用於治療癌症的溶瘤腺病毒的製作方法

2023-09-17 09:29:00 1

專利名稱：用於治療癌症的溶瘤腺病毒的製作方法
技術領域：
本發明涉及醫學領域，更具體來說涉及腫瘤學領域、特別是病毒療法領域。
背景技術：
當前的癌症治療主要是基於化療、放療和手術。儘管早期階段的癌症治癒率提高，但大多數癌症晚期病例不能治癒，因為它們不能通過手術根除，或者因為施用的放療或化療劑量受到它們在正常細胞中的毒性的限制。為了緩和這種形勢，已經開發了設法增加腫瘤治療的效力和選擇性的生物技術策略。其中，基因療法和病毒療法以對抗癌症的治療意圖使用病毒。在基因療法中，對病毒進行修飾以阻止其複製並用作治療性遺傳物質的介質或載體。相反，病毒療法使用在腫瘤細胞中選擇性複製和繁殖的病毒。在病毒療法中，腫瘤細胞因病毒在其內部複製所引起的細胞病變效應而不是被治療性基因的效應而死亡。在腫瘤細胞中的優先複製被稱為親瘤性(oncotropism)，腫瘤的溶胞被稱為溶瘤作用 (oncolysis)。在嚴格意義上，在腫瘤中選擇性複製的病毒被稱為溶瘤的，儘管在廣義上溶瘤這個詞可用於能夠溶解腫瘤細胞的任何具有複製能力的病毒，即使沒有選擇性。在本說明書中，術語溶瘤以這兩種意義使用。癌症的病毒療法早於基因療法。使用病毒治癒腫瘤的第一次觀察可以追溯到上世紀初。在1912年，De I^ce在將狂犬病病毒接種到宮頸癌中之後，獲得了腫瘤消退。從那時起，已經將許多類型的病毒注射到腫瘤中用於它們的治療。存在著表現出天然親瘤性的病毒，例如自主性細小病毒、水皰性口膜炎病毒和呼腸弧病毒。其他病毒可以被遺傳操作以在腫瘤中選擇性複製。例如，通過消除核糖核苷酸還原酶基因這種在活躍增殖的細胞例如腫瘤細胞中非必需的酶活性，已將單純性皰疹病毒(HSV)變成親瘤性的。然而，由於其低致病性和感染腫瘤細胞的高能力，腺病毒已成為在癌症的病毒療法和基因療法中更經常使用的病毒。已經鑑定到51種腺病毒的人類血清型，並將其分類成從A至F的6個不同組。屬於C組的人類腺病毒5型(Ac^)是由二十面體蛋白質衣殼包裝了 36千鹼基的線性DNA所形成的病毒。在成年人中，Ad5感染通常是無症狀的，在兒童中，它引起普通感冒和結膜炎。一般來說，Ad5感染上皮細胞，在自然感染過程中是支氣管上皮的細胞。它利用纖維、即從衣殼的12個頂點如天線般伸出的病毒蛋白與參與細胞間黏附的被稱為柯薩奇-腺病毒受體(CAR)的細胞蛋白的相互作用而進入細胞。當病毒DNA到達核內部，它開始病毒早期基因(El至E4)的有序轉錄。表達的第一個病毒基因是早期區IA(ElA)的基因。ElA 與細胞蛋白Rb結合以釋放E2F，後者激活其他病毒基因例如E2、E3和E4以及激活細胞周期的細胞基因的轉錄。另一方面，ElB與p53結合以激活細胞周期並阻止被感染細胞的凋亡。 E2編碼參與病毒複製的蛋白；E3編碼抑制抗病毒免疫應答的蛋白；E4編碼參與病毒RNA運輸的蛋白。早期基因的表達導致病毒DNA的複製，並且一旦DNA複製，主要晚期啟動子被激活並驅動信使RNA轉錄，在差異剪接後產生編碼形成衣殼的結構蛋白的所有RNA。關於溶瘤腺病毒的設計，需要考慮兩個重要方面選擇性和效力。為了獲得對腫瘤細胞的選擇性，使用了三種策略消除在正常細胞中複製所需但在腫瘤細胞中不需要的病毒功能；使用腫瘤選擇性啟動子控制啟動複製的病毒基因；以及對參與宿主細胞感染的病毒衣殼蛋白進行修飾。使用這些遺傳修飾，已獲得相當高水平的選擇性，其中在腫瘤細胞中的複製效率比在正常細胞中的複製效率高出10000倍左右。對於溶瘤效力來說，也已描述了用於增加它的幾種遺傳修飾。這些修飾包括a)增加病毒釋放，例如通過消除E1B19K、過表達E3-11.6K(ADP)或將E3/19K蛋白定位在胞質膜中；以及b)將治療性基因插入到溶瘤腺病毒的基因組中以產生「武裝的溶瘤腺病毒」。在這種情況下，治療性基因必須通過活化具有旁觀者效應的前體藥物(也就是說，它們殺死未感染的鄰近細胞)、活化針對腫瘤的免疫系統、誘導凋亡、抑制血管發生或消除細胞外基質等，來介導未感染的腫瘤細胞的死亡。 在這些情況下，治療性基因的表達方式和時間對於治療方法的最終結果是至關重要的。在最近十年中，已將不同溶瘤腺病毒給藥於患有頭頸癌、卵巢癌、結腸直腸癌、胰腺癌和肝細胞癌等的患者。這些腺病毒在臨床試驗中的安全性情況是非常有希望的。檢測到的不良作用例如流感樣症狀和轉氨酶水平升高有良好的耐受性，即使是在高劑量病毒全身性給藥後(可參見D. Ko等，「在轉錄上受調控的溶瘤腺病毒的開發(Development of transcriptionally regulated oncolytic adenoviruses)，，，Oncogene 2005，vol· 24， pp. 7763-74 ；以及Τ. Reid等，「癌症患者中的腺病毒血管內藥劑來自臨床試驗的經驗 (adenoviral Intravascular agents in cancer patients lessons from clinical trials)」，Cancer Gene Therapy 2002，vol. 9，pp. 979-86)。儘管重組腺病毒的給藥引起腫瘤生長的部分抑制，但沒有實現腫瘤的完全根除，並且在短時期後腫瘤重新快速生長。發生這些結果可能是因為被注射的腺病毒僅分布在一小部分腫瘤中，從而產生有限的抗腫瘤反應，而未感染細胞繼續快速生長。在最近的工作中，觀察到溶瘤腺病毒在人類異體移植腫瘤中的複製持續到全身給藥後100天，儘管這種複製沒有轉變成腫瘤的完全根除(可參見H. Sauthoff等，「野生型腺病毒在人類異體移植腫瘤局部注射後的腫瘤內擴散受限病毒在晚其月時間點留存並全身擴散(Intratumoural spread of wild-type adenovirus is limited to after local injection of human xenograft tumours :virus persists and spreads systemically at late time points)，，，Human Gene Therapy 2003, vol. 14, PP. 425-33)。這種低的抗腫瘤效率部分是因為腫瘤中的結締組織和細胞外基質(ECM)阻止了腺病毒在腫瘤內的擴散。溶瘤腺病毒這種在腫瘤團塊中有效擴散的困難性對於其他抗腫瘤藥物例如阿黴素、紫杉醇、長春新鹼或氨甲蝶呤來說也有描述。許多研究證實了 ECM在腫瘤細胞對化療藥物的抗性中的作用(可參見BP Toole等，「透明質烷癌細胞化療抗性和惡性的組成型調
(Hyaluronan -.a constitutive regulator of chemoresistance and malignancy in cancer cells)Seminars in Cancer BioIory 2008, vol. 18，pp. 244-50)。腫瘤和基質細胞產生並組裝膠原蛋白、蛋白聚糖和其他分子構成的基質，其使大分子向腫瘤內的運輸變得困難。透明質酸(HA)是參與腫瘤細胞對治療性藥物的抗性的ECM的主要組分之一。HA 在各種各樣的惡性組織中過表達，並且在許多情況下HA的水平是腫瘤發展的預後因子。HA 與受體CD44和RHAMM的相互作用增加了腫瘤存活和浸潤。此外，HA能夠通過誘導細胞黏附和遷移並抵禦免疫系統來促進腫瘤轉移。另一方面，抑制透明質酸與腫瘤細胞之間的相互作用逆轉了對許多藥物的抗性。不同研究指出，在患有黑素瘤、卡波斯肉瘤、頭頸腫瘤和結腸癌的肝轉移腫瘤的患者中，透明質酸酶(降解HA的酶)增加了不同化療的活性。透明質酸酶的作用機制仍然未知，但是一般來說它被歸因於降低細胞黏附屏障、降低間質壓力和提高抗腫瘤藥物在腫瘤中的穿透性，而不是歸因於它對與細胞存活相關的信號傳導途徑的抑制效應。最近，已經描述利用腫瘤內注射進行透明質酸酶和溶瘤腺病毒共同給藥降低了腫瘤發展(可參見S. Ganesh等，「透明質酸酶和溶瘤腺病毒的腫瘤內共同給藥在轉移腫瘤模 M中ii^li了^) ；力(Intratumoural coadministration of hyaluronidase enzyme and oncolytic adenoviruses enhances virus potency in mestastasic tumour models)」， Clin Cancer Res 2008，vol. 14，pp. 3933-41)。在這些研究中，溶瘤腺病毒在四次腫瘤內注射中給藥，透明質酸酶在整個治療期間每隔一日腫瘤內給藥。這種給藥方案對患者不太適用，因為大多數腫瘤做不到進行腫瘤內注射。患有散發疾病(轉移腫瘤)的患者不能從 Ganesh和合作者提出的治療中獲益。儘管到目前為止所做的努力，但仍需要發現在癌症治療中有效的新的治療方法。發明概述本發明人發現，複製並在其基因組中含有透明質酸酶基因的腺病毒在腫瘤團塊中被更加有效地分配。溶瘤腺病毒表達透明質酸酶引起作為腫瘤的細胞外基質的一部分的透明質酸降解。透明質酸的降解在腫瘤中產生較低的間質壓力和腫瘤對腺病毒擴散的較小阻力，因此提高了病毒在腫瘤團塊內的細胞到細胞擴散。這種更好的擴散被轉變成溶瘤效果的增加。本發明人發現，靜脈內注射本發明的溶瘤腺病毒獲得了腫瘤體積的消退。因此，本發明的溶瘤腺病毒可用於癌症的治療。此外，透明質酸酶基因的表達既不影響病毒複製也不影響溶瘤腺病毒的細胞毒性。正如前面提到的，已描述了溶瘤腺病毒和可溶性透明質酸酶的腫瘤內共同給藥增加了溶瘤腺病毒的抗腫瘤效能。然而，在本發明之前，尚未將透明質酸酶基因導入任何溶瘤腺病毒中用於治療癌症。正如在實施例中所述，本發明的溶瘤腺病毒的體內腫瘤內給藥，相對於未插入透明質酸酶的腺病毒對照提高了抗腫瘤效果(參見圖7)。值得注意的是，當本發明的溶瘤腺病毒靜脈內注射時(參見圖8和圖9)，與Ganesh等的文稿的圖2中所示結果相比，使用本發明的腺病毒觀察到了高得多的腫瘤生長抑制。這表明本發明的治療更加有效。使用本發明的溶瘤腺病毒(IC0WR17)注射的小鼠腫瘤與用腺病毒對照IC0WR15注射的腫瘤相比， 顯示出非常大範圍的壞死區域，區域具有較少活細胞以及許多大的病毒複製中心。此外，使用本發明的腺病毒，給藥劑量較小在Ganesh等(同上)中，給藥四次 IxIOici個病毒粒子的腫瘤內注射，而在本發明中，給藥單次^clO9個病毒粒子的靜脈內劑量。這意味著劑量降低20倍以及單次給藥的優勢。在他們的方法中，Ganesh等在整個實驗中，每隔一日腫瘤內給藥透明質酸酶。此外，也在治療開始時腫瘤內給藥腺病毒。病毒和透明質酸酶的這種腫瘤內給藥幾乎不適用於臨床，因為大多數腫瘤做不到進行腫瘤內給藥。據推測，透明質酸酶和腺病毒的可溶性共同給藥不能通過全身途徑來進行，因為這兩種組分一起到達生物體中散在的腫瘤細胞的可能性低。本發明允許在病毒複製發生的位點和時刻表達透明質酸酶。透明質酸酶的這種表達改進了病毒在腫瘤團塊中的分布並增加其抗腫瘤效力。將調整過的對動物無毒並具有極大治療效能的劑量進行給藥是可行的。在本發明中，溶瘤腺病毒到達靶腫瘤細胞。一旦進入後，病毒複製，表達其衣殼蛋白，並且在同時表達腺病毒基因組中編碼的透明質酸酶。該透明質酸酶已被修飾成釋放到細胞周圍的細胞外介質中。在細胞外介質中，透明質酸酶破壞基質並協助已經複製的腺病毒感染鄰近的腫瘤細胞。因此，本發明的一個方面涉及包含在其基因組中插入的編碼透明質酸酶的序列的溶瘤腺病毒。當在本文中使用時，術語「溶瘤腺病毒」是指在腫瘤細胞中能夠複製或者有複製能力的腺病毒。在本說明書中，溶瘤腺病毒和複製型腺病毒是同義詞。它們與非複製型腺病毒不同，因為後者不能在靶細胞中複製。非複製型腺病毒是在基因療法中用作針對靶細胞的基因的載體的腺病毒，因為目的是在完整細胞內表達治療性基因而不是裂解細胞。相反， 溶瘤腺病毒的治療作用是基於複製和裂解靶細胞、特別是待消除的腫瘤細胞的能力。本發明的另一方面涉及包含治療有效量的溶瘤腺病毒與可藥用載體或賦形劑在一起的藥物組合物。本發明的另一方面涉及本發明的溶瘤腺病毒作為藥物的應用。本發明的另一方面涉及本發明的溶瘤腺病毒用於在哺乳動物包括人類中治療癌症或癌症的惡變前形式。本發明的另一方面涉及溶瘤腺病毒的應用，其用於製造在哺乳動物包括人類中治療癌症或癌症的惡變前形式的藥物。治療是基於這些溶瘤腺病毒在腫瘤中的複製。或者， 本發明的這一方面可以設計成用於在哺乳動物包括人類中治療癌症或癌症的惡變前形式的方法，其包含向所述哺乳動物給藥有效量的溶瘤腺病毒。本發明的另一方面涉及能夠與腺病毒基因組重組以構建本發明的溶瘤腺病毒的穿梭載體。這種載體包含腺病毒的反向的、末端重複的序列(「反向末端重複序列」，ITR)、 促進透明質酸酶編碼序列的表達的序列、編碼該酶的序列以及聚腺苷化序列。在具體實施方案中，本發明的溶瘤腺病毒是人類腺病毒，意味著其感染人類。具體來說，人類腺病毒選自人類腺病毒血清型1-51及其衍生物。「衍生物」是指來自腺病毒的兩種或多種不同血清型、例如腺病毒血清型5與腺病毒血清型3的纖維的重組腺病毒雜合體。 在本發明的具體實施方案中，人類溶瘤腺病毒來自於血清型5。透明質酸酶是降解透明質酸的酶家族。在人類中，存在編碼具有不同性質和位置的透明質酸酶的6個基因。同工型Hyall和Hyal2存在於大多數組織中。Hyall是人類血漿中的優勢形式。Hyal3存在於骨髓和睪丸中，但是其功能還沒有被良好地表徵。透明質酸酶PH20在睪丸中高表達，並參與卵母細胞被精子受精的過程。透明質酸酶PH20錨定於精子的胞質膜和內部頂體膜，並賦予精子穿透卵丘的細胞外基質(富含透明質酸)以到達卵母細胞的透明帶的能力。在頂體反應期間，錨定於精子膜上的透明質酸酶部分受到酶的加工，產生從頂體膜釋放的可溶形式的蛋白。此外，透明質酸酶已被鑑定為是蛇、蜘蛛、蠍子和黃蜂毒素的擴散因子。在具體實施方案中，透明質酸酶是哺乳動物睪丸透明質酸酶，更具體是人類睪丸透明質酸酶。人類睪丸透明質酸酶(GenBank GeneID :6677)也被稱為SPAMl或精子黏附分子1和PH-20。膜蛋白PH20是哺乳動物透明質酸酶家族中唯一在中性pH下具有活性的酶。編碼它的基因產生兩種轉錄變體變體1，較長，其編碼蛋白的同工型KGenBank登記號NP_003108. 2)，以及變體2，其使用3』編碼區處與變體1不同的剪接信號，產生具有較短 C-端的同工型2 (GenBank登記號NP_694859. 1)。在本發明的具體實施方案中，該酶序列缺失了對應於羧基端膜結合結構域的序列，以產生可溶性酶(參見圖幻。該羧基端結構域的缺失導致透明質酸酶分泌到細胞外介質。因此，獲得了表達在中性PH下具有酶活性的分泌性透明質酸酶的溶瘤腺病毒。在具體實施方案中，插入到腺病毒基因組中的序列是編碼SEQ ID NO :1的序列。在更具體實施方案中，插入的序列是SEQ ID NO :2ο在另一個實施方案中，酶序列被插入在溶瘤腺病毒中腺病毒纖維的核苷酸序列之後。在另一個具體實施方案中，酶的表達受到在動物細胞中有活性的啟動子的控制。 具體來說，啟動子選自細胞巨細胞病毒啟動子、腺病毒主要晚期啟動子、SV40啟動子、單純性皰疹病毒胸苷激酶啟動子、RSV啟動子、EFl α啟動子、β -肌動蛋白啟動子、人類IL-2啟動子、人類IL-4啟動子、IFN啟動子、E2F啟動子和人類GM-CSF啟動子。控制酶表達的啟動子可以是腺病毒的天然啟動子，正如腺病毒主要晚期啟動子的情況(參見圖l(a)，MLP，「主要晚期啟動子」)。啟動子也可以緊挨編碼酶的序列插入。在優選實施方案中，啟動子是腺病毒主要晚期啟動子。本發明的複製型腺病毒可以在其基因組序列中具有使其在腫瘤細胞中選擇性複製的修飾。在具體實施方案中，這通過插入組織特異性啟動子或腫瘤特異性啟動子來實現。 該啟動子控制Ela、Elb、E2和E4中的一個或多個基因的表達。具體來說，啟動子選自E2F 啟動子、端粒酶hTERT啟動子、酪氨酸酶啟動子、前列腺特異性抗原(PSA)啟動子、甲胎蛋白啟動子、C0X-2啟動子，以及由幾種轉錄因子結合位點例如缺氧誘導因子(HIF-I) ,Ets轉錄因子、腫瘤細胞毒性因子(tcf)、E2F轉錄因子或Spl轉錄因子的結合位點形成的人工啟動子。優選，啟動子控制Ela的表達。在腫瘤中獲得選擇性複製的另一種修飾是對阻斷視網膜母細胞瘤(RB)途徑的 ElA功能的消除。與pRB直接相互作用的其他病毒基因例如E4和E4orf6/7，是可以被消除以在腫瘤中獲得選擇性複製的候選物。如實施例中所示，溶瘤腺病毒IC0WR17的特徵在於同時包含透明質酸酶基因、影響Ela與pRB的相互作用的Δ 24缺失、在Ela的內源啟動子中插入4個E2F1結合位點和1個Spl結合位點以控制Ela的表達，以及最後在腺病毒纖維中插入RGD肽以增加病毒的染性。IC0WR17是本發明的優選實施方案。用於在腫瘤中獲得選擇性複製的另一種描述過的修飾是消除編碼病毒相關 RNA(VA-RNA)的腺病毒基因。這些RNA阻斷幹擾素的抗病毒活性，並且當缺失時，腺病毒變得對幹擾素引起的抑制敏感。因為腫瘤細胞的特徵在於截斷幹擾素途徑，因此這樣的腺病毒在腫瘤中以正常水平複製。因此，在另一個具體實施方案中，使用選自腺病毒的Ela、Elb、 E4和VA-RNA的一個或多個基因中的突變來獲得在腫瘤中的選擇性複製。優選，突變在Ela 中。這兩種在腫瘤中獲得選擇性複製的策略彼此不排斥。在本發明的另一個實施方案中，腺病毒在其衣殼上具有修飾以增加其侵染性或將其導向腫瘤細胞中存在的受體。在優選實施方案中，對腺病毒衣殼蛋白進行遺傳修飾，以包含增加侵染性或將病毒導向腫瘤細胞中的受體的配體。將腺病毒靶向腫瘤，也可以使用一側結合病毒而另一側結合腫瘤受體的雙功能配體來實現。另一方面，為了增加腺病毒在血液中的持久性並因此增加到達散在腫瘤結節的可能性，可以將衣殼用聚合物例如聚乙二醇覆蓋。在優選實施方案中，溶瘤腺病毒具有通過用RGDK結構域代替腺病毒纖維中的KKTK 硫酸乙醯肝素結合結構域進行修飾、以增加其侵染性或將其更好地導向靶細胞的衣殼。在實施例中解釋了具有這些特性的腺病毒IC0WR17RGDK的構建。在另一個具體實施方案中，腺病毒包含對透明質酸酶編碼序列的蛋白翻譯進行優化的序列。在另一個具體實施方案中，腺病毒包含促進透明質酸酶編碼序列的表達的序列。 更具體來說，該序列選自允許加工RNA的剪接序列、IRES序列(「內部核糖體進入位點」) 和小核糖核酸病毒的2A序列。在另一個具體實施方案中，溶瘤腺病毒包含插入在其基因組中的、在癌症基因療法領域中常用於增加溶瘤腺病毒對腫瘤細胞的細胞毒性的其他基因。它們中的一些是胸苷激酶基因、胞苷脫氨酶基因、促凋亡基因、免疫刺激基因、腫瘤抑制基因或藥物前體活化基因。腺病毒基因組中的這些修飾彼此不排斥。有幾種操作腺病毒基因組的方法。構建遺傳修飾的腺病毒的方法在使用腺病毒的基因療法和病毒療法領域中是明確建立的。更常用的方法是基於首先在含有待修飾的腺病毒區域的質粒中構建所需遺傳修飾，隨後在細菌中用含有病毒基因組其餘部分的質粒進行同源重組。將含有本發明的透明質酸酶目的基因的腺病毒，在基因療法和病毒療法領域中常用的細胞系例如HEK-293和A549細胞系中進行繁殖和擴增。繁殖的優選方法是對允許腺病毒複製的細胞系進行感染。肺腺癌細胞系A549是具有這樣特性的細胞系的實例。繁殖以例如下列方式進行將A549細胞接種在塑料的細胞培養板上，並使用每個細胞100個病毒粒子進行感染。兩天後，作為反映病毒生產的細胞病變效應，觀察細胞成簇和變圓。將細胞收穫在試管中。以IOOOg離心5分鐘後，將細胞沉澱凍融三次以破碎細胞。將得到的細胞提取物以IOOOg離心5分鐘，並將帶有病毒的上清液負載到氯化銫梯度上，並以35000g 離心1小時。將從梯度獲得的病毒帶負載到另一個氯化銫梯度上，並再次以35000g離心16 小時。收穫病毒帶並對PBS-10%甘油進行透析。將透析過的病毒分成等份並保存在-80°C。 病毒粒子數量和空斑形成單位的定量按照標準方案來進行。含有5%甘油的磷酸鹽緩衝鹽水(PBQ是用於儲存腺病毒的標準製劑。然而，已經描述了提高病毒穩定性的新製劑。為了其在癌症治療中的使用，含有透明質酸酶基因的腺病毒的純化方法與對癌症的病毒療法和基因療法中使用的其他腺病毒和腺病毒載體所描述的純化方法相同。本發明的溶瘤腺病毒可以給藥於哺乳動物、優選為人類。給藥溶瘤腺病毒的目的是治療包括但不限於黑素瘤、胰腺癌、結腸癌和肺癌。此外，考慮到了在腫瘤的惡變前期給藥溶瘤腺病毒。應該理解，溶瘤腺病毒以可藥用形式給藥。本技術領域的專業人員可以使用標準程序確保適合的劑量。應該理解，劑量必須是在被治療患者中產生腫瘤減小的溶瘤腺病毒的有效量。病毒可以直接給藥到腫瘤中、腫瘤所處的體腔中、腫瘤的血管系統中、腫瘤周圍， 或全身性靜脈內注射到患者中。優選，給藥是全身性的。
使用本發明中描述的病毒治療癌症的方案與使用腺病毒的病毒療法和使用腺病毒的基因療法領域中所使用的程序相同。在基因療法領域中使用非溶瘤和溶瘤腺病毒有大量經驗。有許多出版物描述了在培養物中、動物模型中以及對患者的臨床試驗中治療腫瘤細胞。對於體外培養物中的細胞治療來說，向培養基加入通過上述任何製劑純化的腺病毒以獲得腫瘤細胞的感染。為了治療動物模型或患者中的腫瘤，腺病毒可以通過注射到腫瘤中或腫瘤所處的體腔中進行局部區域性給藥，或通過注射到血流中進行全身給藥。本發明的溶瘤腺病毒可以單獨或在與可藥用載體或賦形劑的組合物中給藥。本技術領域的專業人員將會根據具體給藥方式調整組合物。組合物可以包含溶瘤腺病毒作為唯一抗腫瘤劑，或者與另一種治療劑例如化療藥物或帶有插入的治療性基因的載體相組合。 此外，溶瘤腺病毒療法也可以與放療相組合。除非另有指明，否則本文中使用的所有技術和科學術語與本技術領域的普通專業人員所通常理解的意義相同。與本文中所述的相似或等效的方法和材料，可用於本發明的實踐中。在整個說明書和權利要求書中，單詞「包含」及其變化形式不打算排除其他技術特點、添加齊U、組分或步驟。對於本技術領域的專業人員來說，本發明的其他目的、優點和特點在細查說明書後將變得明顯，或者可以通過本發明的實踐來學到。提供了下面的具體實施方案和圖作為說明，它們不打算對本發明進行限制。附圖描述

圖1(a)顯示了以含有並表達透明質酸酶基因PH20為特徵的溶瘤腺病毒的結構。 腺病毒AdwtRGD-PH20含有插入到腺病毒纖維基因之後的蛋白PH20的基因。通過將腺病毒的剪接受體IIIa(SA)插入到蛋白PH20基因之前，蛋白PH20基因的表達受到腺病毒主要晚期啟動子(MLP)的調控。由於在翻譯起始序列之前引入kozak序列(k)，該基因的蛋白質翻譯被優化。腺病毒IC0WR15和IC0WR17是腫瘤選擇性複製的腺病毒。它們的特徵在於在 Ela的內源啟動子中含有4個E2F結合位點和1個Spl結合位點。這兩種病毒還存在其中插入了 RGD-4C肽的修飾形式的病毒纖維，以及其中多肽鏈的121-1 位胺基酸被缺失(ΔΜ 突變)的突變形式的ElA蛋白。此外，IC0WR17含有如AdwtRGD-PH20腺病毒中所插入的透明質酸酶PH20基因。(b)顯示了插入在腺病毒Ad Δ MR⑶中代替419至422位核苷酸序列的序列。實行這種插入以插入4個E2F-1因子結合位點和1個Spl因子結合位點。標為 "nt 385-419」和「nt 422-461 」的下劃線序列對應於Ad Δ MRGD的野生型。(c)就IC0VIR15 和AdwtRGD基因組而言，顯示了插入到IC0VIR17和AdwtRGD-PH20基因組中的完整盒(SEQ ID NO 4)。標出了剪接受體IIIa、k0Zak和聚腺苷化(polyA)序列。蛋白PH20的編碼序列的跨度從kozak直至聚腺苷化序列。圖1與實施例3相關。圖2顯示了 PH20蛋白的胺基酸序列(SEQ ID NO 1)以及根據Kyte-Doolittle算法的親水性圖。PH20蛋白是存在於精子的質膜和頂體膜中的膜蛋白。(a)該胺基酸序列顯示了負責蛋白在膜中的錨定的疏水性序列(下劃線序列)。在本發明中，由病毒所表達的 PH20蛋白顯示出缺失疏水性尾部。切割點標示在圓圈內。藉助於該缺失，PH20蛋白被分泌到細胞外介質。(b)根據Kyte-Doolittle進行的PH20蛋白的末端100個胺基酸的親水性圖。箭頭指示了疏水性消除的起點。圖3證明了含有透明質酸酶PH20基因的溶瘤腺病毒表達顯示出透明質酸酶活性的可溶蛋白。凝膠顯示，用表達透明質酸酶PH20的病毒的上清液溫育的透明質酸樣品已被消化，產生不同大小的寡糖。用對照腺病毒(AdwtR⑶和IC0MR15)的上清液溫育的樣品顯示出未被消化的透明質酸。圖3對應於實施例4。圖4證明了透明質酸酶PH20基因的插入和表達不幹擾腫瘤選擇性複製的腺病毒的複製。將來自於細胞系A549(a)和SKMeU8(b)的細胞用溶瘤腺病毒IC0WR15和 IC0VIR17 (與IC0WR15的差別在於含有PH20基因)感染，並在不同時間(Y-軸，為感染後的小時)測量細胞提取物中的病毒量(總病毒，X-軸，TU/ml)。圖顯示出對於這兩種病毒來說，病毒生產的動力學是一致的，證明了透明質酸酶PH20基因在腺病毒IC0WR17中的插入和表達不影響病毒複製。圖4對應於實施例5。圖5顯示了包含並表達透明質酸酶PH20基因的溶瘤腺病毒的體外溶瘤效能。在表達大量透明質酸的兩個腫瘤細胞系SKMeU8(a)和PC3 (b)中，在體外對表達透明質酸酶PH20的腺病毒(IC0MR17)的溶瘤活性與不含透明質酸酶PH20基因的類似溶瘤病毒 (IC0VIR15)的活性進行比較。病毒誘導的細胞病變效應(CPE)被測量為受感染的細胞單層中蛋白質水平的降低(使用BCA方法測量)。將細胞以10000個細胞/孔接種在96孔板中。第二天，將細胞用病毒的連續稀釋液感染。將被感染的細胞溫育5天，用PBS清洗，並測量孔中殘留的蛋白的量。結果顯示，在體外，透明質酸酶PH20的表達不提高腺病毒的溶瘤活性，因為兩種病毒的細胞毒性曲線相同。將％細胞存活對TU/細胞進行作圖。圖5對應於實施例5。圖6證實了表達透明質酸酶PH20的溶瘤腺病毒的體內抗腫瘤活性。將人類黑素瘤細胞(SKMel28)接種在Balb/c無胸腺小鼠的各脅處。在腫瘤達到150mm3的平均尺寸後， 用PBS或IxlO8轉導單位的AdwtRGD-PH20對它們進行注射(10個腫瘤/組)。(a)圖顯示了每組中相對於第0日的平均腫瘤生長(％ )隨給藥後時間(天)的變化。結果證明了表達透明質酸酶PH20基因的溶瘤腺病毒與對照組(PBQ相比具有統計學顯著的更高抗腫瘤活性，P < 0. 00001。100%的用AdwtRGD-PH20注射的腫瘤在注射後第27日體積消退10% 至50%，與之相反，在用PBS注射的組中消退為0%。(b)在實驗結束時，通過免疫組織化學分析了用PBS或AdwtRGD-PH20注射的腫瘤中透明質酸的量。圖像顯示出用AdwtRGD-PH20 注射的腫瘤與對照腫瘤相比具有較低的透明質酸量。圖6對應於實施例6. 1。圖7顯示出透明質酸酶PH20的表達提高了溶瘤腺病毒在腫瘤內給藥後的抗腫瘤效果。將人類黑素瘤細胞(SKMel28)接種在Balb/c無胸腺小鼠的每側背脅處。在腫瘤達到130mm3的平均體積後，用PBS或IxlO8轉導單位的IC0VIR15或IC0VIR17對它們進行單劑注射(10個腫瘤/組)。(a)圖顯示了相對於第0日的平均腫瘤生長(％ )隨給藥後時間(天)的變化。表達透明質酸酶PH20的溶瘤腺病毒(IC0MR17)與不表達該透明質酸酶的對照腺病毒(ICOWRM)相比，顯示出更好的抗腫瘤效果。(b)在處理42天後，將小鼠處死，收穫腫瘤並稱重。表格顯示了在實驗結束時腫瘤體積、腫瘤生長百分數和腫瘤重量的匯總。用IC0VIR17注射的腫瘤與用IC0VIR15注射的腫瘤(*p < 0. 05)和用PBS注射的腫瘤 (#P < 0. 05)相比顯示出明顯更低的腫瘤重量。與病毒能夠無困難地穿過細胞單層擴散的體外情況下獲得的結果不同，體內結果證明了在細胞外基質抗拒病毒擴散的腫瘤內部，透明質酸酶PH20的表達增加了溶瘤腺病毒的抗腫瘤效能。圖7對應於實施例6. 2。圖8顯示出透明質酸酶PH20的表達提高了溶瘤腺病毒在全身給藥後的抗腫瘤效果。將人類黑素瘤細胞(SKMel28)接種在Balb/c無胸腺小鼠的每側背脅處。在腫瘤達到平均 IOOmm3 後，用 PBS 或 ^dOici 個 IC0VIR15 或 IC0VIR17(裝備有 PH20 的 IC0VIRsl5)物理粒子對小鼠進行靜脈內注射(8-10個腫瘤/組)。(a)圖顯示了每組中相對於第0日的平均腫瘤生長(％)隨給藥後時間(天)的變化。結果證實，透明質酸酶PH20的表達引起腺病毒的溶瘤效能的增加，因為由IC0WR17誘導的腫瘤生長的抑制明顯高於對照組(IC0WR15) 所誘導的抑制Zp < 0.00001。(b)圖像顯示了在實驗結束(第48日)時提取的腫瘤內腺病毒IC0MR15和IC0MR17的分布。用溶瘤腺病毒IC0MR17注射的小鼠的腫瘤與用腺病毒對照IC0WR15注射的腫瘤相比，顯示出非常大範圍的壞死區域(粗箭頭)、有活細胞的區域(ν)數量減少以及許多大的病毒複製中心(用細箭頭標出的具有綠色螢光的區域)。圖 8對應於實施例6. 3。圖9證實了表達透明質酸酶PH20的腺病毒的抗腫瘤全身活性的增加不限於一種腫瘤類型。(a)圖顯示了每組中胰腺腫瘤NP-18相對於第0日的平均生長(％)隨給藥後時間(天)的變化。#，指從第14至第30日與用PBS處理的腫瘤相比有顯著性(ρ彡0，02)； &，從第14至第30日與用PBS處理的腫瘤相比有顯著性(p ( 0，05) Λ從第12至第30日與用IC0VIR-15處理的腫瘤相比有顯著性(ρ彡0，02)。(b)圖像顯示了在第30日時腺病毒 IC0VIR15和IC0VIR17在腫瘤NP-18中的分布。*，與用IC0VIR15處理的腫瘤相比ρ彡0. 01。 「 % P. a」指陽性區域的％。圖9對應於實施例6. 4。圖10(a)顯示了溶瘤腺病毒IC0VIR17和IC0VIR17RGDK的結構。(b)顯示了 IC0VIR17RGDK中修飾形式的纖維的胺基酸序列。下劃線的序列對應於與人類腺病毒5型纖維的野生型形式不同的胺基酸91RGDK94。圖10對應於實施例8。圖11顯示了兩種腺病毒(IC0MR17和IC0MR17RGDK)在兩個腫瘤細胞系中的溶瘤活性，所述細胞系一種是肺腺癌AM9(a)，另一種是胰腺腺癌NP-18(b)。％細胞存活對 TU/細胞。圖11對應於實施例9。
實施例實施例1、溶瘤腺病毒的構建構建了兩個含有透明質酸酶PH20基因的溶瘤腺病毒腺病毒AdwtRGD-PH20和 IC0VIR17。通過使用A549細胞系基因組作為模板對不同外顯子進行PCR擴增，然後使用含有 MfeI限制性位點的特異性側翼引物將這些外顯子相連，獲得了透明質酸酶PH20的cDNA。 將得到的片段用MfeI消化，並通過連接到穿梭質粒pNKFiberRGD(其含有用RGD修飾的腺病毒纖維的序列)中進行克隆，以產生質粒pNKFiberPH20。克隆在質粒pNKFiberPH20中的對應於PH20的cDNA在SEQ ID NO :2中。SEQ ID NO 2顯示了編碼PH20蛋白(同工型， GenBank登記號為NP_694859. 1)的核苷酸，從起始密碼子(ATG)至1467位。來自該GenBank 序列的1468至1527區域的核苷酸序列編碼蛋白的疏水尾區，所述尾區將蛋白錨定到膜上。 該序列已經被缺失，它沒有顯示在SEQ ID NO :2中。在1468位核苷酸之後添加了翻譯終止密碼子TAA。實施例2、AdwtRGD_PH20腺病毒的構建為了產生腺病毒AdwtRGD-PH20，在酵母中使用同源重組將質粒pVK50cau的腺病毒纖維基因(其含有Ad5的完整序列，在纖維中具有Swa I限制性位點)，用從Notl/Kpnl消化的質粒pNKFiberPH20獲得的、後面跟有透明質酸酶PH20基因的纖維基因代替。通過用I^c I消化質粒pAdwtRGD-PH20並轉染到HEK293細胞中，產生了腺病毒 AdwtRGD-PH20，其特徵為在主要晚期啟動子的控制下表達透明質酸酶PH20基因，並且在腺病毒纖維中含有三肽R⑶。以前描述過的腺病毒AdwtRGD的特徵在於在腺病毒纖維中含有三肽RGD (參見M. Majem等，「將ElA控制在用肌強直性營養不良基因座隔離物隔離的E2F-1啟動子下降低了溶瘤腺病毒Ad-DeltaMR⑶的毒性(Control of ElA under an E2F—1 promoter insulated with the myotonic dystrophy locus insulator reduces the toxicity of oncolytic adenovirus Ad-Delta24RGD)", Cancer Gene Therapy 2006, vol. 13，pp. 696-705)。通過用Pac I消化質粒pVK503然後轉染293細胞構建了 AdwtRGD， 所述質粒PVK503含有Ad5的完整基因組並具有用RGD修飾的纖維(參見I. Dmitriev等， 「具有遺傳修飾纖維的不依賴於腺病毒接收的載體通過利用柯薩奇病毒和腺病毒的細胞進入機制顯示出增大的趨向性(An adenovirus receiving-independent vector with genetically modified fibres demonstrates expanded tropism via utilization of a coxsackievirus and adenovirus cell entry mechanism)」，J. Virol. 1998, vol. 72, pp.9706-13)。實施例3、腺病毒IC0VIR17的構津為了產生該腺病毒，使用了腺病毒質粒pIC0MR17。為了產生該質粒，將來自於質粒pIC0MR15的腺病毒纖維基因在酵母中用從Spel/PacI消化的質粒pAdwtRGD-PH20獲得的後面跟有透明質酸酶PH20基因的纖維基因通過同源重組代替。腺病毒IC0MR15源自於腺病毒AdAMRGD，後者的特徵在於在Ela蛋白編碼序列中含有Δ 24缺失。這個缺失影響了 Ela與pRB的相互作用。Ad Δ MR⑶還在腺病毒纖維中具有插入的肽RGD，以增加病毒的侵染性。這兩種修飾描述在K. Suzuki等，「具有增加的侵染性的條件複製性腺病毒顯示出提高的溶瘤效能(Conditionally implicative adenovirus with enhanced infectivity shows improved oncolytic potency)」， Clin Cancer Res 2001, vol. 7, pp. 120-6。從Ad Δ MRGD，將四個E2F-1結合位點和一個Spl結合位點插入到內源Ela啟動子中，以控制Ela的表達。通過這種方式獲得了 IC0MR15。這種插入通過將基因組的419-422位序列用具有4個E2F-1結合位點和一個Spl結合位點的序列代替來進行，使得最終序列為SEQ ID NO :3和圖1(b)中所顯示的序列。為了執行這一步驟，通過定向誘變在pEndK/Spe質粒的ElA啟動子中產生了一個BsiW I限制性位點(參見J. E. Carette 等，「表達短髮夾RNA的條件複製性腺病毒使癌細胞中靶基因的表達沉默(Conditionally replicating adenoviruses expressing short hairpin RNAs silence the expression of a target gene in cancer cells)，，，Cancer Res 2004, vol. 64, pp. 2663-7)。通過將 BsiffI 切割質粒 pEndK/Spe 與彼此雜交的引物 SplF(5『 -GTACGTCGACCACAAACCCCGCCCAGCG TCTTGTCATTGGCGTCGACGCT-3『 SEQ ID NO 5)和SplR(5『 -GTACAGCGTCGACGCCAATGACAAGAC GCTGGGCGGGGTTTGTGGTCGAC-3『 SEQ ID NO :6)進行連接，將Spl結合位點導入到該質粒的 Bsiff I 位點內。使用彼此雜交的結合引物 E2FF2 (5 『 -GTACGTCGGCGGCTCGTGGCTCTTTCGCGGC AAAAAGGATTTGGCGCGTAAAAGTGGTTCGAA-3' SEQ ID NO :7)和E2FR2(5『 -GTACTTCGAACCACTT TTACGCGCCAAATCCTTTTTGCCGCGAAAGAGCCACGAGCCGCCGAC-3' SEQ ID NO :8)來導入 E2F 結合位點，以產生質粒pEndK415SplE2F2。接下來，通過在酵母中同源重組，導入含有質粒在酵母中複製所必需的元件(著絲粒、自主複製區ARS和選擇性標誌物URA3)的序列CAU，以產生質粒pEndK415SplE2F2CAU。最後，在酵母中，在用KpnI消化的質粒pEndK415SplE2F2CAU與腺病毒Ad Δ MRGD的腺病毒基因組之間進行同源重組，以構建pIC0MR15Cau。通過將I^acl 消化的pIC0VIR15cau轉染到HEK293細胞中，獲得了 IC0VIR15。通過用I^cI消化質粒pIC0MR17並轉染到HEK293細胞中，產生了含有與 IC0VIR15相同的修飾並加上在腺病毒纖維基因後插入透明質酸酶基因的IC0WR17病毒。 AdwtRGD-PH20和IC0MR17基因組的正確結構通過用Hind III進行限制性酶切來驗證。此夕卜，使用特異性引物對PH20基因區域進行測序。插入到IC0VIR17和AdwtRGD_PH20基因組中的完整盒與IC0VIR15和AdwtRGD基因組的比較顯示在圖1 (c)和SEQ ID NO :4中。PH20蛋白編碼序列落於kozak序列與聚腺苷化序列之間。_仿丨丨4、iM寸鋪綱碰IS PH20書艤胃汰肺綱碰隨性白· 溶蛋白為了證實含有透明質酸酶PH20基因的腺病毒表達具有透明質酸酶活性的可溶蛋白，使用可以感染80%以上的感染複數(20M.0. I)將A549細胞系的培養物用病毒 AdwtRGD, AdwtRGD-PH20、IC0VIR15或IC0VIR17感染。感染後M小時，將感染培養基用新鮮培養基替換。然後，在又一個M小時後，收穫新鮮培養基(或上清液)，並按照製造商的說明書，在Amicon Extreme柱(Millipore，Billerica，the USA)中過濾對其進行濃縮。將濃縮的上清液與透明質酸溶液(1. 5mg/ml)在含有0. IM NaCl和0. 05% BSA的磷酸鹽緩衝液(pH = 6)中，在37°C溫育過夜。通過在15%聚丙烯醯胺凝膠中電泳來分析消化的透明質酸(參見M. Ikegami-Kawai等，「通過聚丙烯醯胺凝膠電泳對透明質烷寡糖進行微量分析及其在透明質酸酶活性測定中的應用(Microanalysis of hyaluronan oligosaccharides by polyacrylamide gel electrophoresis and its application to assay of hyaluronidase activity)，，，Analytical biochemistry 2002, vol. 311, PP. 157-65)。將透明質酸消化的寡糖產物用30分鐘內固定在愛茜藍溶液中的凝膠基質中。 最後，將寡糖用硝酸銀染色。結果顯示在圖3中。結果證實，用含有透明質酸酶PH20基因的腺病毒(AdwtRGD-PH20和IC0MR17)感染的細胞的上清液，含有能夠將透明質酸(高分子量多糖)消化成5至50個以上二糖重複單元的寡糖的可溶性蛋白。實施例5、表達透明質酸酶PH20基因的溶瘤腺病毒對病毒複製和體外細胞毒性沒有介導效應為了證實透明質酸酶PH20基因的插入不影響病毒複製，將A549和SKMeH8腫瘤細胞系用溶瘤腺病毒IC0MR15或IC0MR17感染。在感染後4小時，將感染培養基用新鮮培養基替換。在感染後不同時間收穫總細胞提取物，並將它們凍融三次以釋放病毒。細胞提取物中的病毒量通過HEK293感染和抗六鄰體抗體染色來測定(參見M. Maiem同上)。結果顯示在圖4中。透明質酸酶PH20基因的插入不影響腺病毒IC0WR17的複製，因為該病毒顯示出與腺病毒對照相同的複製。為了證實透明質酸酶PH20表達對溶瘤腺病毒體外細胞毒性的影響，將來自PC3 和SKMel-觀腫瘤細胞系的細胞用病毒IC0MR15或IC0MR17的連續稀釋液感染。在感染後5和6天，分別用分光光度計評估蛋白的量作為細胞存活的指示。結果顯示在圖5中。IC0WR17在這兩種腫瘤細胞系中的裂解活性與IC0WR15的活性相同，表明透明質酸酶 PH20表達在體外不提供任何溶瘤優勢。種· 6 鋪綱碰IS PH20胃剛雜隱髓捕力碰砠6. 1.使用移植了 SKMel-觀腫瘤的Balb/c種系無胸腺小鼠進行了體內實驗。將總共切106個SKMel-觀細胞系的腫瘤細胞皮下注射到小鼠的各脅中。21天後，將具有腫瘤的小鼠(腫瘤體積為150mm3)分配到不同實驗組中(每組η = 10)。對照組的腫瘤組接受鹽水緩衝液(20 μ 1)的單次腫瘤內注射。用AdwtRGD-PH20處理的組的小鼠接受每個腫瘤 IxlO8個該病毒轉導單位(相當於&109個病毒粒子或vp)的腫瘤內注射(20μ1)。每兩天或三天使用卡尺測量腫瘤，並按照下述公式計算腫瘤體積V (mm3) =A(mm)X B2 (mm2) χ ρ/6, 其中A是較長或縱向長度，B是橫截面長度。圖6顯示了相對於治療開始時(第0日)的腫瘤生長百分數。結果顯示為平均值士S. E。結果之間差異的統計學顯著性使用不匹配數據的非參數Marm-Whitney檢驗來計算。使用方差分析來比較生長曲線。如果ρ <0.05，結果被認為是顯著的。用腺病毒AdwtRGD-PH20治療腫瘤在100%的被治療腫瘤中產生了腫瘤消退。從注射後第一天起，與對照組相比腫瘤生長的％明顯較小。在實驗結束時進行的腫瘤分析顯示，在用AdwtRGD-PH20注射的腫瘤的細胞外基質中存在的透明質酸量減少。6.2.在另一個實驗中，治療通過腫瘤內注射IC0MR15或IC0MR17來執行。將人類黑素瘤細胞系SKMel-28的腫瘤植入到無胸腺小鼠Balb/C nu/nu中，並在建立後用PBS 或病毒IC0MR15或IC0MR17的IxlO8個轉導單位(相當於hlO9個病毒粒子或vp)對它們進行腫瘤內治療。結果顯示在圖7中。用IC0WR17治療顯示出溶瘤活性，導致與對照組 (PBS)明顯不同的腫瘤生長抑制，ρ <0.05。在實驗結束時，切下腫瘤並稱重。圖7的表顯示了實驗結束時腫瘤體積、腫瘤生長百分數和腫瘤重量的平均值。用IC0WR17注射的腫瘤的重量明顯低於對照組PBS (#p < 0. 05)和IC0VIR15(*p < 0. 05)中的腫瘤重量。6.3.在另一個實驗中，治療通過全身性注射IC0MR15或IC0MR17來進行。將人類黑素瘤細胞系SKMel-28的腫瘤植入到無胸腺小鼠Balb/C nu/nu中，並在建立後用PBS 或病毒IC0MR15或IC0MR17的^cIOiq個物理粒子通過尾靜脈注射對動物進行治療。結果顯示在圖8中。用IC0MR17治療顯示出溶瘤活性，導致腫瘤生長抑制與對照組PBS(#p < 0. 0001)和IC0MR15rP < 0. 00001)明顯不同。在實驗結束時，切下腫瘤並冷凍在OCT 中。將來自OCT中冷凍的腫瘤的不同部分用抗α-六鄰體抗體(腺病毒衣殼蛋白)處理並用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚復染。IC0WR17的抗腫瘤活性與腺病毒在腫瘤內水平的複製相關，這種複製在注射後48日獲得的腫瘤中進行評估。用IC0WR17治療的腫瘤與用 IC0MR15注射的腫瘤相比顯示出大的壞死面積、更好的病毒分布和較少的活細胞區域。6.4.在另一個實驗中，治療通過在植入來自人類胰腺腺癌細胞系ΝΡ-18的腫瘤的 Balb/C nu/nu無胸腺小鼠中全身性注射IC0MR15或IC0MR17來進行。在腫瘤建立並達到 60mm3的平均體積後，用病毒IC0VIR15或IC0VIR17的PBS或^101°個物理粒子通過尾靜脈對動物進行治療(10個腫瘤/組)。結果顯示在圖9中，其中證實了表達透明質酸酶PH20 的腺病毒的抗腫瘤活性增加不限於單一腫瘤類型。圖9(a)證實了與PBS組和病毒對照組(IC0VIR15)相比，透明質酸酶PH20的表達也導致腺病毒溶瘤效能的增加。#，表示從第14至第30日與用PBS處理的腫瘤相比有顯著性(p ( 0. 02) ；&，表示從第14至第30日與用PBS處理的腫瘤相比有顯著性(p ( 0. 05)。*，表示從第12至第30日與用IC0MR15處理的腫瘤相比有顯著性(p ^ 0. 02)。在第30日時，將腫瘤切下並冷凍在OCT中，隨後用α -六鄰體抗體處理並用DAPI復染。為了定量IC0VIR-17的腫瘤內複製水平，通過抗六鄰體染色分析了每個腫瘤的5 個活的區域(每個組7/10隻動物)，並通過計算機圖像分析(ImageJ軟體)計算了陽性面積百分數。該分析的結果顯示在圖9(b)中，其中指出，用IC0WR17處理的ΝΡ-18腫瘤與用 IC0VIR15處理的腫瘤相比顯示出明顯更大的腺病毒染色面積Γ，顯著，ρ^Ο. 01)。棚列7、胃汰誘日月碰__爐_艤白_裡學骱兄為了證實透明質酸酶基因的插入基本上不改變溶瘤腺病毒靜脈內給藥後誘導的毒性模式，使用了敘利亞倉鼠(金倉鼠(Mesocricetus auratus))，因為它是允許人類腺病毒複製的動物模型。倉鼠構成允許人類腺病毒複製的動物模型。使用了雌性、有免疫能力的5周齡動物(5-6隻動物/組)。它們在第0日通過頭靜脈靜脈內接受300 μ 1 PBS中的單劑IC0VIR15或IC0VIR17的虹IO11個νρ。對照組用相同體積的PBS注射。給藥後5天， 將動物處死，並通過心臟穿刺從每隻動物獲得全血和血清，以測量肝毒性參數(AST和ALT 酶)，並通過流式細胞術(血像)計數不同的血細胞群體。同時，獲取動物的肝臟並固定在 4%多聚甲醛中用於蘇木精/曙紅染色。肝毒性研究的結果表明這兩種病毒都在該模型中誘導一定程度的肝炎症，伴有 AST和ALT轉氨酶水平升高。然而，在用IC0WR15或IC0WR17處理的動物之間沒有觀察到差異。在血液學水平上，與對照動物相比，兩種病毒引起中性粒細胞、嗜鹼性粒細胞和單核細胞群體的升高以及血小板計數降低，但是在IC0WR15與IC0WR17之間仍然沒有差異。實施例8、病毒IC0VIR17RGDK的構建為了產生這種腺病毒，使用了腺病毒質粒PIC0WR17RGDK。在該質粒中，野生型腺病毒5的纖維基因已經被其硫酸乙醯肝素結合結構域修飾過的形式代替(多肽序列的胺基酸91KKTK94被91RGDK94代替)。通過在酵母中進行pIC0VIR17的NdeI部分消化產物與EcoRI消化的pBMttKKT質粒(其含有腺病毒纖維的修飾形式，如N. Bayo 等，「用R⑶代替5型腺病毒纖維軸硫酸乙醯肝素蛋白聚糖結合結構域以提高腫瘤侵染性禾口革巴向性(Replacement of adenovirus type 5fibre shaft heparan sulphate proteoglycan-binding domain with RGD for improved tumour infectivity and tarRetinR)，，，Human Gene Therapy 2009，vol. 20，ppl214_21 中所述)之間的同源重組,構建了 pIC0VIR17RGDK 質粒。圖10顯示了在IC0MR17RGDK情形下修飾91RGDK94的位置以及該腺病毒中纖維蛋白的完整序列。腺病毒 IC0VIR17 含有其中肽 RGD-4C (Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Ph e-Cys :CDCRGDCFC，SEQ ID NO :10)已插入到蛋白的魁結構域的HI-環中(在腺病毒衣殼中非保守進化並且非常暴露的高變環)的腺病毒纖維基因形式。IC0WR17RGDK與IC0WR17完全類似，除了纖維基因中之外，因為IC0WR17RGDK纖維與野生型人類腺病毒5型的差異僅在於將蛋白的軸結構域中的胺基酸91KKTK94用高親和性整合蛋白結合肽91RGDK94代替(SEQ ID NO 9)。實施例9、具有衣殼修飾的腺病毒IC0VIR17RGDK的溶瘤效果如圖11中所示，IC0WR17RGDK中存在的衣殼修飾不改變含有並表達透明質酸酶 PH20基因的溶瘤腺病毒的體外細胞毒性。在兩種腫瘤細胞系、即源自於肺腺癌的AM9(圖11(a))和源自於胰腺癌的NP-18(圖11(b))中，對表達透明質酸酶PH20的兩種腺病毒 (IC0MR17和IC0VR17RGDK)的溶瘤活性進行了比較。病毒誘導的細胞病變效應被測定為被感染的細胞單層中蛋白量的降低(BCA方法)。將兩種腫瘤細胞系的細胞以10000個細胞/ 孔接種到96孔板中。第二天，將細胞用病毒的連續稀釋液感染。將感染的細胞溫育6天， 用PBS清洗，並測量孔中留存的蛋白的量。結果顯示，在體外，衣殼修飾不顯著改變腺病毒的溶瘤活性。棚列10、胃汰誘日月碰_剛·醜_白杯觸_學骱兄為了在表達透明質酸酶的溶瘤腺病毒背景中評估RGDK修飾的影響，使用了不帶有腫瘤的有免疫能力的Balb/C小鼠。使用5周齡雄性小鼠(7隻動物/組)。它們在第0 日通過尾靜脈靜脈內接受150 μ 1 PBS中的單劑IC0VIR17或IC0VIR17RGDK的^cIOiq個νρ。 在給藥後第7日O只動物/組)和第12日(5隻動物/組)，將動物處死並通過心臟穿刺從每隻動物獲得全血和血清，通過流式細胞術(血像)計數不同的血細胞群體，並測量肝毒性參數(AST和ALT酶)。該研究的結果顯示兩種病毒在第7日都增加了酶的水平。然而， 這些水平在第12日返回正常值。在IC0WR17和IC0WR17RGDK組之間沒有觀察到顯著差異，儘管在用IC0VIR17RGDK注射的動物組中與IC0MR17組相比觀察到較低的肝毒性趨勢 (略低的AST和ALT水平)。對於給藥後第12天時動物的血液學情況來說，除了用IC0MR17 處理的動物與PBS和IC0WR17RGDK動物組相比淋巴細胞數量較低之外，在白細胞和血小板計數中沒有觀察到顯著差異。
權利要求
1.一種溶瘤腺病毒，其包含插入在其基因組中的編碼透明質酸酶的序列。
2.權利要求1的溶瘤腺病毒，其中所述腺病毒是人類腺病毒。
3.權利要求2的溶瘤腺病毒，其中人類腺病毒選自人類腺病毒血清型1至51及其衍生物。
4.權利要求3的溶瘤腺病毒，其中人類腺病毒來自於血清型5。
5.權利要求1-4任一項的溶瘤腺病毒，其中透明質酸酶是哺乳動物睪丸透明質酸酶。
6.權利要求5的溶瘤腺病毒，其中透明質酸酶是人類睪丸透明質酸酶。
7.權利要求1-6任一項的溶瘤腺病毒，其中所述酶的序列缺失膜結合結構域序列，產生可溶性酶。
8.權利要求1-7任一項的溶瘤腺病毒，其中所述酶的序列被插入到溶瘤腺病毒中腺病毒纖維的核苷酸序列之後。
9.權利要求1-8任一項的溶瘤腺病毒，其中所述酶的表達受在動物細胞中有活性的啟動子控制。
10.權利要求9的溶瘤腺病毒，其中啟動子選自細胞巨細胞病毒啟動子、腺病毒主要晚期啟動子、SV40啟動子、單純性皰疹病毒胸苷激酶啟動子、RSV啟動子、EFl α啟動子、β -肌動蛋白啟動子、人類IL-2啟動子、人類IL-4啟動子、IFN啟動子、E2F啟動子和人類GM-CSF 啟動子。
11.權利要求1-10任一項的溶瘤腺病毒，其中所述腺病毒包含組織特異性或腫瘤特異性啟動子，其中所述啟動子控制Ela、Elb、E2和E4中的一個或多個基因的表達，以實現在腫瘤中選擇性複製。
12.權利要求11的溶瘤腺病毒，其中啟動子選自E2F啟動子、端粒酶hTERT啟動子、酪氨酸酶啟動子、前列腺特異性抗原啟動子、甲胎蛋白啟動子和C0X-2啟動子。
13.權利要求1-12任一項的溶瘤腺病毒，其中所述腺病毒在選自Ela、Elb、E4和 VA-RNA的一個或多個基因中具有突變，以實現在腫瘤中選擇性複製。
14.權利要求1-13任一項的溶瘤腺病毒，其中所述腺病毒在衣殼中具有修飾，以增加其侵染性或靶向腫瘤細胞中存在的受體。
15.權利要求14的溶瘤腺病毒，其中衣殼的修飾是用RGDK結構域替換腺病毒纖維中存在的KKTK硫酸乙醯肝素結合結構域。
16.權利要求1-15任一項的溶瘤腺病毒，其中所述腺病毒包含對編碼透明質酸酶的序列的蛋白翻譯進行優化的序列。
17.權利要求1-16任一項的溶瘤腺病毒，其中所述腺病毒包含促進編碼透明質酸酶的序列的表達的序列。
18.權利要求17的溶瘤腺病毒，其中促進表達的序列選自允許RNA加工的剪接受體序列、IRES序列和小核糖核酸病毒2A序列。
19.權利要求1-18任一項的溶瘤腺病毒，其中所述腺病毒包含插入到其基因組中的一個或多個基因。
20.一種藥物組合物，其包含治療有效量的權利要求1-19任一項中所限定的溶瘤腺病毒，以及可藥用載體或賦形劑。
21.權利要求1-19任一項中所限定的溶瘤腺病毒在製造用於治療哺乳動物包括人類的癌症或癌症的惡變前階段的藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及溶瘤腺病毒，其包含插入在其基因組中的編碼透明質酸酶的序列。這種腺病毒在腫瘤團塊中傳播更加有效，因此溶瘤效果提高。靜脈內注射本發明的溶瘤腺病毒，獲得了腫瘤體積的消退。因此，本發明的溶瘤腺病毒可用於癌症或癌症的惡變前階段的治療。
文檔編號C12N15/861GK102548584SQ201080028895
公開日2012年7月4日 申請日期2010年5月5日 優先權日2009年5月6日
發明者索尼婭·葛丹卡裡奧, 萊蒙·阿萊馬尼伯納斯特裡, 馬內爾·馬裡亞·卡斯卡洛皮奎拉斯 申請人:加泰隆尼亞腫瘤研究所, 貝爾韋什生物醫學研究學會