用於全血mRNA的高通量定量的裝置和方法
2023-09-17 09:49:25 1
專利名稱：用於全血mRNA的高通量定量的裝置和方法
背景技術：
發明領域本發明涉及全血mRNA的高通量分離和定量。更具體的說，本發明涉及使用附著於固定了寡聚物(dT)的多孔板的白細胞濾器的聯合體來分離和擴增mRNA的方法和裝置。
相關領域的描述分子生物學領域的研究已經揭示了可以根據對細胞核糖核酸(RNA)的研究來推導細胞的遺傳起源和功能活性。該信息可用於臨床實踐，用於診斷感染、用於檢測表達癌基因的細胞的存在、用於檢測家族性疾病、用於監測宿主防禦機制的狀態、以及用於測定HLA分型或其它鑑定指標。RNA存在三種不同的功能形式核糖體RNA(rRNA)、轉運RNA(tRNA)、和信使RNA(mRNA)。儘管穩定的rRNA和tRNA涉及翻譯中的催化過程，然而mRNA分子攜帶遺傳信息。總RNA中只有大約1-5％是mRNA，大約15％是tRNA，而大約80％是rRNA。
mRNA是重要的診斷工具，特別是在用於定量觀測基因的上調和下調時。人外周血是mRNA分析的極好臨床來源。例如，血液中特定嵌合mRNA的檢測指示異常細胞的存在，並且用於慢性髓細胞性白血病(CML)的分子診斷(Kawasaki E.S.、Clark S.S.、Coyne M.Y.、Smith S.D.、ChamplinR.、Witte O.N.、和McCormick F.P.，1988，Diagnosis of chronic myeloidand acute lymphocytic leukemias by detection of leukemia-specificmRNA sequences amplified in vitro，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，855698-5702；Pachmann K.、Zhao S.、Schenk T.、Kantarjian H.、El-Naggar A.K.、Siciliano M.J.、Guo J.Q.、Arlinghaus R.B.、和AndreeffM.，2001，Expression of bcr-able mRNA individual chronic myelogenousleukaemia cells as determined by in situ amplification，Br.J.Haematol.，112749-759)。還能夠通過測量癌特異mRNA而在血液中檢測到微轉移癌細胞，諸如對結腸癌檢測癌胚抗原(CEA)、對前列腺癌檢測前列腺特異抗原(PSA)、對甲狀腺癌檢測甲狀腺球蛋白(Wingo S.T.、RingelM.D.、Anderson J.S.、Patel A.D.、Lukes Y.D.、Djuh Y.Y.、Solomon B.、Nicholson D.、Balducci-Silano P.L.、Levine M.A.、Francis G.L.、和Tuttle R.M.，1999，Quantitative reverse transcription-PCRmeasurement of thyroglobulin mRNA in peripheral blood of healthysubjects，Clin.Chem.，45785-89)、以及對黑素瘤檢測酪氨酸酶(PelkeyT.J.、Frierson H.F.Jr.、和Bruns D.E.，1996，Molecular andimmunological detection of circulating tumor cells andmicrometastasis from solid tumors，Clin.Chem.，421369-1381)。此外，由於這些癌特異mRNA的水平能夠隨著治療而變化，因此對特定mRNA的定量提供了治療監測過程中的有用指標。
由於與白細胞(每微升大約5000個白細胞)相比血液中含有大量的無核紅細胞(每微升大約5百萬個紅細胞)，因此常常由全血分離粒細胞或淋巴細胞作為mRNA分析的第一步。然而，由於在不同樣品中回收白細胞特定子集的不一致性，因此需要對每份樣品測定分離白細胞的數目，並將結果表述成每個白細胞的mRNA數量，而非每微升血液的mRNA數量。此外，mRNA數量可能在漫長的分離過程中發生變化。儘管沒有辦法由血液分離癌細胞，然而基因擴增技術能夠鑑定並定量特定mRNA水平，甚至是來自不同基因集合的mRNA，使得在能夠獲得基因特異引物和探針時全血成為mRNA分析的理想材料。
由全血分離純mRNA是非常困難的，因為全血中含有大量的RNA酶(來自粒細胞)和無核紅細胞。儘管多種RNA提取方法可用於全血(de VriesT.J.、Fourkour A.、Punt C.J.、Ruiter D.J.、和van Muijen G.N.，2000，Analysis of melanoma cells in peripheral blood by reversetranscription-polymerase chain reaction for tyrosinase and MART-1after mononuclear cell collection with cell preparation tubesacomparison with the whole blood guanidinium isothiocyanate RNAisolation method，Melanoma Research，10119-126；Johansson M.、Pisa E.K.、Tormanen V.、Arstrand K.、和Kagedal Bl.，2000，Quantitativeanalysis of tyrosinase transcripts in blood，Clin.Chem.，46921-927；Wingo S.T.、Ringel M.D.、Anderson J.S.、Patel A.D.、LukesY.D.、Djuh Y.Y.、Solomon B.、Nicholson D.、Balducci-Silano P.L.、Levine M.A.、Francis G.L.、和Tuttle R.M.，1999，Quantitative reversetranscription-PCR measurement of thyroglobulin mRNA in peripheralblood of healthy subjects，Clin.Chem.，45785-89)，然而測定流程勞動密集，需要數輪離心，而且涉及對消除核酸酶活性至關重要的小心操作。
因此，需要快速且簡單的方法和裝置，用於對來自全血的大量mRNA進行分離和定量。具體而言，需要高通量的全血衍生mRNA處理技術，以及對基因擴增的可重複回收和無縫處理(seamless process)。
發明概述本發明公開了高效的高通量方法和裝置，用於直接由全血對mRNA進行分離和定量，而且回收是可重複的，其中使用附著於固定了寡聚物(dT)的多孔板的白細胞濾器的聯合體。
本發明的一個方面包括用於對全血mRNA進行高通量定量的方法，包括下列步驟(a)採集全血；(b)通過過濾由全血除去紅細胞和血液成分而在濾膜上保留白細胞；(c)將白細胞進行細胞裂解而生成包含mRNA的裂解物；(d)將裂解物轉移到固定了寡聚物(dT)的板上以捕捉mRNA；和(e)對mRNA進行定量。
在該方法的一個優選實施方案中，在採集白細胞之前將抗凝劑施用於全血。可以將數層濾膜疊在一起以提高白細胞捕獲量。為了由白細胞釋放mRNA，使用裂解緩衝液裂解濾膜上捕獲的白細胞。可以通過離心、真空抽吸、正壓、或用乙醇清洗隨後真空抽吸而將裂解物轉移到固定了寡聚物(dT)的板上。通過生成cDNA及PCR擴增cDNA而對mRNA進行定量。
本發明的另一個方面包括用於對全血mRNA進行高通量定量的裝置，其中所屬裝置包括(a)多孔板，包括多個加樣孔；所述孔下面的白細胞捕捉濾器；和所述濾器下面的mRNA捕捉區，它包含固定的寡聚物(dT)；和(b)真空箱，適於接受濾板而在板與箱之間形成密封。在該裝置的一個優選實施方案中，白細胞是在疊在一起的多層濾膜上捕獲的。在該裝置的另一個優選實施方案中，真空箱適於接受真空源。在該裝置的另一個優選實施方案中，將多孔支持物插入真空箱與多孔板之間。
本發明的另一個方面包括試劑盒，其包括用於對全血mRNA進行高通量定量的裝置、肝素、低滲緩衝液、和裂解緩衝液。
本發明的另一個方面包括用於對全血mRNA進行高通量定量的完全自動化系統，其包括用於將血樣、低滲緩衝液、和裂解緩衝液施加到裝置中的機械；自動化真空抽吸器和離心機、以及自動化PCR儀。
附圖簡述
圖1是高通量mRNA裝置的部件分解圖。
圖2描繪了高通量mRNA裝置的多孔板，其包括白細胞濾器和固定了寡聚物(dT)的濾孔。
圖3的圖顯示了濾板對新鮮和冷凍血樣的白細胞捕捉效率。
圖4的圖顯示了清洗血樣次數對mRNA定量的影響。
圖5的圖顯示了在細胞裂解之前對濾板的最終處理對mRNA定量的影響。
圖6的圖顯示了裂解緩衝液如何抑制RNA酶。
圖7的圖顯示了用於mRNA定量的逆轉錄酶最佳濃度。
圖8的圖顯示了為了捕捉mRNA用於PCR的cDNA最佳值。
圖9的圖顯示了本發明的雜交動力學。
圖10的圖顯示了每孔所用全血體積與mRNA定量之間的線性關聯。
優選實施方案的詳述本發明能夠分析較大體積的未做任何準備的全血，提供了分析專門由白細胞生成的mRNA的有效方法，消除rRNA和tRNA，提供了一致的mRNA回收，而且易於適應自動化。本發明提供了靈敏的定量系統，其包括使用實時PCR的絕對定量，且可重複性極好，變化係數的範圍為20-25％。
此外，本發明適用於多種疾病對象(表1)。
表1臨床對象
本發明不限於任何具體的機械構造。然而，圖1和2顯示了執行本發明的高通量mRNA定量方法的優選結構。真空箱10構成該結構的基礎。真空箱可以由強度足以承受真空抽吸的任何材料製成；但是，優選一次性使用的塑料。真空箱適於接受真空源以進行真空抽吸12。濾栓(filter plug)14置於真空箱的真空抽吸適配器(adapter)中。真空箱10優選具有凸緣16以配合多孔濾板40，或者任選的多孔支持物20。任選在真空箱上部提供多孔支持物20以支持多孔濾板40。優選由基於矽的橡膠或其它軟塑料製成的密封襯墊30置於多孔支持物上。密封襯墊的上面是多孔濾板40，它包括多個加樣孔46、加樣孔下面的多個白細胞捕捉濾器42、和濾器下面的mRNA捕捉區44。固定的寡聚物(dT)包含於mRNA捕捉區的孔內。
一個優選實施方案涉及對全血mRNA的簡單、可重複、和高通量的定量方法。快速方案將採血後mRNA的二次誘導或降解降至最低，而且96孔濾板和顯微滴定板的使用能夠同時操作96份樣品。流程中的最少操作提供了最小的樣品間差異，變化係數(CV)小於30％，甚至在使用PCR作為定量手段時。
在一個實施方案中，該方法涉及真空箱的製備。在一個優選實施方案中，向真空箱中加入血液封裝物諸如聚丙烯酸聚合物基質(Red Z，Safetec)使血液凝固。然後將多孔支持物置於真空箱中。然後將由基於矽的橡膠或其它軟塑料製成的密封襯墊置於多孔板支持物上。將濾栓(X-6953，60μFilter Plug HDPE，Porex Products Groups)置於真空箱的真空抽吸器適配器中。
在這個實施方案中，該方法涉及濾板的製備。可以使用玻璃纖維膜或白細胞濾膜來捕捉白細胞。為了簡化測定法，使用玻璃纖維膜或白細胞濾膜製成多孔濾板，從而能夠同時處理多份血樣。用於捕捉白細胞的濾器的實例公開於美國專利號4,925,572和4,880,548中，將其公開書收入本文作為參考。白細胞對濾器表面的吸附通常認為是白細胞排除的機制。因為指定重量的纖維的表面積與纖維的直徑成反比，所以預計較細的纖維將具有較大的容量，而且，如果所用纖維的直徑較小，那麼實現期望功效所需要的纖維的數量(以重量計)將較少。包括聚酯類、聚醯胺類、和丙烯酸樹脂在內的許多常用纖維能夠進行輻射接枝，因為在接枝所需要的水平它們對 射線的降解具有適當抵抗力，而且在它們的結構中有單體能夠進行反應。PBT已經成為本發明產品開發中所使用的主要樹脂，而且也是實施例中所使用的樹脂。然而，應當注意，可以找到能夠纖維化且聚集成纖維墊或纖維網的其它樹脂，它們的纖維細至1.5微米或更細，而且在必要時將它們的臨界潤溼表面張力調至最佳範圍後，這些產品可能非常適合於構造效率相同但仍有較少白細胞損耗的裝置。類似的，經過適當處理的玻璃纖維可能可用於製造有效裝置。使用基於PBT的濾器時CD4 mRNA的吸附效率可高達基於玻璃纖維的濾器的4倍。將濾板置於真空箱中。在另一個優選實施方案中，將多層濾膜疊在一起以提高全血的白細胞捕獲量。在一個優選實施方案中，將濾板置於板支持物和密封襯墊上。在另一個優選實施方案中，將濾板用塑料膠帶(Bio-Rad 223-9444)密封，切割膠帶以允許對期望數目的孔進行操作。在另一個優選實施方案中，用低滲緩衝液(200μl，5mM Tris pH7.4)清洗將要加入樣品的每個孔。
該方法優選涉及採集血液，將血液加到多孔濾板中，並除去紅細胞和其它非白細胞成分。在一個優選實施方案中，可以將全血吸入含抗凝劑的血液採集管中，它提高了白細胞過濾效率。抗凝劑肝素在提高白細胞過濾效率方面特別有效。在一個優選實施方案中，可以將血樣冷凍，這消除了破壞mRNA的一些RNA酶。可以用低滲緩衝液清洗孔。一旦將血液加到期望數目的濾板孔中，將血液穿過濾膜過濾。可以通過本領域技術人員知道的任何技術來進行過濾，諸如離心、真空抽吸、或正壓。
在一個特別優選的實施方案中，在將血樣加到濾板孔中之後進行真空抽吸(6cmHg)。將每個孔用低滲緩衝液清洗數次(12次，200μl/次，5mMTris pH7.4)。在另一個優選實施方案中，用乙醇清洗裝有樣品的每個孔(1次，200μl/次，100％乙醇)，這使濾膜乾燥並顯著提高真空抽吸過程中的白細胞捕捉效率。在另一個優選實施方案中，然後施加真空(20cmHg，大於2分鐘)。
該方法涉及細胞裂解和mRNA與mRNA捕捉區中固定的寡聚物(dT)的雜交。為了由捕獲的白細胞釋放mRNA，將裂解緩衝液加到濾板孔中(40μl/孔)，並進行保溫(室溫，20分鐘)。在一個優選實施方案中，將多孔濾板在塑膠袋中密封並離心(IEC MultiRF，2000rpm，4℃，1分鐘)。然後再次加入裂解緩衝液(20μl/孔)，隨後離心(IEC MultiRF，3000rpm，4℃，5分鐘)。然後由離心機中取出多孔濾板，並保溫(室溫，2小時)。
該方法涉及對mRNA的定量，在一個優選實施方案中，需要由mRNA合成cDNA並通過PCR擴增cDNA。在一個優選實施方案中，用裂解緩衝液(150μl/孔，3次，手工)和清洗緩衝液(150μl/孔，3次，手工或BioTek#G4)清洗多孔濾板。然後向多孔濾板中加入cDNA合成緩衝液(40μl/孔，手工或IJ #6)。可以將Axymat(Amgen AM-96-PCR-RD)置於多孔濾板上，然後將它們置於加熱塊(37℃，VWR)上並保溫(大於90分鐘)。然後可以將多孔濾板離心(2000rpm，4℃，1分鐘)。將PCR引物加到384孔PCR板中，並將cDNA由多孔濾板轉移到384孔PCR板中。將PCR板離心(2000rpm，4℃，1分鐘)，並開始實時PCR(TaqMan/SYBER)。
本發明的另一個優選實施方案涉及用於對全血mRNA進行高通量定量的裝置。該裝置包括多孔濾板，其包括多個加樣孔、加樣孔下面的白細胞捕捉濾器、和濾器下面的mRNA捕捉區，它在mRNA捕捉區的孔中包含固定的寡聚物(dT)。為了提高收集白細胞的效率，可以將數層濾膜疊在一起。將多孔板安置於真空箱上，後者適於接受板並在多孔板與真空箱之間形成密封。在裝置的一個優選實施方案中，真空箱適於接受真空源以進行真空抽吸。在另一個優選實施方案中，將多孔支持物置於真空箱中，位於多孔濾板的下面。在裝置的另一個優選實施方案中，將可以由諸如基於矽的橡膠等軟塑料製成的密封襯墊插入多孔支持物與多孔濾板之間。
另一個優選實施方案涉及用於對全血mRNA進行高通量定量的試劑盒。該試劑盒包括用於對全血mRNA進行高通量定量的裝置；含肝素的血液採集管；低滲緩衝液；和裂解緩衝液。
另一個優選實施方案涉及用於對全血mRNA進行高通量定量的完全自動化系統，其包括用於將血樣、低滲緩衝液、和裂解緩衝液施加到裝置中的機械；自動化真空抽吸器和離心機、以及自動化PCR儀。
實施例測試了本發明方法的多個方案，並用於對全血β-肌動蛋白mRNA和CD4mRNA的定量。
測試了三種抗凝劑ACD、EDTA、和肝素，其中肝素導致最高百分比的白細胞保持。儘管Leukosorb膜已經在輸血中用於ACD血液，然而甚至在同時使用四層膜時，仍有大約15-40％的白細胞穿膜。測試了EDTA血液；發現容量和白細胞保持與ACD相似。然而，最值得注意的是，肝素血液中100％的白細胞被捕獲在Leukosorb膜上。100％的由肝素血液捕獲白細胞顯示了本發明mRNA定量的可靠性。這些數據指示肝素血液的使用最適於mRNA的精確定量，而ACD血液可用於需要較大體積血液和較少定量結果的應用。
比較了使用冷凍與新鮮血樣得到的結果。如圖3所示，由新鮮血液滲漏細胞回收的CD4 mRNA多於冷凍樣品的滲漏細胞。
與基於PBT的濾膜的保持值相比，還檢查了玻璃纖維濾器的全血保持效率。如表2所示，玻璃纖維膜只接受40μl全血，甚至在用低滲緩衝液(50mM Tris pH7.4)清洗濾膜以脹裂紅細胞時。然而，如表2所示，Leukosorb濾器接受的全血量顯著多於玻璃纖維濾器。
表2由全血擴增β-肌動蛋白mRNA
AACD；EEDTA；H肝素(A、H)表示實驗中所使用的抗凝劑CT極限循環(threshold cycle)CV變化係數進行了不同次數的低滲緩衝液清洗以除去紅細胞和其它血液成分。如圖4所示，用低滲緩衝液清洗樣品至少3次後捕獲的CD4 mRNA量多於不進行清洗的兩倍。圖4還顯示了用低滲緩衝液清洗血液12次導致捕獲的mRNA最多。另外，在最終CD4 mRNA定量方面比較了通過對血液抽真空、離心、和乙醇清洗及隨後抽真空來收集白細胞的多種方法。圖5顯示了儘管真空抽吸的CD4 mRNA定量優於離心，然而在真空抽吸之前用乙醇清洗血樣生成的mRNA最多。
一旦在玻璃纖維或Leukosorb膜上捕獲白細胞，進行不同次數的低滲緩衝液清洗以除去紅細胞和其它血液成分。為了由捕獲的白細胞釋放mRNA，將裂解緩衝液(RNAture)加到濾板上(40μl/孔)，並將板於室溫保溫20分鐘。在一個優選實施方案中，裂解緩衝液中包含擴增引物。圖6顯示了裂解緩衝液在抑制RNA酶中發揮重要作用；嗜曙紅細胞充滿RNA酶，它們被裂解緩衝液滅活。然後將多孔濾板在塑膠袋中密封並離心(IECMultiRF，2000rpm，4℃，1分鐘)。然後再次加入裂解緩衝液(20μl/孔)，隨後離心(IEC MultiRF，3000rpm，4℃，5分鐘)。然後由離心機中取出多孔濾板，並於室溫保溫2小時，使得多聚物(A)+RNA尾與固定的寡聚物(dT)雜交。然後用150μl裂解緩衝液清洗多孔濾板3次以消除殘餘的核糖核酸酶，隨後用150μl清洗緩衝液(BioTek #G4)清洗3次以消除裂解緩衝液，後者包含cDNA合成的一些抑制劑。
最後一次清洗後，由多孔濾板完全清除清洗緩衝液，並向每個孔中加入40μl預先混合的cDNA緩衝液以合成cDNA。cDNA緩衝液的組成如下5x第一條鏈緩衝液(Promega M531A，10mM dNTP(Promega儲液，20x))、引物(5μM，#24)、RNA酶抑制劑(Promega N211A，40U/μl)、M-MLV逆轉錄酶(Promega M170A，200U/μl)、和DEPC水。圖7顯示了用於mRNA定量的MMLV最佳濃度是0.25單位/孔。
將Axymat(Amgen AM-96-PCR-RD)置於多孔濾板上，然後將它們置於加熱塊(37℃，VWR)上並保溫(大於90分鐘)。然後將多孔濾板離心(2000rpm，4℃，1分鐘)。將PCR引物加到384孔PCR板中，並將cDNA由多孔濾板轉移到384孔PCR板中。圖8顯示了用於PCR的cDNA最佳值是大約2μl/孔。將PCR板離心(2000rpm，4℃，1分鐘)，並開始實時PCR(TaqMan/SYBER)。本發明的方法具有高mRNA特異性；TaqMan qPCR對CD4mRNA的擴增導致無法檢測的DNA汙染(小於10拷貝/孔)。
如圖9所示，本發明導致mRNA定量的變化係數較低。兩個小時的雜交導致變化係數小於13％，比較而言，mRNA定量的傳統變化係數是大約300％。此外，如圖10所示，線性結果顯示mRNA捕獲量與每孔所用全血體積成正比，使得本發明成為mRNA定量的可靠且可重複方法。
權利要求
1.一種對全血中特定mRNA進行高通量定量的方法，包括下列步驟(a)採集全血；(b)通過過濾由所述全血除去紅細胞和白細胞以外的血液成分以在濾膜上產生白細胞；(c)裂解濾膜上的白細胞以生成包含mRNA的裂解物；(d)將所述裂解物轉移到固定了寡聚物(dT)的板上以捕捉mRNA；和(e)對特定mRNA進行定量。
2.權利要求1的方法，其中在採集白細胞之前將抗凝劑施用於所述全血。
3.權利要求1的方法，其中在採集白細胞之前將肝素施用於所述全血。
4.權利要求1的方法，其中在過濾之前將所述全血冷凍。
5.權利要求1的方法，其中將所述濾膜附著於多孔濾板。
6.權利要求1的方法，其中所述濾膜是PBT纖維膜。
7.權利要求5的方法，其中在疊在一起的多層濾膜上捕捉所述白細胞。
8.權利要求1的方法，還包括用低滲緩衝液清洗所述濾膜上的白細胞以進一步除去紅細胞和其它血液成分。
9.權利要求8的方法，還包括將所述濾膜乾燥。
10.權利要求9的方法，其中用乙醇清洗所述濾膜並進行真空抽吸直至所述濾膜乾燥。
11.權利要求1的方法，其中所述固定的板包括固定了寡聚物(dT)的多孔板。
12.權利要求1的方法，其中將所述裂解物轉移到固定了寡聚物(dT)的板包括離心。
13.權利要求1的方法，其中將所述裂解物轉移到固定了寡聚物(dT)的板包括真空抽吸。
14.權利要求1的方法，其中將所述裂解物轉移到固定了寡聚物(dT)的板包括施加正壓。
15.權利要求1的方法，其中對mRNA的定量包括特定mRNA的cDNA合成和得到的cDNA的擴增。
16.權利要求1的方法，其中定量的mRNA是-肌動蛋白mRNA。
17.權利要求1的方法，其中定量的mRNA是CD4 mRNA。
18.權利要求1的方法，其中將涉及白血病的易位基因的mRNA定量。
19.權利要求1的方法，其中將微轉移癌症的癌特異基因的mRNA定量。
20.權利要求1的方法，其中將來自受感染白細胞的病毒衍生mRNA定量。
21.權利要求20的方法，其中定量的病毒衍生mRNA是HIV。
22.權利要求21的方法，其中對HIV mRNA的定量用於診斷HIV。
23.權利要求20的方法，其中定量的病毒衍生mRNA是CMV。
24.權利要求23的方法，其中對病毒衍生mRNA的定量用於診斷CMV。
25.權利要求20的方法，其中對病毒衍生mRNA的定量用於對血庫監測病毒病的存在。
26.權利要求20的方法，其中對病毒衍生mRNA的定量用於研究抗病毒藥物靈敏度。
27.權利要求1的方法，其中將涉及白血病的凋亡基因的mRNA定量。
28.權利要求1的方法，其中將細胞因子的mRNA定量。
29.權利要求1的方法，其中對mRNA的定量用於測試抗癌藥物對白細胞的副作用。
30.權利要求1的方法，其中將DNA修復基因的mRNA定量。
31.權利要求30的方法，其中對DNA修復基因mRNA的定量用於測試DNA修復基因對輻射的靈敏度。
32.權利要求1的方法，其中將變態反應基因的mRNA定量。
33.權利要求32的方法，其中對變態反應基因mRNA的定量用於測試變應原刺激。
34.權利要求1的方法，其中將由供體細胞介導的細胞因子的mRNA定量。
35.權利要求34的方法，其中對由供體細胞介導的細胞因子的mRNA的定量用於測試移植排斥。
36.一種高通量mRNA定量裝置，其包括(a)多孔板，所述多孔板包括i)多個加樣孔；ii)所述孔下面的白細胞捕捉濾器；iii)所述濾器下面的mRNA捕捉區，所述mRNA捕捉區具有固定其上的寡聚物(dT)；和(b)真空箱，其適於接受所述板而在所述板與所述箱之間形成密封。
37.權利要求36的裝置，所述真空箱適於接受真空源。
38.權利要求36的裝置，所述真空箱由塑料製成。
39.權利要求36的裝置，其中所述密封包括置於多孔板下面的基於塑料的襯墊。
40.權利要求36的裝置，其中將多孔支持物插入所述真空箱與多孔板之間。
41.權利要求36的裝置，其中在層疊在一起的多層濾膜上捕捉白細胞。
42.一種高通量mRNA定量試劑盒，其包括(a)權利要求36的高通量mRNA定量裝置；(b)低滲緩衝液；(c)乙醇；和(d)裂解緩衝液。
全文摘要
本發明公開了對全血mRNA的簡單、可重複、和高通量定量的方法、裝置、試劑盒、和自動化系統。更具體的說，該方法、裝置、試劑盒、和自動化系統涉及附著於固定了寡聚物(dT)的多孔板的白細胞濾器的聯合體。
文檔編號C12Q1/68GK1650027SQ03809293
公開日2005年8月3日 申請日期2003年4月24日 優先權日2002年4月24日
發明者三橋將人 申請人:日立化成研究中心公司, 日立化成工業株式會社