethyl-deuteroporphyrin Ⅲ)、3-或8-甲氧基乙基-8-或3-乙烯基次卟啉(3-Or 8-methoxyethyl-8-or 3-vinyl-deuteroporphyrin Ⅳ)和3-或8-羥乙基-8-或3-乙烯基次卟啉(3-or 8-hydroxyethyl-8-or 3-vinyl-deuteroporphyrin Ⅴ)組成的次卟啉衍生物。上述Ⅱ-Ⅴ四種卟啉在次卟啉衍生物中所佔的比例分別為50±5％(Ⅱ)；20±3％(Ⅲ)；15±2％(Ⅳ)和15±2％(Ⅴ)。
實施例4 次卟啉衍生物各組成分的鑑定1g次卟啉衍生物固體用10g 300目矽膠H研勻製成色譜分離樣品，將其置於裝有200g矽膠H的玻璃柱的頂層，用氯仿-甲醇-甲酸(10∶1∶0.1V/V/V)作洗脫劑，分別收集相當於HPLC分析保留時間為7.08(A)、8.37(B)、9.99(C)和12.13分鐘(D)的4組流分，減壓蒸除溶劑，並在真空乾燥器中用五氧化二磷減壓乾燥至恆重。所得4種暗紅色固體A、B、C、D的HPLC分析相對峰面積均≥95％。以下為4種組分的波譜測定結果組分A核磁共振氫譜(1H-NMR δ[ppm,(CD3)2SO]:-3.96(s,2H,2×NH),2.16(t,3H,CH(OH)CH3)2.28(t,3H,CH(OCH3)CH3),3.20(m,4H,2×CH2CH2COOH),3.55(s,3H,OCH3),3.59-3.73(alls,12H,4×Ar-CH3),44.36(m,4H,2×CH2CH2COOH),6.17(m,2H,-OH,CH(OCH3)CH3),6.54(m,1H,CH(OH)CH3),10.25-10.76(4H,meso-H),12.31(bs,2H,2×COOH)。
快原子轟擊質譜(FABMS m/z):613(M+1),612(M+),581(M-OCH3)。
紅外吸收光譜(IR KBr,υcm-1):3315,2980,2930,2820,1710,1440,1410,1102,1080。
紫外可見吸收光譜(UV/Visλmax(CH3OH)nm):397(Soret),498,531,569,622。
上述波譜測定結果表明，次卟啉衍生物這一組成分的化學結構為3-或8-(1-羥乙基)-8-或3-(1-甲氧基乙基)次卟啉Ⅸ。
組分B核磁共振氫譜(1H-NMR δ[ppm,(CD3)2SO]:-3.94(s,2H,2×NH),2.16(d,3H,CH(OH)CH3),3.20(m,4H,2×CH2CH2COOH),3.60-3.74(all s,12H,4×Ar-CH3),4.36(t,4H,2×CH2H2COOH),6.19(m,1H,Cis=C-H),6.42(m,1H,Trans=C-H),6.57(m,1H,CH(OH)CH3),8.50(q,1H,=CH-),10.24-10.70(4H,4×meso-H),12.27(bs,2H,2×COOH).
快原子轟擊質譜(FAB MS,m/z):581(M+1),580(M+),563(M-OH)。
紅外吸收光譜(IR,KBr,υcm-1):3315,2930,2880,1710,1450,983,902。
紫外可見吸收光譜(UV/Visλmax(CH3OH)nm):399(Soret)502,537,573,625。
上述波譜分析結果證明，組分B為3-或8-(1-羥乙基)-8-或3-乙烯基次卟啉Ⅸ。
組分C核磁共振氫譜(1H-NMR δ[ppm,(CD3)2SO]:-3.93(s,2H,2×NH),2.19(6H,2×CH(OCH3)CH3),3.22(4H,2×CH2CH2COOH),3.56(s,6H,2×OCH3),3.63-3.72(a11 s,12H,Ar-CH3),4.36(m,4H,2×CH2CH2COOH),6.17(m,2H,2×CH(OCH3)CH3),10.25-10.60(4H,4×meso-H),12.30(bs,2×COOH).
快原子轟擊質譜(FAB MS m/z):627(M+1),626(M+),595(M-CH3O)。
紅外吸收光譜(IR,KBr,υcm-1):3330,2940,2870,1710,1435,1110,1090。
紫外可見吸收光譜(UV/Visλmax(CH3OH)nm):397.5(Soret),498,532,569,522。
上述波譜分析結果表明，組分C為3,8-二(1-甲氧乙基)-次卟啉。
組分D核磁共振氫譜(1H-NMR δ[ppm,(CD3)2SO]:-3.95(bs,2H,2×NH),2.23(d,3H,CH(OCH3)CH3),3.17(4H,2×CH2CH2COOH),3.54-3.72(all s,15H,OCH3,4×Ar-CH3),4.25(m,4H,2×CH2CH2COOH),6.18(q,1H,Cis=C-H),6.41(q,1H,Trans=C-H),8.47(q,1H,=CH),10.23-10.60(4H,4×meso-H),12.20(bs,2H,2×COOH)。
快原子轟擊質譜(FAB MS m/z):595(M+1),594(M+),563(M-OCH3)。
紅外吸收光譜(IR,KBr,υcm-1):3320,2925,1718,1445,1105,980,902。
紫外可見吸收光譜(UV/Visλmax(CH3OH)nm):399(Soret),502,536,572,625。
上述波譜分析結果表明組分D為3-或8-(1-甲氧基乙基)-8-或3-乙烯基-次卟啉Ⅸ。
實施例5次卟啉鈉注射劑凍幹製劑的製備以下各步均在無菌條件下進行操作。
(1)原料的預處理取乾燥的本品200g置於經過消毒的1L耐酸玻璃濾器中，加新鮮注射用水充分研洗後，抽乾，反覆3-5次。連同濾器一起置於棕色真空乾燥器中，減壓/P2O5乾燥。
(2)次卟啉衍生物的溶解將上述經預處理的200g乾燥本品置於圓底三頸燒瓶中，裝上電動攪拌機，加入用注射用水配製的0.2N NaOH及生理鹽水，攪拌1-2小時使本品成鈉鹽後完全溶解。然後滴加入由注射用水配製的0.2NHCl調節溶液pH至7.2-7.5，所得即為本品鈉鹽中性溶液。
(3)溶液滲透壓的調節上述本品中性水溶液按下式用10％NaCl濃縮注射液調節至溶液中NaCl的濃度為0.9％V1=9V2-58×MeHCl/91式中V1為調節溶液成等滲所加入的10％NaCl溶液的體積毫升數；V2為溶液調節等滲前的總體積毫升數；MeHCl為調節溶液pH所消耗的0.2N HCl毫克當量數；58為NaCl的分子量。
(4)4％次卟啉鈉注射液凍幹製劑的配製在上述次卟啉衍生物鈉等滲溶液中加入適量甘露醇等凍幹製劑支架物質，並用生理鹽水稀釋，使溶液總體積為5L。然後，經不鏽鋼濾菌器加壓過濾，所得溶液分裝於10mL玻璃安瓿，分裝量為5mL或2.5mL，經冰凍乾燥機減壓抽乾即得次卟啉衍生物鈉注射液凍幹製劑。
實驗例1次卟啉衍生物鈉在重水中對NADPH光氧化作用的敏化效應分別取1mL含2×10-7mol/L NADPH的磷酸鹽緩衝溶液(0.01mol/L)5份，依次加入不同量的待測樣品，使成濃度分別為8.80、13.20、19.79、29.69和44.54×10-6mol/L。混合後置於光徑1cm的比色杯中，以氦氖雷射水平輻照10分鐘，光劑量為0.679J/cm2。照畢後分別於340nm處測定輻照後溶液中NADPH的殘存量。用不含NADPH而含等體積同濃度試樣的磷酸鹽緩衝液作空白，以未照光的NADPH緩衝液(不含樣品而含與試樣等量的水)做對照，根據測定結果計算不同濃度樣品的NADPH殘餘百分數，取3次測定平均值。結果見下表。
表1次卟啉衍生物(DpD)的光敏化效應
表1結果表明，次卟啉衍生物(DpD)具有比目前臨床應用的光動力治癌藥物血卟啉衍生物(HpD)更強的光敏化效應。
實驗例2次卟啉衍生物對體外培養人癌細胞的光滅活作用人宮頸癌細胞Hela株用RPMI 1640完全培養液(含15％小牛血清)在37℃、5％CO2的孵箱內傳代培養，獲得生長良好的單層上皮樣細胞。用胰酶-EDTA混合液消化製備單細胞懸液，然後接種於40#(6×8mm)平底塑料測定板孔內，每孔200μL，含5×104個細胞。
培養24-36小時後，棄去舊培養液。避光下加入用不含血清培養液配製的試樣100μL，置孵箱內繼續培養1小時後，棄去藥液，並用Hank’s液清洗兩遍，再加含血清的培養液200μL。上述培養板用氬雷射輻照3分鐘，平均光劑量為4.28±0.15J/cm2。測定後的培養板在孵箱中培養24小時。最後將測定板浸入2.5％結晶紫溶液中染色10分鐘，取出，經流水衝洗後於37℃乾燥。比色前每孔加33％醋酸100μL脫色，然後用酶聯檢測儀於577nm處測定其光密度。試樣及對照藥物分別設7組不同濃度，每組4孔。實驗設空白、單照光和單給藥三個對照組。取3次實驗平均值，求出50％光滅活濃度(IC50)、95％置信限(95％CL)及回歸方程，結果如表2。
表2 DpD對體外培養人宮頸癌Hela細胞的光滅活作用
表2所列數據表明，次卟啉衍生物對體外培養人癌細胞的光滅活作用明顯較血卟啉衍生物為強。
實驗例3次卟啉衍生物對動物移植瘤的光動力治療效果無菌條件下於昆明株小鼠前胸皮下新鮮分離的S-180肉瘤小塊，待腫瘤生長至直徑4-6mm時，選取生長良好的實驗鼠按文獻方法進行雷射光動力治療。結果見表3。
表3次卟啉衍生物對小鼠S-180肉瘤的光動力治療效果
*治癒動物數/試驗動物數表3所列數據表明，DpD對小鼠S-180肉瘤的光動力治療效果至少不低於國外的第二代產品光敏素Ⅱ或卟非姆鈉(Photofrin Ⅱ,Sodium Pofimer)。
實驗例4次卟啉衍生物的急性毒性試驗4周齡昆明株小鼠雌雄各半，體重18.9±0.07g(X±SD)，按常規測定靜脈注射DpD的半數致死劑量(LD50)。以Finney計算，並以HpD作平行對照。結果見表4。
表4次卟啉衍生物急性毒性小鼠半數致死劑量
表4數據表明，DpD的急性毒性明顯低於目前臨床應用的HpD。
實驗例5 犬近似致死劑量(ALD)和最小致死劑量(MLD)的測定雜種犬18條，體重12.5±0.9kg(X±SD)，先按Deichmann LeBlanc法用6條犬測定DpD的ALD及MLD。然後用12條犬分4組分別給予1.0、0.5及0.25ALD(分別為120、60及30mg/kg)，對照組i.v.生理鹽水，於避光條件下觀察14天。
DpD的ALD為114mg/kg，實驗犬未死亡；MLD為171mg/kg，實驗犬於30h後死於呼吸衰竭。
權利要求
1．次卟啉衍生物，包含組成比例穩定的四種卟啉(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ)的混合物(Ⅱ)3-或8-甲氧基乙基- (Ⅲ)3,8-二甲氧基乙基次卟啉Ⅸ8-或3-羥乙基次卟啉Ⅸ (Ⅳ)3-或8-甲氧基乙基-8-或3- (Ⅴ)3-或8-羥乙基-8-或3-乙烯基乙烯基次卟啉Ⅸ 次卟啉Ⅸ上述四種卟啉的重量比(W/W)為3-或-8甲氧基乙基-8或3-羥乙基次卟啉Ⅸ(Ⅱ)55±5％3,8-二甲氧基乙基次卟啉Ⅸ(Ⅲ)20±3％3-或8-甲氧基乙基-8-或3-乙烯基次卟啉Ⅸ(Ⅳ) 15±2％3-或8-羥乙基-8-或3-乙烯基次卟啉Ⅸ(Ⅴ) 10±2％
2．權利要求1所述次卟啉衍生物的製備方法，其特徵在於(1)以氯化血紅素為基始原料，在溴化氫飽和冰醋酸溶液中密閉攪拌反應得到中間體3,8-二溴乙基次卟啉(Ⅰ)，該中間體於室溫下與85％甲醇水溶液反應，生成包含血卟啉Ⅸ(Ⅵ)、原卟啉Ⅸ(Ⅶ)、3-或-8甲氧基乙基-8或3-羥乙基次卟啉Ⅸ(Ⅱ)、3,8-二甲氧基乙基次卟啉Ⅸ(Ⅲ)、3-或8-甲氧基乙基-8-或3-乙烯基次卟啉Ⅸ(Ⅳ)和3-或8-羥乙基-8-或3-乙烯基次卟啉Ⅸ(Ⅴ)的次卟啉衍生物粗品； (2)上述次卟啉衍生物粗品經矽膠柱層析分離除去血卟啉及原卟啉，得到如下具有穩定組成的次卟啉衍生物3-或-8甲氧基乙基-8或3-羥乙基次卟啉Ⅸ(Ⅱ )55±5％3,8-二甲氧基乙基次卟啉Ⅸ(Ⅲ) 20±3％3-或8-甲氧基乙基-8-或3-乙烯基次卟啉Ⅸ(Ⅳ)15±2％3-或8-羥乙基-8-或3-乙烯基次卟啉Ⅸ(Ⅴ)10±2％
3．如權利要求2所述的方法，其中步驟(1)中二溴乙基次卟啉(Ⅰ)在冰醋酸溴化氫飽和溶液中的濃度為2.5％，與85％甲醇水溶液反應的體積比為1∶0.5-1∶5。
4．如權利要求3所述的方法，其中2.5％二溴乙基次卟啉(Ⅰ)與85％甲醇水溶液反應的體積比為1∶0.55。
5．如權利要求2所述的方法，其中步驟(2)中所用矽膠為300目以上層析矽膠或矽膠H；所用洗脫劑為氯仿/丙酮/甲醇/甲酸(10∶1∶1∶0.1)或氯仿/甲醇/甲酸(10∶1∶0.1)。
6．注射用次卟啉衍生物鈉凍幹製劑，由權利要求5所述次卟啉衍生物溶於稀NaOH溶液後冷凍乾燥而製成。
7．注射用次卟啉衍生物鈉凍幹製劑的製備方法，其特徵在於將次卟啉衍生物經注射用水反覆攪洗、減壓乾燥後，按靜脈注射用無菌製劑配製要求用過量稀NaOH使之完全溶解，在溶液中加入稀鹽酸調節溶液pH至7-7.5，所得次卟啉中性溶液加生理鹽水及支架物質配製成4％溶液，濾菌後定量分裝於玻璃瓶，在冰凍乾燥機上減壓抽乾。
8．如權利要求7所述方法，其中次卟啉固體與過量氫氧化鈉反應的條件是使溶液pH保持在12以上，並在攪拌1小時後放置過夜。
9．如權利要求7所述方法，其中支架物質為甘露醇，NaOH和稀鹽酸濃度為0.1N。
10．光動力治癌藥物，包括有效量的權利要求6所述的注射用次卟啉衍生物鈉凍幹製劑。
全文摘要
將氯化血紅素經溴化氫加成得到中間體3,8－二溴乙基次卟啉Ⅸ(Ⅰ),(Ⅰ)在控制條件下與甲醇/水混合物反應,所得產物經矽膠色譜分離得到如下次卟啉衍生物,其組成(W/W)為:3－或8－甲氧基乙基－8或3－羥乙基次卟啉Ⅸ(Ⅱ)55±5%3,8－二甲氧基乙基次卟啉Ⅸ(Ⅲ)20±3%;3－或8－甲氧基乙基－8－或3－7烯基次卟啉Ⅸ(Ⅳ)15±2%;3－或8－羥乙基－8－或3－乙烯基次卟啉Ⅸ(Ⅴ)10±2%;所述四種卟啉組成的次卟啉衍生物鈉凍幹製劑各成分含量比穩定,作為一種新型腫瘤光動力治療藥物,其實驗療效明顯優於目前臨床使用的光動力治癌藥物血卟啉衍生物(HpD),毒性明顯低於後者。
文檔編號A61K9/19GK1311186SQ0011173
公開日2001年9月5日 申請日期2000年2月28日 優先權日2000年2月28日
發明者許德餘 申請人:上海復旦張江生物醫藥有限公司