尤其可用於組織填補和瘢痕形成的可植入製劑的製作方法

2023-09-15 23:02:55 1

專利名稱：尤其可用於組織填補和瘢痕形成的可植入製劑的製作方法
尤其可用於組織填補和瘢痕形成的可植入製劑
本發明的目標在於提供新的可植入或可注射的製劑，所述製劑包含與不含珠蛋白的醫學裝置或醫學產品以任何比例相聯合的珠蛋白。該珠蛋白可以例如是在最終產品中在數量上佔少數的組分。這些製劑可以尤其以粉劑、敷料、糊劑、凝膠劑、可注射懸浮液或溶液或者可植入固體材料的形式存在，其尤其用於填補或修復組織、皮膚、結締、脈管、內臟或骨的缺損，並且通常用於保護或填補傷口和參與其瘢痕
形成(cicatrisation)。目前，由合成或天然聚合物構成的不含珠蛋
途。本發明的主要目標在於通過促進其細胞集落化(colonisation)、協調的組織整合和其吸除("sorption)來改善其生物相容性。
最近，基於在生理條件下的中性pH下不可溶的珠蛋白，描述了新的材料和新的醫學用途，它們成為源自以編號FR-A-2 854 801公開的專利FR 03 05700的一系列專利的目標。這些材料包含在中性pH下不可溶的珠蛋白作為主要活性組分。
珠蛋白是構成血紅蛋白的蛋白質，血紅蛋白本身包含4條肽鏈(2條a鏈和2條P鏈)，每條肽鏈結合一個血紅素。血紅素由含有l個帶正電荷的鐵原子的四吡咯結構組成。每個分子有4個血紅素，其是血紅蛋白呈紅色的原因。
很久以來，製備珠蛋白的方法就已為人所知，並且得到發展以用於食品應用目的或用於製備可注射的藥物溶液。
與在生理pH下極為可溶的血紅蛋白相反，珠蛋白在同樣的條件下顯著地不可溶。
一種將酸性的珠蛋白可溶性製劑與胰島素相聯合的可注射產品已得到開發、獲得專利和商業化REINER (1939); REINER等人(1939)。其使得能夠在注射之後，從該複合物中逐步地釋放出胰島素RABINOWITCH等人(1947); BERG等人(1953)。構成該製劑的珠蛋白沒有經過化學修飾；它在生理pH下是不可溶的，以低濃度存在，並且它既不是該產品的活性成分，也不是該產品的主要成分。
在我們看來，能夠製備複合生物材料是令人感興趣的，所述複合生物材料通過將可溶或不可溶的珠蛋白摻入已經用作或可能成為醫學裝置的聚合物材料之內來製備。甚至以小的數量比例，珠蛋白的存在也可以改善這些醫學裝置的生物學性質，特別是其生物相容性、其細胞和組織的整合以及其吸除。
本發明試圖提供在有機體中可植入的新型材料和製劑，其包含在生理pH下不可溶的天然或經修飾的珠蛋白，或經化學修飾從而在此類條件下可溶的珠蛋白。這些植入物不具有不含珠蛋白的目前材料的缺點或限制。
本發明尤其涉及可植入在有機體組織之上或之中的無菌製劑，其包含
-在生理pH下不可溶的天然或經修飾的珠蛋白的材料和/或能夠由經修飾從而在生理pH下可溶的珠蛋白獲得的材料，所述材料在有機體中是生物相容的和生物可降解的，
-選自下列的試劑合成或天然的粘合性聚合物試劑，組織填補(comblement)或增補(augmentation)聚合物試劑，尤其是基於交聯透明質酸、聚乳酸或其他有機或無機聚合物的試劑，和傷口瘢痕形成聚合物試劑，即氧化纖維素，
-條件是，如果所述製劑包含所述能夠由經修飾從而至少部分可溶的珠蛋白獲得的材料，那麼所述粘合性聚合物試劑，如果存在的話，不是透明質酸或羧甲基纖維素，所述填補或增補聚合物試劑，如果存在的話，是基於交聯透明質酸的試劑；以及如果所述製劑包含氧化纖維素，那麼氧化纖維素以高於所述珠蛋白材料的比例存在，所述珠蛋白材料在這種情況下為在生理pH下不可溶的天然或經修飾的珠蛋白的材料。
"不可溶的經修飾的珠蛋白，，是指在生理pH下天然不可溶的珠蛋白，其通過添加具有疏水特性的分子而被修飾，例如通過用脂肪醇進行酯化。
優選地，粘合性聚合物試劑為基於至少下列物質之一的試劑纖維蛋白原、白蛋白、聚乙二醇的粘合性且生物相容的衍生物、或者粘合性且生物相容的丙烯酸類聚合物或氰基丙烯酸類聚合物。
"透明質酸"尤其是指從細菌或者從人組織(例如，胎盤臍帶(cordon placentaire))或動物組織(例如，公雞的肉冠)中提取的粘多糖。
"交聯透明質酸，，尤其是指商業化的用於組織增補的可注射產品，例如Restylane⑧、Hylaform⑧、Juvederm⑧、Puragen Plus⑧。作為
例子，透明質酸鏈的交聯可以通過酯化反應的各種活化劑來實現，例如碳二亞胺類，如在專利US 6， 943， 153中描述的那些，其允許羧基官
能團與透明質酸的伯醇官能團發生反應。用於使多糖交聯的其他熟知的試劑為二環氧化合物，例如1-4 丁二醇-二縮水甘油醚，其在鹼性
pH下與多糖的醇官能團發生反應。表氯醇也是熟知用於在鹼性PH下使多糖交聯的試劑。尤其是在專利US 5， 234，991中提及了此類例子。"聚乳酸"指任何主要由單體例如乳酸構成的聚合物，根據現有技術，所述單體能夠在其他單體例如乙醇酸存在下聚合，以便調節其在有機體內的降解時間。
在根據本發明的製劑中，在生理PH下不可溶的天然或經修飾的珠蛋白和/或能夠由經修飾(尤其是經化學修飾)從而在生理pH下可溶的珠蛋白獲得的可溶或不可溶的材料，例如可溶的經修飾的該珠蛋白本身，即使相對於所聯合的聚合物試劑而言在數量上佔少數，仍優選地構成了主要活性試劑，其改善粘合試劑或者填補或增補試劑或者瘢痕形成試劑的生物相容性、細胞集落化或組織整合，而通常，所述所聯合的聚合物試劑在這些方面只具有較小的優良品質，或者甚至不存在優良品質，而主要具有粘合、填充或增補、或者保護的功能。正如情形通常如此，當所述合成或天然的粘合性聚合物試劑，所述組織填補或增補聚合物試劑，尤其是基於交聯透明質酸、聚乳酸或其他有機或無機聚合物的試劑，或者所述傷口瘢痕形成聚合物試劑，即氧化纖維素，具有強的炎症能力時，根據本發明的製劑使得能夠在被注射或植入的物料中提供弱或無炎症的區域，從而導致產生前述的好處。
根據所尋求的效果，在生理pH下不可溶的天然或經修飾的珠蛋白的材料和/或能夠由經修飾從而在生理pH下至少部分可溶的珠蛋白荻得的材料相對於該材料加上聚合物試劑這一整體而言的比例以重量計可以等於或大於50%。例如，人們可能更喜歡減少昂貴的粘合性聚合物(例如，纖維蛋白原或白蛋白)的含量，但不損害所述製劑的粘合性質。
然而，最為經常地，人們更喜歡該比例等於或小於50%,例如小於25%或甚至10%，以便獲得這樣的製劑，其中所述材料在改善生物相容性、細胞集落化或組織整合方面發揮其作用，但不大量地稀釋所聯合的聚合物試劑。例如，優選地，包含佔優勢量的氧化纖維素或交聯透明質酸或聚乳酸的製劑就將是這種情況。
例如，在根據本發明的瘢痕形成製劑(其含有佔多數比例的氧化纖維素)中，氧化纖維素確保其通常的瘢痕形成功能，而珠蛋白組分或衍生物確保上文提到的功能，但此外還能夠，根據其存在的量，發揮固有的瘢痕形成作用，正如例如在專利申請FRA 2 854 801中那樣。
同樣地，在填補製劑中，該組分此外還能夠，根據其存在的量，發揮固有的填補作用，正如在前述法國專利申請中所描述的那樣。
"生理pH，，尤其是指6至8的pH，優選地6. 5至7. 5的pH，和更優選地生理pH的範圍。"可植入的，，是指能夠被植入或被注射在有機體之中或之上，在組織中或與組織接觸，包括在皮膚上或在外部傷口上，血管內施用除外。這必須以這樣的可能性為前提，即對它們進行滅菌，或者以無菌形式直接製備它們。
滅菌可以尤其通過5至30k戈瑞(Gray )的P或Y輻射來獲得。該輻射可以在環境溫度下進行，或者對於某些不穩定的產品，以在千冰存在下經冷凍的形式進行。當珠蛋白為不可溶時，可以進行高壓滅
菌，尤其是在120'C下。在一個實施方案中，所述材料由未經化學修飾的不可溶的天然珠蛋白構成或從其獲得。當然，天然珠蛋白的概念包括通過合成或基因
重組獲得的等價的珠蛋白。此類製劑在前述專利申請FR 0305700中已作了描述。
在另一個實施方案中，所述材料獲自經修飾從而在生理pH下可溶的珠蛋白，此溶解性可以是完全的或部分的。此類製劑已在於2005年8月5曰提交的法國專利申請FR 05 08392和於2006年8月2曰提交的還未^S開的專利申請PCT FR2006/001880中作了描述，它們的內容通過提及而合併入本文。
在另一個實施方案中，所述材料可以獲自可溶的經修飾的珠蛋白和在生理pH下不可溶的珠蛋白。此類製劑已在前述專利申請FR 0508392中作了描述。
這些珠蛋白的可溶或不可溶的可植入製劑尤其為糊劑或凝膠劑，固體材料例如粉劑、顆粒劑、敷料或膜劑的形式。它們在生理液體中
是可溶的或不可溶的，或者在可溶性珠蛋白的化學交聯後變為不可溶的。它們可以是可注射的。"可注射的"是指能夠被注射以實施局部植入的性質，任何靜脈內或動脈內注射除外，其是明確禁忌的。
優選地，為了變為在生理pH下可溶，通過鹼處理(尤其是使用氫氧化鈉)，和/或通過羧基官能團的酯化，和/或通過乙醯化或琥珀醯化(珠蛋白的胺官能團對於所述乙醯化或琥珀醯化是敏感的)來對珠蛋白進行化學修飾。此外，所述珠蛋白還可以通過部分化學反應，或者較短時間的或低於1N濃度的鹼溫育而變為部分可溶的。作為例子，可以在環境溫度下使用濃度為0. 1至1N的NaOH進行氫氧化鈉處理4至24小時。當增加氫氧化鈉或其他鹼性鹼的濃度時，可以減少溫育時間或/和溫度。此類珠蛋白處理已在專利FR 05 08392中作了描述。在一個實施方案中，所述珠蛋白材料在生理pH下明顯地可溶。相反地，在另一個實施方案中，所述珠蛋白材料在生理pH下明顯地不可溶，當其從不可溶的天然或經修飾的珠蛋白製備或者通過使經修飾的可溶性珠蛋白交聯而獲得時。所述製劑可以以懸浮液、糊劑、溶液或凝膠劑(優選地，具有足夠的流動性以便是可注射的)的形式存在。
所述製劑可以包含不可溶的或者經修飾從而在生理pH下可溶的珠蛋白的粉末。
可以將所述珠蛋白製劑混合入或添加入合成或天然的粘合性聚合物試劑中，最終的混合物可以形成用於有機體組織的粘合膠。優選地，所述粘合性聚合物試劑為所述膠製劑試劑盒的液體組分，其包含未聚合的單體或未交聯的聚合物。不建議將珠蛋白與交聯組分或聚合引發劑相混合，因為所述交聯組分或聚合引發劑將被珠蛋白消耗並變成對於膠的凝結而言無活性。所述粘合性聚合物試劑本身可以為粉劑的形式(整體可以配製成噴霧劑或氣霧劑的形式)，並且在液體介質尤其是生理液體存在下形成膠。
根據本發明的製劑可以為一體式的形式，優選地為即用型。然而，所述試劑也可以為兩種或多種用於相聯合或相混合的組分的形式，例如藉助於試劑盒，優選地以無菌的形式。
該新型產品家族的好處尤其在於，可將它們與可溶或不可溶的蛋白質生物材料隨意組合，所述蛋白質生物材料從與其注射處的周圍組織完全生物相容的、同源或自體的、純的確定蛋白質製備。由此可以在被植入的粘合性物料內獲得細胞可接近的生物可吸除的網格，它削弱和減小植入物的可能的炎症特性，促進植入物中的組織再生、其在相鄰組織中的協調的整合以及其吸除。
在天然的粘合性聚合物中間，纖維蛋白原已被用於各種內科學和外科學應用。因而，可以例如以新的方式將基於血漿纖維蛋白原的膠，即所謂的纖維蛋白膠，例如Tisseel 、 Tissucol 、 Quixil 、Hemasea1⑧、Beriplast⑧等，與粘合性或非粘合性的、可溶或不可溶的珠蛋白的材料相聯合。
這些基於纖維蛋白原的膠已尤其由Immuno公司在80年代(專利US 4， 298， 598和4， 362， 567 )作了描述，或更近期由Omrix公司(專利US 6, 019, 993 )作了描述。與珠蛋白聯合是一個新的機會，它使得能夠合理利用血液蛋白質，並且能夠有助於避免其浪費、減小所需的 劑量、改善其性能和增加其應用。因此，根據本發明的這些外科學膠 包含優選地低於常規含量的基於纖維蛋白原的材料，和可溶或不可溶 的材料，所述可溶或不可溶的材料根據本發明可以獲自可溶的經修飾 的珠蛋白或不可溶的天然或經修飾的珠蛋白。
在天然的粘合性聚合物中間，白蛋白已被用於各種內科學和外科 學應用。因而，可以例如以新的方式將這些基於白蛋白的膠與可溶或
不可溶的珠蛋白相聯合。作為基於白蛋白的膠的例子，可提及來自N. Kowanko的工作(US專利5385606 )的Bioglue⑧膠，其由Cryolife 公司銷售。其他相近的產品在下列專利申請中作了描述H. Goldmann, J. Wegmann，PCT/EP02/11880; T. H. Barrows, T. W. Lewis, M. T. Truong， PCT/US95/07947。
在合成的粘合性聚合物中間，作為例子，聚乙二醇的衍生物或者 丙烯酸類聚合物或氰基丙烯酸類聚合物已被用於各種內科學和外科學 應用。因而，可以例如以新的方式將這些合成膠的單體組分與可'溶或 不可溶的珠蛋白相聯合，以改善其生物相容性和組織整合併促進其吸 除。在商業化的合成生物膠中間，作為非限制性的例子，我們可以提 及基於聚乙二醇的反應性衍生物的膠，例如由Cohesion 〃>司在專利 US5874500 、 US6166130 、 US6323278 、 US6624245基礎上開發的 Coseal⑧；或者由Confluent Surgical公司開發的Duraseal⑧；源自 專利US 5986043的產品；由Focal公司從各種不同的專利(包括專利 US 5410016和5573934 )開始而開發出的產品FocalSeal 。在基於丙 烯酸類單體的膠中間，作為非限制性的例子，可提及由LoctUe公司 開發並由Kendall公司銷售的產品Indermil ;由Closure Medical z厶司開發並由Ethicon乂^司銷售的產品Dermabond 。許多其他膠源自 合成或天然的聚合物，包括例如纖維素衍生物，和其他專利申請或專 利，其中包括EP0488629、 EP0310919、 US36術41。
同源的人珠蛋白比異源的動物珠蛋白更好，這使得能夠最佳地避 免在植入期間或植入之後該接受治療的患者的任何免疫反應。從人紅細胞或血液開始純化珠蛋白是容易的。可從在輸血中心儲 備中剩餘的過期捐獻之中大量獲得人紅細胞，而且在抽血時對其進行 了所有預先的衛生防疫測試。因此，可植入的珠蛋白的製劑或者基於
醫學應用的新途徑，它們使得能夠重新利用未使用的血液或過期的血 液捐獻並且避免或減少其破壞。與其他蛋白質(其中包括膠原)不同， 珠蛋白具有儘管經歷長時間的鹼處理或/和經歷輻射滅菌仍保留其特 徵的獨特性。這一點有助於其完全安全地進行使用，這是由於能夠保 證有效滅活在任何生物來源的產品中可能存在的傳染性或傳播性因 子。
本發明的實施也可能如此開始來進行，從待治療的患者中抽取血
液樣品(例如，約20至200 ml),並用與對於大體積所用的相同的 方法將其轉化為自體珠蛋白，然後將其轉化為用於本發明的可植入生 物材料。
本發明的實施可能首先需要通過簡單且已知的操作，例如根據下 面的方法，收集和純化在這些血液樣品或血液液體中的紅細胞。
通過低速離心來回收紅細胞。分離血漿上清液並用含有9 g/1 NaCl的生理鹽水來替代。如此，在多次(3至5次)洗滌後，紅細胞 懸浮液被清除了血漿蛋白質。向經純化的紅細胞粒狀沉澱中添加1或 2體積的蒸餾水以進行滲透壓休克，這導致紅細胞膜裂解並以濃縮和 純化的溶液形式釋放出血紅蛋白。高速離心步驟(10至20, 000 rpm) 使得能夠除去該粒狀沉澱中的膜和細胞的碎片。在孔隙度為0. 2微米 的膜上過濾上清液的最後步驟使得能夠製備無菌的經純化的血紅蛋白 溶液，其不含組織、細胞或膜來源的顆粒和衍生物。
因此，關於紅細胞溶解步驟，紅細胞可以是經純化的，以便從已 經與血漿組分相分開的經純化的血紅蛋白溶液開始。但也可以取消該 步驟，尤其是由於珠蛋白在中性pH的水溶液中不溶這一特殊性質，該 性質區分開珠蛋白與其他血漿蛋白質並且使得能夠分離出珠蛋白。
在酸性pH下的血紅素-珠蛋白切割已早在1898年由SCHULZ在醇存在下作了描述。ANSON和MIRSKY在1930年，然後ROSSI-FANELLI 等人在1958年，於(TC在酸存在下使用丙酮。TEALE ( 1959 )更喜歡 使用甲基.乙基酮來代替丙酮。AUTIO等人(1984 )藉助於用可溶性羧 甲基纖維素來吸收和沉澱血紅素，在酸性pH下分離出了珠蛋白。如此 製備的珠蛋白在酸性或鹼性pH下是可溶的，但是一旦將水溶液的pH 中和至pH6和8之間時就變得不可溶。由於這個特殊的性質，因而有 可能在中性pH的水溶液中進行珠蛋白的選擇性沉澱，優選在低鹽濃度 存在下，例如接近5 g/l的氯化鈉，即這樣的條件，在該條件下其他 血漿蛋白質可溶，不與珠蛋白共沉澱，並且被分離在上清液中。當希 望避免預先將紅細胞與血漿分開時，該方法是有用的，這允許一旦抽 取血液就對其進行冷凍。
在這種情況下，對血液進行血細胞溶解，優選地通過下列方式來 進行進行冷凍，隨後進行解凍，其後通過合適的試劑例如丙酮來解 離並除去血紅素，中和處於液體形式的包含珠蛋白和其他蛋白質的級 分，從而使得珠蛋白沉澱並且至少部分地與血液的其他蛋白質組分相 分開。
例如，在患者中抽取人血液，並在抗凝劑例如檸檬酸鈉或肝素存 在下於搖動下進行收集。立即冷凍所述血樣。在解凍後，向血液中添 加蒸餾水以完成血細胞溶解，接著優選地通過過濾或離心來澄清血液。
在環境溫度下，在攪拌下，將經澄清的血液溶液倒入約IO體積的經酸 化的丙酮中。通過在多孔網狀織物(toile)上過濾來除去含有溶解的 血紅素的丙酮。在該網狀織物上用無水丙酮洗滌血漿蛋白質和脫色的 珠蛋白的沉澱，並在脫水後回收。然後，將沉澱重新溶解在添加有NaCl 的水溶液中。在多孔膜上過濾使得能夠除去不可溶的變性的血漿雜質。 然後，中和所得的濾液，從而珠蛋白大量地沉澱出來，同時讓可溶的 血漿蛋白質留在上清液中。在濾網(toile de nitration)上用生理 溶液洗滌經純化的中性珠蛋白沉澱。該方法的簡易性可使其成為可自 動化的，這使得能夠快速且經濟地製備同源或自體的珠蛋白。
令人驚奇地，如此可以獲得濃縮的且特別是流動的微白色的珠蛋本發明還涉及根據本發明的製劑在製備在有機體中可植入或可注 射的製劑中的用途。
根據本發明的用途使得能夠，尤其是改善存在於所述製劑中的粘 合性試劑、或者填補或增補試劑、或者瘢痕形成試劑的生物相容性、 細胞集落化或組織整合或者吸除。
因此，所述用途可以尤其旨在製備用於下列情況的粘合性製劑 -外部皮膚傷口或內部外科手術傷口的瘢痕形成、保護或填補， -皺紋和皮膚缺損的填補，
-結締組織或括約肌的填補，對於在泌尿學(兒童的膀胱-輸尿管 反流，婦女的壓力性尿失禁)、耳鼻喉科(聲帶體積的校正)中的應 用，
-用於組織傷口或經皮動脈傷口的粘合性止血栓子，
-在受者組織上固定假體或生物材料的工具，尤其用於固定壁層 和內臟的加強裝置，或
-用於防止術後粘連的薄膜、凝膠和膜，其單獨地或與其他醫學 裝置相聯合地使用。
最後，本發明還涉及美容性或治療性治療的方法，其中給有此需 要的患者施用美容或治療有效量的根據本發明的製劑。
該方法涉及尤其是前述的用途。
下面的實施例以非限制性的方式描述了本發明的實施，以用於改 善在內科學和外科學中使用的目前的膠和植入物的生物相容性。
根據本發明的產品的實施例
實施例1:在生理pH下不可溶的人珠蛋白的製備
通過給患者進行靜脈穿刺來抽取30 ml人血，並用3 ml檸檬酸鈉 在搖動下進行收集。將血樣立即冷凍。在解凍後，向血液添加等體積
13的無菌蒸餾水以完成血細胞溶解，隨後在10000 rpm下離心30分鐘， 或/和在預濾器上進行澄清並在孔隙度為0. 2至0. 45微米的膜上進行 無菌過濾。在漂洗濾器後，獲得74ml的體積，其含有52 mg/ml的血 紅蛋白，並將其貯存於4t:。在攪拌下，將該溶液緩慢倒入含有7. 5 ml HC1 (12 N)的750 ml丙酮中。劇烈攪拌該懸浮液，並讓其在化學通 風櫥下或在密閉反應器中在環境溫度下靜置10至60分鐘。通過在多 孔網狀織物上進行過濾來除去含有溶解的血紅素的丙酮。在該網狀織 物上用無水丙酮洗塗脫色的珠蛋白的沉澱，並在脫水後回收。真空幹 燥使得能夠製備白色的珠蛋白粉末，它是易於貯藏或運輸的(如杲需 要的話)。然後，將珠蛋白沉澱(21.8 g)或相應的粉末重新溶解在 300 ml無菌蒸餾水中，接著向該溶液中添加5 g/1 NaCl。通過添加1 N氫氧化鈉將酸性pH (=2.5)調節到5. 0至5. 5的值。珠蛋白在這些 條件下保持可溶，從而在多孔膜上過濾使得能夠除去不可溶的變性的 血漿雜質。然後，將濾液調節至pH7.0，從而珠蛋白大量地沉澱出來， 同時讓可溶的血漿蛋白質留在上清液中。在濾網上用5 g/1 NaCl溶液 洗滌經純化的中性珠蛋白沉澱。可以通過下列方式來進行補充的純化 酸溶解，在0. 2至0. 45 無菌多孔膜上進行過濾，以及在中性pH 下再沉澱。另一方面，於+20。C用等於0. 2N的氫氧化鈉終濃度進行鹼 處理1小時，隨後通過添加1 N鹽酸在中性pH下進行沉澱，使得能夠 保證對可能存在於患者血液中的傳染性或傳播性因子實施補充滅活。 最後，將不溶性珠蛋白的糊劑懸浮在9 g/1氯化鈉的生理溶液中，該 生理溶液可選地緩沖至pH 7。作為變化形式，可在蒸餾水中洗滌珠蛋 白沉澱，然後經歷凍千，以製備不溶性珠蛋白的中性粉劑。添加透明 質酸鈉或增塑劑例如甘油或/和聚乙二醇使得能夠製備多少有一點復 雜的珠蛋白粉劑，以便其與粘合性生物材料相混合。最後，可以用劑 量為5至30k戈瑞的P或Y輻射對不溶性珠蛋白的糊劑或粉劑進行滅 菌。
實施例2:在生理pH下可溶的經化學修飾的人珠蛋白的製備從由輸血中心獲得的一袋400 ml的血細胞濃縮物開始進行實施例 1的方法，該袋血細胞濃縮物是經檢查的和過期的。以與待處理的體 積成比例的方式調整反應物的體積。在純化結束時，在2至3的酸性 pH下重新溶解珠蛋白沉澱。使珠蛋白在10體積的丙酮中進行沉澱， 隨後用無水丙酮洗滌，並且在真空中或在空氣流中並伴以連續攪拌進 行乾燥，以便製備細碎的脫鹽的酸性粉末。在250 ml燒瓶中稱取8 g 細碎的人珠蛋白粉末，向其中添加200 ml含有2 ml HC1 ( 12N)的無 水乙醇，即最終的酸濃度為0. 12 N。所述粉末在這些條件下保持完全 不可溶，稍微膨脹，並且良好地分散。在密封塞住瓶口後，在環境溫 度下進行一周的溫育，同時每天數次進行適度搖動。
藉助於孔隙度為1 yffl的尼龍濾器將珠蛋白沉澱與酸性乙醇分開。 將沉澱用200 ml純丙酮洗滌三次，然後空氣乾燥，從而獲得7.4 g 良好粉碎的細粉末。最後，可溶性珠蛋白的粉劑可以通過劑量為5至 30k戈瑞的p或y輻射來進行滅菌。
可以在燒杯中，在200 ml蒸餾水中迅速溶解這種自發可潤溼性差 的粉末。獲得pH2. 8的淡黃色透明溶液。通過逐滴添加0. 5 N氬氧化 鈉來中和該溶液的pH(在手工攪拌下並連續檢查pH),使得能夠驗證 珠蛋白在6至8的中性pH下的可溶特性，隨後其在接近9. 5至10的 鹼性pH下大量沉澱。
有可能在接近pH 6時觀察到開始沉澱。這對應於未經修飾的珠蛋 白(其位於大粉末聚集體的中心而免於發生酯化反應)的部分存在。 應當注意，如此製備的珠蛋白酯在體內被逐漸水解並自發地重新產生 最初的不溶性珠蛋白，後者本身將會被降解。因此，這涉及隨時間或 在體內可逆的化學修飾。還應當注意，如此製備的珠蛋白酯具有非常 明顯的正電荷。其接近10的鹼性等電點是由於羧基官能團的或多或少 完全的消失。該性質賦予它們以對於帶負電荷的組織的粘合特性。這 些珠蛋白酯具有大量的胺官能團，其可以通過生物膠的常用試劑而容 易地交聯，所述試劑包括酪官能團例如戊二醛或氧化多糖。此外，在任何帶負電荷的聚合物或生物聚合物存在下，它們可以藉助於強的靜 電鍵而容易地形成穩定的網格。在合成聚合物中間，可提及例如聚丙 烯酸類聚合物或聚乙二醇的陰離子衍生物。在天然聚合物中間，可提 及纖維蛋白原、纖維蛋白、白蛋白、透明質酸鹽、肝素、纖維素的生 物可吸除性衍生物例如氧化纖維素、或者所有其他疏酸化的或富含羧 基官能團的多糖。
實施例3:在生理pH下不可溶的經化學修飾的人珠蛋白的製備
如果用攜帶具有至少四個碳的鏈(例如丁醇、己醇、辛醇)或甚 至攜帶更長的鏈的脂肪醇代替實施例2中所使用的乙醇，那麼所獲得 的經酯化的珠蛋白的衍生物在中性pH下就不再是可溶的，而變成在水 或生理水溶液中不可溶。為了促進具有長碳鏈的醇與珠蛋白的羧基官 能團的酯化反應，優選使用常規的活化手段，例如碳二亞胺類或者醇 或羧基官能團的其他已知活化劑。
實施例4:在生理pH下不可溶的經化學修飾的人珠蛋白的製備
將5克根據實施例2製備的經酯化的可溶性珠蛋白的粉劑懸浮在 200 ml 50%乙醇水溶液中，該水溶液包含濃度為0. 25%的戊二醛。在 環境溫度下溫育1小時後，向經交聯的珠蛋白懸浮液添加2克硼氫化 鈉，這在化學通風櫥中進行以排出過量生成的氫氣。該快速的反應確 保了過量的醛官能團的還原並將它們轉變為醇官能團。經如此處理的 珠蛋白懸浮液失去了由戊二醛所賦予的黃色。然後，將該懸浮液在乙 醇中隨後在丙酮中洗滌，並最後在真空中乾燥，以製備不可溶的交聯 珠蛋白的微白色粉劑。
實施例5:不溶性珠蛋白的無菌粉劑與商業生物膠的聯合根據實施例1、3和4之一製備的不溶性珠蛋白的粉劑可以用作內 科學或外科學用膠的液體組分的添加劑。該粉劑不稀釋商業生物膠的 活性成分(可溶性單體或聚合物)。可以用同樣的方式混合此類商業 生物膠的這兩種組分。當添加聚合催化劑或交聯試劑時，所述珠蛋白 不妨礙全體(珠蛋白參與其中)的最終聚合或交聯反應。該混合可以 恰在使用所述膠之前用合適的無菌混合裝置來進行，或者可以整合入 生物膠的液體組分的製備方法中。嵌入膠內部的珠蛋白網格構成了細 胞的進入途徑，所述細胞將參與該膠的體積的逐步的組織重建以及其 與周圍組織的協調整合。珠蛋白的添加用目前的可植入型膠的可溶性 組分來容易地進行。例如，基於纖維蛋白原的膠例如為Tisseel⑧、 Beriplast ;基於白蛋白的膠例如為Bioglue ;基於聚乙二醇的矛汴 生物的膠例如為Coseal 、 Duraseal ;基於丙烯酸類f汙生物的膠例 如為Indermil⑧或Dermabond⑧。
實施例6:不溶性珠蛋白的無菌糊劑與商業生物膠的聯合
通過用根據實施例1、3和4之一製備的珠蛋白的含水糊劑代替珠 蛋白的粉劑，來重現上述的實施例5。由包含在珠蛋白糊劑中的水分 所引起的對於粘合性成分的稀釋是可以忽略的，並且由所補加的珠蛋 白(其參與該新型粘合性混合物)通過使其變濃以及提高其粘度和其
稠度而得到了充分的補償。此外，在所述粘合性組分處於不可與水混 溶的有機溶液中的情況下，所述水分不會發生混合。
實施例7:可溶性珠蛋白的無菌粉劑與商業生物膠的聯合
通過使用根據實施例2製備的可溶性珠蛋白的粉劑來重現實施例 5和6。在這種情況下，珠蛋白不導致任何稀釋。在體內應用該新型粘 合性混合物後，珠蛋白粉劑逐步吸收周圍組織的水分，這將構成細胞 的新的進入途徑，所述細胞用於植入物的集落化、組織整合和逐步吸除。
實施例8:不溶性珠蛋白的糊劑與氧化纖維素纖維的聯合
製備不溶性珠蛋白的糊劑，優選地，根據實施例l、 3或4之一。 將這種懸浮的(例如在蒸餾水中)不溶性珠蛋白的糊劑與氧化纖維素 纖維的糊劑分別以20%和80%的比例進行混合。將該全體凍幹，並通過 劑量為25至30k戈瑞的y輻射進行滅菌。獲得氧化纖維素和不溶性珠 蛋白的複合海綿，用於內部或外部傷口的處理。為了優化瘢痕形成的 性質和生物材料的吸除速度，可以改變珠蛋白和氧化纖維素的比例， 珠蛋白的比例低於50%。
實施例9:不溶性珠蛋白的糊劑與交聯透明質酸鹽的凝膠劑的聯合
製備不溶性珠蛋白的糊劑，優選地，根據實施例1、 3或4之一。 將這種不溶性珠蛋白的糊劑(優選地，以10%的濃度懸浮在生理溶液 例如9 g/1的NaCl中)分配到1 ml的塑料或玻璃注射器(Schott或 Becton Dickinson)中，並通過劑量為25至30k戈瑞的y輻射進行滅 菌。然後，將不溶性珠蛋白的無菌糊劑與經交聯且無菌的透明質酸鹽 的無菌凝膠劑以任何可能的比例進行混合，例如藉助於無菌的聯接式 連接器(connecteur coupleur )，例如由Promepla， Principaut"e Monaco ( ref FTLLC-6 )提供的Luer Lock類型的聚丙烯聯接式連接器。 該聯接器(coupleur )可以任選地具有0. 2至2 mm的直徑限制。交聯 透明質酸鹽可以是下列商業產品中的任 一 種Restylane 或 Hylaform ,或Juvederm ,或Puragen Plus ,或任何其他相當的 產品。可以以任何可能的比例在優選1 ml的注射器中直接獲得這兩種 生物聚合物的無菌混合物，並且可以進行注射以用於所需的組織增補。 由於在交聯透明質酸鹽的凝膠劑之內存在甚至少量的不溶性珠蛋白， 這樣的複合產品允許植入物的細胞集落化。
18其他填補或增補用的聚合物產品或製劑可以與不可溶的天然或經 修飾的珠蛋白或者由經修飾從而至少部分可溶的珠蛋白獲得的珠蛋白
相聯合，例如聚乳酸，例如根據下面的實施例
實施例10:不溶性珠蛋白的糊劑與聚乳酸微顆粒的懸浮液的聯合
製備不溶性珠蛋白的糊劑，優選地，根據實施例1、 3或4之一。 將這種不溶性珠蛋白的糊劑(優選地，以10%的濃度懸浮在生理溶液 例如9 g/1的NaCl中)分配到1 ml的塑料或玻璃注射器(Schott或 Becton Dickinson)中，並通過劑量為25至30k戈瑞的y輻射進行滅 菌。然後，將不溶性珠蛋白的無菌糊劑與聚乳酸微顆粒的無菌懸浮液 以任何可能的比例進行混合，例如藉助於無菌的聯接式連接器，例如 由Promepla， Principaut6 de Monaco( ref FTLLC-6 )提供的Luer Lock 類型的聚丙烯聯接式連接器。該聯接器可以任選地具有0. 2至2 mm 的直徑限制。聚乳酸微顆粒的懸浮液可以例如獲自Dermik公司銷售的 Sculptra⑧產品，或者任何其他用於組織填補的聚乳酸可注射糊劑。 可以以任何可能的比例在優選1 ml的注射器中直接獲得這兩種生物聚 合物的無菌混合物，並且可以進行注射以用於所需的組織增補。由於 在所植入的製劑之內存在甚至少量的不溶性珠蛋白，這樣的複合產品 允許植入物的更好的、更穩定的、更少炎症的細胞集落化。
實施例11:不溶性珠蛋白的糊劑與礦物顆粒的聯合
製備不溶性珠蛋白的糊劑，優選地，根據實施例1、 3或4之一。 將這種糊劑與由磷酸鈣或羥基磷灰石構成的礦物顆粒的懸浮液相混 合，例如以分別20%和80°/。的比例。將該全體在無菌空氣流中乾燥或者 凍幹，並通過劑量為25至30k戈瑞的Y輻射進行滅菌。獲得包裹有不 溶性珠蛋白的礦物顆粒的複合粉劑(在乾燥的情況下)或與不溶性珠 蛋白相混合的礦物顆粒的複合粉劑(在凍幹的情況下)，以用於治療骨折或骨質丟失。為了優化骨瘢痕形成的性質和生物材料的吸除速度，
可以改變珠蛋白和礦物顆粒的比例，珠蛋白的比例優選低於50°/。。當 矯形外科假體覆蓋有用於改善其生物整合的礦物顆粒時，那麼向此顆 粒覆蓋層中添加珠蛋白是特別合適的。
可製備這樣的製劑，其將在生理pH下不可溶的天然或經修飾的珠 蛋白的材料和/或能夠由經修飾從而在生理pH下至少部分可溶的珠蛋 白獲得的材料，與尤其是由磷酸鈣或羥基磷灰石構成的礦物顆粒相聯 合(例如根據實施例11)，並且其可以含有優選地10/90至90/10的 各自比例；這樣的製劑不僅可用於軟組織例如皮膚組織尤其是皺紋的 填補(優選地，將所述材料與羥基磷灰石相聯合)，而且還可用於骨 的填補和修復，其中包括在口腔醫學和牙體外科學領域中，例如用於 治療牙周炎。
實施例12:包含珠蛋白的生物材料和生物膠的醫學應用
根據本發明的聯合了珠蛋白(甚至以少數比例)的生物材料和生 物膠可以用於下列非限制性的應用
-外部皮膚傷口或內部外科手術傷口的瘢痕形成、保護或填補， -皺紋和皮膚缺損的填補，
-結締組織或括約肌的填補，對於在泌尿學(兒童的膀胱-輸尿管 反流，婦女的壓力性尿失禁)、耳鼻喉科(聲帶體積的校正)中的應 用，
-用於組織傷口或經皮動脈傷口的粘合性止血栓子，
-在受者組織上固定假體或生物材料的工具，尤其用於固定壁層
和內臟的加強裝置，
-用於防止術後粘連的薄膜、凝膠和膜，其單獨地或與其他醫學
裝置相聯合地使用，
-骨傷口的填補和瘢痕形成，矯形外科假體的覆蓋層。
因此，本發明的目標還在於，根據本發明的下列物質的聯合在製備根據本發明的可注射或可植入的製劑中的用途，所述製劑尤其用於
一種或多種上文提及的應用
-在生理pH下不可溶的天然或經修飾的珠蛋白的材料和/或能夠 由經修飾從而在生理pH下至少部分可溶的珠蛋白獲得的材料，所述材 料在有機體中是生物相容的和生物可降解的，和
-選自下列的試劑合成或天然的粘合性聚合物試劑，組織填補 或增補聚合物試劑，尤其是基於交聯透明質酸、聚乳酸或其他有機或 無機聚合物(尤其是幾基磷灰石)的試劑，和傷口瘢痕形成聚合物試 劑，即氧化纖維素，
-條件是，如果所述製劑包含所述能夠由經修飾從而至少部分可 溶的珠蛋白獲得的材料，那麼所述粘合性聚合物試劑，如果存在的話， 不是透明質酸或羧甲基纖維素，所述填補或增補聚合物試劑，如果存
在的話，是基於交聯透明質酸的試劑；以及如果所述製劑包含氧化纖 維素，那麼氧化纖維素以高於所述珠蛋白材料的比例存在，所述珠蛋 白材料為在生理pH下不可溶的天然或經修飾的珠蛋白的材料。
一般地，不論根據本發明的製劑是怎樣的，所述方法旨在治療目 的。依據所涉及的個體，填補皺紋的方法可以僅僅旨在美容目的。在 所有情況下，根據本發明的方法包括這樣的步驟，即在有此需要的患 者或個體的組織之中或之上局部植入治療或美容有效量的根據本發明 的製劑，以尤其用於前述的應用。參考書目
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Cleavage of the haem-protein link by acid methy卜ethyl keton Biochem. Biophys. Acta 35, 54權利要求
1. 可植入在有機體組織之上或之中的無菌製劑，其包含-在生理pH下不可溶的天然或經修飾的珠蛋白的材料和/或能夠由經修飾從而在生理pH下可溶的珠蛋白獲得的材料，所述材料在有機體中是生物相容的和生物可降解的，-選自下列的試劑合成或天然的粘合性聚合物試劑，組織填補或增補聚合物試劑，尤其是基於交聯透明質酸、聚乳酸的試劑，和傷口瘢痕形成聚合物試劑，即氧化纖維素，-條件是，如果所述製劑包含所述能夠由經修飾從而至少部分可溶的珠蛋白獲得的材料，那麼所述粘合性聚合物試劑，如果存在的話，不是透明質酸或羧甲基纖維素，所述填補或增補聚合物試劑，如果存在的話，是基於交聯透明質酸的試劑；以及如果所述製劑包含氧化纖維素，那麼氧化纖維素以高於所述珠蛋白材料的比例存在，所述珠蛋白材料在這種情況下為在生理pH下不可溶的天然或經修飾的珠蛋白的材料。
2. 根據權利要求1的製劑，其中所述珠蛋白材料包含在生理pH 下不可溶的天然或經修飾的珠蛋白。
3. 根據權利要求l的製劑，其中所述珠蛋白材料包含在生理PH 下可溶的經修飾的珠蛋白。
4. 根據權利要求l的製劑，其中所述珠蛋白材料包含在生理pH 下不可溶的經修飾的珠蛋白，其由在生理PH下可溶的經修飾的珠蛋白 獲得。
5，根據權利要求1至4中任一項的粘合性製劑，其中所述粘合性 聚合物為纖維蛋白原。
6. 根據權利要求1至4中任一項的粘合性製劑，其中所述粘合性 聚合物為白蛋白。
7. 根據權利要求1至4中任一項的粘合性製劑，其中所述粘合性 聚合物為合成的粘合性聚合物。
8. 根據權利要求7的粘合性製劑，其中所述粘合性聚合物為聚乙 二醇的衍生物或者丙烯酸類聚合物或氰基丙烯酸類聚合物。
9. 根據權利要求1至4中任一項的製劑，其用於組織填補或增補， 其中所述聚合物試劑包含交聯透明質酸。
10. 根據權利要求1至4中任一項的製劑，其用於組織填補或增 補，其中所述聚合物試劑包含聚乳酸。
11. 根據權利要求1至10中任一項的製劑，其中所述聚合試劑不 是氧化纖維素，以及其中所述材料相對於材料加上聚合物試劑這一整 體而言的比例大於或等於50%。
12. 根據權利要求1至10中任一項的製劑，其中所述材料相對於 材料加上聚合物試劑這一整體而言的比例小於或等於50%,尤其是小 於或等於25線10%。
13. 根據權利要求1至12中任一項的製劑，其以粉劑、敷料、糊 劑、凝膠劑、可注射懸浮液或溶液或者可植入固體材料的形式存在， 尤其用於填補或修復組織、皮膚、結締、脈管、內臟或骨的缺損，並且通常用於保護或填補傷口和參與其瘢痕形成。
14. 根據權利要求1至13中任一項的製劑在製備在有機體中可植 入或可注射的製劑中的用途。
全文摘要
本發明涉及可植入在有機體組織之上或之中的無菌製劑，其包含在生理pH下不可溶的天然或經修飾的珠蛋白的材料和/或能夠由經修飾從而在生理pH下可溶的珠蛋白獲得的材料，所述材料在有機體中是生物相容的和生物可降解的；選自下列的試劑合成或天然的粘合性聚合物試劑，組織填補或增補聚合物試劑，尤其是基於交聯透明質酸、聚乳酸的試劑，和傷口瘢痕形成聚合物試劑，即氧化纖維素；條件是，如果所述製劑包含所述能夠由經修飾從而至少部分可溶的珠蛋白獲得的材料，那麼所述粘合性聚合物試劑，如果存在的話，不是透明質酸或羧甲基纖維素，所述填補或增補聚合物試劑，如果存在的話，是基於交聯透明質酸的試劑，以及如果所述製劑包含氧化纖維素，那麼氧化纖維素以高於所述珠蛋白材料的比例存在，所述珠蛋白材料在這種情況下為在生理pH下不可溶的天然或經修飾的珠蛋白的材料。本發明還涉及該製劑的用途，尤其是用於填補或瘢痕形成的用途。
文檔編號A61L27/22GK101522228SQ200780036446
公開日2009年9月2日 申請日期2007年1月24日 優先權日2006年8月2日
發明者J-L·塔約特 申請人:克赫裡昂恩克斯公司