萘乙二胺無機酸鹽或萘乙二胺有機酸鹽在作為maldi中基質的應用的製作方法

2023-09-16 03:01:15

專利名稱：萘乙二胺無機酸鹽或萘乙二胺有機酸鹽在作為maldi中基質的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種萘こニ胺無機酸鹽或萘こニ胺有機酸鹽在作為MALDI中的基質的應用，屬於質譜檢測技術領域。
背景技術：
自1988年Karas et al.和Tanaka et al.報導米用基質輔助雷射解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)技術可以有效的進行生物大分子質譜的 分析以來，MALDI-TOFMS技術備受各國研究者的青睞。但由於MALDI-TOF MS技術常用的基質都是小分子有機化合物，如α-腈基-4-羥基肉桂酸(CCA)、2，5-ニ羥基苯甲酸(DHB)、芥子酸(SA)、3_羥基-2-吡啶甲酸(3-ΗΡΑ)、蒽三酚(DI)和3-氨基喹啉(3-AQ)等。在分析過程中，由於上述基質分子在m/z < 500的範圍內容易發生碎裂及分子之間的締合等產生嚴重的基質背景幹擾現象，因此，採用這些基質不能有效的分析m/z < 500的小分子化合物。為了避免基質背景幹擾現象的產生，研究者們通過對MALDI-TOF MS機理的研究提出了許多可行的改進方法。如先後引入無機物基質、聚合物基質、混合基質等新基質或通過對多孔矽表面進行化學修飾從而採用無基質解吸/電離方法來克服以有機小分子作為基質分析小分子化合物的不足。採用無機物如ニ氧化鈦作為基質分析樣品時，得到的信號峰不僅有質子化的樣品分子峰、還有樣品分子和鹼金屬形成的加合物的峰等多種峰；用石墨烯作為基質，分析樣品時，靈敏度較低。由於聚合物的合成步驟較多，如果用聚合物作為基質分析樣品，不能充分體現MALDI-TOF MS分析樣品快速、高效的特點。採用質子海綿作為基質只能分析有機酸類化合物。在多孔矽表面發生解吸/電離時首先要在矽晶表面進行刻蝕使其產生納米結構的表面，在這樣的表面雖然可以直接分析多肽和抗病毒藥物，但由於這種表面的重複使用效果不好，因此就需要在同樣的納米結構表面上進行反覆處理以得到能重複使用的表面。此夕卜，對多孔矽表面進行化學修飾耗時較長而且經過修飾多孔矽重複使用時分析效果會大大下降。因此，提供ー種操作方法簡單，成本低廉，適用範圍廣，在小於m/z 500內沒有或只有很低背景峰的基質以及樣品製備分析方法，是對當前基於MALDI的質譜分析的重要和有力補充。具有廣泛的實用意義。

發明內容
本發明的目的是提供一種萘こニ胺無機酸鹽或萘こニ胺有機酸鹽在作為基質輔助雷射解吸電離質譜(MALDI)中的基質的應用。本發明提供的萘こニ胺無機酸鹽或萘こニ胺有機酸鹽在作為基質輔助雷射解吸電離質譜中的基質的應用中，所述基質輔助雷射解吸電離質譜為基質輔助雷射解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)。
上述的應用中，所述萘こニ胺無機酸鹽可為萘こニ胺鹽酸鹽、萘こニ胺硝酸鹽、萘こニ胺磷酸鹽或萘こニ胺硫酸鹽等；所述萘こニ胺有機酸鹽可為萘こニ胺三氟こ酸鹽、萘こニ胺こ酸鹽、萘こニ胺甲酸鹽、萘こニ胺檸檬酸鹽或萘こニ胺草酸鹽等。上述的應用中，所述基質輔助雷射解吸電離質譜中的待測物質的分子量小於1000,只有少量固定的背景峰而不產生背景幹擾。上述的應用中，所述基質輔助雷射解析電離質譜中的待測物質可為單糖、寡糖、糖肽、糖醇、糖脂、脂類化合物、胺基酸、多肽、尿素、金屬離子、核酸、有機酸、留體類化合物和胺類化合物中任ー種。上述的應用中，所述單糖和寡糖可為D(+)木糖、D-(-)阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、L(+)鼠李糖、D-半乳糖、D-果糖、葡萄糖、L-山梨糖、蔗糖、乳糖、D (+)蜜三糖或水蘇四糖等；所述糖肽可為糖蛋白水解後糖肽片段；所述糖醇可為木糖醇、甘露醇等；所述糖脂可為甘油糖脂、鞘糖脂或脂多糖等；所述脂類化合物可為甘油三脂、卵磷脂、腦磷脂或肌醇磷脂 離子、鎳離子或金離子等；所述有機酸可為五氟苯甲酸、尿酸或抗壞血酸等；所述留體類化合物可為膽固醇或腎上腺素等；所述胺類化合物可為尿素或多巴胺等。上述的應用中，所述基質輔助雷射解析電離質譜還可用於檢測下述體系細胞組織樣本、微生物樣本、體液、化學反應混合物和環境監測樣本。因此，本萘こニ胺無機酸鹽或萘こニ胺有機酸鹽可在有機與生物質譜，質譜成像，蛋白質譜學，代謝組學，生物標記物發現，環境分析等領域得到有效的應用。上述的應用中，所述環境檢測樣本具體可為水、大氣、或土壤樣本。上述的應用中，所述基質輔助雷射解析電離質譜還可用於對待測物質進行質譜成像，如待測樣品為組織切片時，可將萘こニ胺無機酸鹽或萘こニ胺有機酸鹽的溶液(lmg/ml至飽和濃度)噴灑在樣品表面，然後進行標準的質譜成像分析。上述的應用中，所述萘こニ胺無機酸鹽或萘こニ胺有機酸鹽與所述基質輔助雷射解析電離質譜的待測物質的摩爾比可為(I 100) (I 5)，如10 I。上述的應用中，溶解基質的溶劑原則上與質譜後續分析兼容即刻，通常可以是水、甲醇、こ醇或こ腈等，包括它們的互溶體系；基質溶液的濃度沒有限定，可上至飽和溶液。上述的應用中，待測物質為複雜混合體系時，通常無需特殊處理，吸取混合體系的上清液(也可以是渾濁液)以ー定比例和基質溶液混合，點於MALDI靶板後即可用於質譜分析。本發明從技術上克服了常用有機小分子基質在低分子量區容易產生嚴重的基質背景幹擾現象從而導致不能有效分析小分子樣品的缺陷；本發明採用的基質，無需加入離子化試劑，減少了對樣本處理的要求；由於在測試範圍內(m/z O 1000)幾乎沒有背景幹擾，因而對多種複雜混合體系也可進行分析。而且樣本兼容性好，無需特殊複雜處理即可分析。


圖I為鹽酸萘こニ胺的質譜背景。圖2為實施例I中細菌鑑定的質譜譜圖和主成分分析結果，其中，圖2(a)為細菌鑑定的質譜譜圖的代表性譜圖，圖2(b)為細菌鑑定的主成分分析結果。 圖3為實施例2中小鼠腦組織的質譜成像。圖4為實施例3中血清中鉛離子的檢測的質譜圖，其中，圖4a為硝酸萘こニ胺基質為基質的檢測譜圖，圖4b為鹽酸萘こニ胺為基質的檢測譜圖。圖5為實施例4中結腸癌細胞和紅血球細胞中溶出物的質譜圖。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。本發明下述實施例所用的鹽酸萘こニ胺購自天津市鑫鉬特化工有限公司和美國Sigma 公 ロJ。硝酸萘こニ胺是按照如下方法製備的室溫下，將33.50mg鹽酸萘こニ胺和44. 7Img AgN03(鹽酸萘こニ胺與AgNO3的摩爾比為I 2)加至I. 200ml體積比為30 70的こ醇/水中，使兩者通過超聲混合均勻，並進行反應；反應過程中，會產生白色的AgCl沉澱；待白色的AgCl沉澱不再增加時，表明反應完全，上層的清液即為硝酸萘こニ胺的こ醇/水溶液，下層的沉澱物即為AgCl。分離並過濾掉沉澱物AgCl後，使上層的硝酸萘こニ胺的こ醇/水溶液通過732型強酸性陽離子交換樹脂，流出液即為純淨的硝酸萘こニ胺的こ醇/水溶液，分離即得硝酸萘こニ胺。本發明下述實施例所用的基質輔助雷射解吸電離飛行時間質譜儀的型號為BIFLEXTM III (Bruker)和 UltrafleXtreme(Bruker)。基質的質譜背景非常簡單，對測試樣本，包括複雜體系均無幹擾，圖I為鹽酸萘こニ胺的質譜背景。實施例I、鹽酸萘こニ胺鑑定區分不同微生物(細菌)培養的恥垢分枝桿菌和大腸桿菌及其不同的亞種和突變株細菌生長到大於0D0. 6後收集，磷酸鹽緩衝液洗滌後-20°C冷凍保存或者直接用於進ー步處理；磷酸鹽緩衝液懸浮的細菌用去離子水置換，5000rpm離心留沉澱，向沉澱中加入3倍體積的80%こ醇水溶液(體積百分含量)，懸浮後靜置15min,再5000rpm離心後取上清,或者不離心直接取適量樣品用於質譜分析。取樣品和基質溶液(鹽酸萘こニ胺的こ醇水溶液(其中，こ醇與水的體積比為I 2，鹽酸萘こニ胺的質量體積濃度為10mg/ml)以I : I體積比，向MALDI靶板加入Iul樣品，充分乾燥；入質譜分析，質譜條件為電壓加速電壓19. OOOkv ;延遲引出電壓14. 920kv ;反射器電壓20. OOOkv ;透鏡電壓7. OOOkv ;頻率1. OOOHz ;雷射器能量75 80%。負離子模式。通過將獲得的質譜譜圖(圖2-1為代表性譜圖)進行主成分分析(PCA)(圖2-2)，可以快速靈敏度區分細菌的種，亞種和多種單基因突變，其結果優於當前已知的同類方法。實施例2、小鼠腦組織切片質譜成像小鼠腦組織速凍後，不進行固定和包埋，經標準冰凍切片組織處理方法，切得IOum厚切片置於ITO導電載玻片上噴灑基質溶液(鹽酸萘こニ胺的こ醇水溶液，其中，こ醇與水的體積比為I : 2，鹽酸萘こニ胺的質量體積濃度為10mg/ml);基質的噴灑是自動完成的，按照特定成像質譜的默認方法；按照標準質譜成像方法進行分析，質譜BrukerUl traf I extreme TOF ;100um解析度(極限解析度IOum);姆個像素300張譜圖；雷射波長355nm，脈衝頻率IOOOHz ;38%強度；m/z 100-1000 ;負離子模式。圖3為小鼠腦組織兩種不同脂類在白質和灰質的不同分布；利用上述的方法測試在不同組織樣本(肝、心臟和腎)中均可獲得良好的成像。實施例3、金屬離子在血清背景下的檢測鹽酸萘こニ胺和硝酸萘こニ胺都可以進行金屬離子的檢測。在MALDI電離方式下，基質中的負離子(Cr或者no3_)與帶正電荷的金屬離子結合，額外多結合一個負離子使整體帶ー個負電荷，從而被分離和檢測。取lOOug/L標準加入醋酸鉛標準樣品的血清和基質溶液(硝酸萘こニ胺的こ醇水溶液，其中，こ醇與水的體積比為I : 2，硝酸萘こニ胺的質量體積濃度為10mg/ml)以I : I體積比(硝酸萘こニ胺與醋酸鉛的摩爾比為10 I)，向MALDI靶板加入Iul樣品，充分幹 燥。入質譜分析，質譜條件為電壓加速電壓19. OOOkv ;延遲引出電壓14.920kv ;反射器電壓20. OOOkv ;透鏡電壓7. OOOkv ;頻率:1.000Hz ;雷射器能量:75-80%0負離子模式。利用鹽酸萘こニ胺作為基質對鉛離子進行檢測的方法同上。圖4a和圖4b分別表示了 100ug/L標準加入醋酸鉛標準樣品的血清在硝酸萘こニ胺基質和鹽酸萘こニ胺的輔助下，得到的硝酸根與鉛離子、氯離子與鉛離子結合的譜圖。除了與基質的混合過程，血清並沒有經過進一歩處理。檢測靈敏度符合血鉛檢測標準。本例也表明血清的小分子物質也可被檢測。除了鉛離子，其它金屬離子只要能在鹽酸/硝酸/三氟こ酸中等可溶就都可以被檢測到，並且根據同位素峰分布可以判斷金屬離子的價態。實施例4、檢測細胞樣本結腸癌細胞和紅血球細胞經磷酸鹽緩衝液洗滌後，再用體積百分含量為75%的こ醇水溶液固定保存，測試前樣品用75%的こ醇水溶液洗滌兩次，靜置15min(細胞濃度1χ10Ε5個/毫升)；低速離心取上清，獲得不使細胞破碎的溶出物，然後與基質溶液以I : I體積比混合(基質溶液為鹽酸萘こニ胺的こ醇水溶液(こ醇與水的體積比為I : 2，鹽酸萘こニ胺的濃度為10mg/ml)混合後乾燥於MALDI靶板；經質譜分析，可得到小分子區域的譜圖，如圖5所示，所用方法條件與實施例I類似，質譜條件為電壓加速電壓19. OOOkv ;延遲引出電壓14. 920kv ;反射器電壓20. OOOkv ;透鏡電壓7. OOOkv ;頻率1.000Hz ;雷射器能量75-80%，負離子模式。圖5顯示未經破碎的不同細胞的溶出物有顯著不同，說明萘こニ胺基質可以分析細胞的小分子物質。
權利要求
1.萘乙二胺無機酸鹽或萘乙二胺有機酸鹽在作為基質輔助雷射解吸電離質譜中的基質的應用。
2.根據權利要求I所述的應用，其特徵在於所述基質輔助雷射解吸電離質譜為基質輔助雷射解吸電離飛行時間質譜。
3.根據權利要求I或2所述的應用，其特徵在於所述萘乙二胺無機酸鹽為萘乙二胺鹽酸鹽、萘乙二胺硝酸鹽、萘乙二胺磷酸鹽或萘乙二胺硫酸鹽；所述萘乙二胺有機酸鹽為萘乙二胺三氟乙酸鹽、萘乙二胺乙酸鹽、萘乙二胺甲酸鹽、萘乙二胺檸檬酸鹽或萘乙二胺草酸鹽。
4.根據權利要求1-3中任一所述的應用，其特徵在於所述基質輔助雷射解吸電離質譜中的待測物質的分子量小於1000。
5.根據權利要求1-4中任一所述的應用，其特徵在於所述基質輔助雷射解析電離質譜中的待測物質為單糖、寡糖、糖肽、糖醇、糖脂、脂類化合物、胺基酸、多肽、尿素、金屬離子、核酸、有機酸、留體類化合物和胺類化合物中任一種。
6.根據權利要求5所述的應用，其特徵在於所述單糖和寡糖為D(+)木糖、D-(-)阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、L(+)鼠李糖、D-半乳糖、D-果糖、葡萄糖、L-山梨糖、蔗糖、乳糖、D (+)蜜三糖或水蘇四糖；所述糖醇為木糖醇或甘露醇；所述糖脂為甘油糖脂、鞘糖脂或脂多糖；所述脂類化合物為甘油三脂、卵磷脂、腦磷脂或肌醇磷脂；所述金屬離子為鉛離子、汞離子、鈉離子、鉀離子、鈣離子、鎂離子、鐵離子、鈷離子、錳離子、鎳離子或金離子；所述有機酸為五氟苯甲酸、尿酸或抗壞血酸；所述留體類化合物為膽固醇或腎上腺素；所述胺類化合物為尿素或多巴胺。
7.根據權利要求5或6所述的應用，其特徵在於所述基質輔助雷射解析電離質譜用於檢測下述體系細胞組織樣本、微生物樣本、體液、化學反應混合物和環境監測樣本。
8.根據權利要求7所述的應用，其特徵在於所述環境檢測樣本為水、大氣、或土壤樣本。
9.根據權利要求1-8中任一所述的應用，其特徵在於所述基質輔助雷射解析電離質譜用於對待測物質進行質譜成像。
10.根據權利要求1-9中任一所述的應用，其特徵在於所述萘乙二胺無機酸鹽或萘乙二胺有機酸鹽與所述基質輔助雷射解析電離質譜的待測物質的摩爾比為(I 100) (I 5)。
全文摘要
本發明公開了一種萘乙二胺無機酸鹽或萘乙二胺有機酸鹽在作為基質輔助雷射解吸電離質譜中的基質的應用。所述應用中，所述基質輔助雷射解吸電離質譜為基質輔助雷射解吸電離飛行時間質譜，所述萘乙二胺無機酸鹽為萘乙二胺鹽酸鹽、萘乙二胺硝酸鹽、萘乙二胺磷酸鹽或萘乙二胺硫酸鹽；所述萘乙二胺有機酸鹽為萘乙二胺三氟乙酸鹽、萘乙二胺乙酸鹽、萘乙二胺甲酸鹽、萘乙二胺檸檬酸鹽或萘乙二胺草酸鹽；本發明從技術上克服了常用有機小分子基質在低分子量區容易產生嚴重的基質背景幹擾現象從而導致不能有效分析小分子樣品的缺陷；本發明採用的基質，無需加入離子化試劑，減少了對樣本處理的要求；由於在測試範圍內(m/z 0～1000)幾乎沒有背景幹擾，因而對多種複雜混合體系也可進行分析。
文檔編號G01N27/64GK102706952SQ20111038715
公開日2012年10月3日 申請日期2011年11月29日 優先權日2011年11月29日
發明者侯劍, 王佳寧, 聶宗秀, 陳素明, 陳芮 申請人:中國科學院化學研究所