半滑舌鰨人工催產和雌核發育二倍體魚苗的誘導方法
2023-09-17 04:30:10 4
專利名稱：：半滑舌鰨人工催產和雌核發育二倍體魚苗的誘導方法
技術領域：
：本技術屬於魚類遺傳育種
技術領域：
，是一種批量生產適於苗種繁育的半滑舌鰨未受精卵以及誘導半滑舌鰨卵進行雌核發育，獲得雌核發育二倍體魚苗的方法，可應用於半滑舌鰨苗種規模化生產和全雌苗種的生產。
背景技術：
：半滑舌鰨(6>/7^/o^m"肌7/ser")是我國特有的一種名貴經濟海水魚類，屬於近海溫水性底層魚類，我國沿海均有分布，以黃海、渤海為多。半滑舌鰨由於其味道鮮美、.肉質細嫩、營養豐富，深受廣大消費者歡迎，其市場價值極高，養殖前景非常廣闊。半滑舌鰨是目前海水魚類養殖的主要品種之一，其養殖產量目前近萬噸，價格昂貴，市場價達到150元/500克左右，半滑舌鰨養殖業目前每年的產值約為15億元人民幣。鑑於半滑舌鰨的養殖潛力和潛在的經濟社會效益，近年來，我國科技工作者對半滑舌鰨生殖調控和自然產卵技術進行了大量研究工作，主要釆用人工控制光照和水溫的方法刺激半滑舌鰨親魚成熟和自然產卵，該項技術於2002年獲得成功，在人工養殖條件下，通過控制親魚養殖池的水溫和光照時間，誘導半滑舌鰨親魚成熟並自然產卵，獲得了半滑舌鰨受精卵，並生產出了半滑舌鰨苗種(中國水產科學研究院黃海水產研究所，姜言偉等，1993;柳學周等，2006)。這種半滑舌鰨育苗方式，基本上是以人工控溫、控光刺激親魚成熟和在養殖池中進行自然產卵和自然受精，這種生產模式的可操作性較差，親魚產卵率較低，受精率較低，不利於有計劃的安排生產，影響了半滑舌鰨苗種的推廣及養殖產業的形成；特別是這種育苗方式不能獲得半滑舌鰨的未受精卵，嚴重影響了半滑舌鰨雌核發育和性別控制技術的建立和全雌苗種的生產，影響了半滑舌鰨養殖業的產業化發展。因此，開展半滑舌鰨人工催產技術的研究，建立通過注射激素使親魚同步發育和排卵的技術，獲得未受精卵，是進行半滑舌鰨規模化育苗和人工雌核發育研究中急需解決的一大難題。而有關通過激素注射進行半滑舌鰨人工催產、獲得未受精卵的研究，目前未見報導。研究表明，半滑舌鰨雌性個體和雄性個體，在生長速率上存在巨大差別，其雌性個體比雄性個體大3-4倍(中國水產科學研究院黃海水產研究所，孟田湘等，1988),半滑舌鰨魚苗經過1年養殖後，雌性個體可長到500-750克，而雄性個體則只有50-150克。由於雄性個體生長過慢，影響了商品魚的質量，降低了半滑舌鰨的養殖產量，增加了養殖成本，因而嚴重影響了半滑舌鰨苗種的推廣及養殖產業的發展，因此，對半滑舌鰨開展雌核發育技術的研究、研製全雌育種技術，培育半滑舌鰨全雌苗種，在漁業生產中推廣應用全雌苗種，對於提高半滑舌鰨的養殖產量和產品質量非常重要。如果研製出半滑舌鰨全雌苗種，進行大面積推廣後，將極大提高半滑舌鰨的養殖產量，增加產量80—100%,每年將增加10多億元的經濟效益。雌核發育是生產魚類全雌苗種的重要途徑。這條技術途徑在其它淡水魚類和少數海水魚類上有過一些研究，並生產出了一些單性苗種，如對銀鯽天然雌核發育機理進行了大量的研究(中國科學院水生生物研究所，桂建芳等，1996),我國最早在鯉魚上建立了人工雌核發育技術(中國科學院水生生物研究所，吳清江，1981);隨後，在鰱魚也建立了雌核發育誘導方法(中國水產科學研究院長江水產研究所，潘光碧等，1995);同時，一些學者也開展了海水魚類牙鮃雌核發育技術的研究(中國科學院海洋研究所劉靜等，1999)。不過，上述魚類的性別決定機制均為XY型，即雄性為XY型、雌性為XX型性別決定，雌魚只產生一種卵子，即X卵子，而雄魚則產生XY型2種精子。最近，國內一些學者開展了半滑舌鰨性別相關分子標記篩選的研究，以及半滑舌鰨性腺發育和性別轉換技術的研究等項工作，成功地篩選到半滑舌鰨雌性特異AFLP分子標記，建立了半滑舌鰨遺傳性別鑑定的PCR技術(黃海水產研究所陳松林等，2007;鄧思平等，2007)，發現半滑舌鰨雌性個體存在異型性染色體(周麗青等，2005)。AFLP分子標記和染色體分析研究表明，半滑舌鰨為ZW型性別決定機制，即雌魚產生Z型和W型兩種卵子，而雄魚只產生一種Z型精子。這種ZW型雌魚產生的卵子，經雌核發育後將產生ZZ型雄魚和鼎型超雌魚兩種類型。ww型超雌魚與zz型雄魚交配後將產生全雌苗種。而有關半滑舌鰨人工雌核發育技術以及通過人工雌核發育誘導二倍體魚苗產生的技術，目前國內外均未見才艮道。
發明內容本發明的目的是1)建立半滑舌鰨親魚人工催產技術，通過人工催產獲得半滑舌鰨未受精卵；2)建立人工誘導半滑舌鰨卵子進行雌核發育的技術方法，培育雌核發育二倍體魚苗。本發明技術內容包括二個方面一、半滑舌鰨親魚人工催產和授精方法；二、雌核發育二倍體魚苗的誘導和鑑定方法。一、半滑舌鰨親魚人工催產和授精方法它的技術內容包括1.親魚的選擇；2.催產激素的選擇和劑量；3.人工催產及人工授精；1.親魚的選擇方法選擇體表無損傷的半滑舌鰨雌性和雄性成魚作為親魚，雌魚體重應在為1.5-3kg/尾；雄魚體重為150-350g/尾，按每平方米一雌二雄的密度進行室內流水養殖，投餵貝類、野雜奸和活沙蠶等新鮮活何料，每天的投辨量為魚體重的2-4%。對達到性成熟年齡(雌性3年、雄性2年)的親魚，在催產前2-3個月進行控溫控光；在此期間，水溫從17-19。C逐步升高到22-23°C(按每10天升高0.5-l°C),並維持在此溫度；光照時間由每天8小時逐漸延長到16小時(按每10天延長1小時)，並維持在16小時。通過觀察和手摸檢查選擇性腺明顯隆起、用手輕壓性腺上下兩側有明顯的充實感且性腺前端有一定的柔軟度的雌魚，用於注射激素進行人工催產。雄性親魚要選擇輕擠性腺部位，可以看到精液流出者方可用於催產。2.催產激素的選擇和劑量半滑舌鰨對幾種催產激素較為敏感，如絨毛膜促性腺激素(HCG)、促黃體素釋放激素類似物A2和A3以及地歐酮(DOM)等，其中如下幾種激素及其劑量催產效果較好LRH-A2的適宜劑量為雌魚G.5-2.0|ag/kg,雄魚3-6jug/kg;LRH-A3的適宜劑量為雌魚0.4-2.0|ug/kg,雄魚2-5ng/kg;HCG+LRH-A3的適宜劑量為難魚HCG40-60IU+LRH-A30.4-1.5jug/kg;LRH-A3+D0M的適宜劑量為:雌魚LRH-A30.4-2.0jug/kg+DOM卜2mg/kg。3.人工催產及人工授精技術內容包括(l)激素注射、(2)效應時間確定、(3)人工擠卵和授精。(1)激素注射選好親魚後，按以上催產劑量進行激素注射。注射時可以用MS-222進行麻醉或直接注射，親魚從水中撈起後，迅速用大毛巾包住，以防其受傷。激素溶液的注射量雌魚不要超過lml/每尾，雄魚不要超過0.2ml/每尾，注射部位為側線上方頭部後方的肌肉較厚部分，進針角度不要超過45°,雄魚注射時還要注意進針深度，不要穿透魚體。(2)效應時間確定激素種類不同，注射後的效應時間也不同，各種激素在22-23。C時的效應時間如下LRH-A2:36-44h;LRH-A3:35-43h;HCG+LRH-A3:34-42;LRH-A3+D0M:35-43h。(3)人工擠卵和授精到達效應時間以後，當雌魚性腺由硬明顯變軟，並感覺性腺內的卵有明顯的流動感，即可進行擠卵和人工授精。用手在性腺上下兩側從後到前輕壓性腺部位，即可將卵擠出，接在燒杯中。採精時，用手擠壓雄魚腹部，將擠出的精液用吸管吸到2-5毫升的小瓶中備用。當進行生產性授精時，每條雌魚的卵(100-300毫升)用2-3條雄魚的精液(1-2毫升)授精即可。將精卵混合均勻，先加入兩倍於卵體積的海水，2-3分鐘後，再加入5-8倍於卵體積的海水完成受精過程，20min後洗去過多的精液即可轉入聘化缸進行孵化。二、雌核發育二倍體魚苗的誘導方法包括(一)、半滑舌鰨卵子人工雌核發育方法；(二)、雌核發育魚苗的鑑定方法。(一)、半滑舌鰨卵子人工雌核發育方法它的技術內容包括1、精子的遺傳滅活；2、未受精卵與失活精子的"授精"；3、雌核發育魚卵染色體加倍起始時間的確定；4、雌核發育魚卵染色體加倍冷休克溫度及處理時間的確定。1.精子的遺傳滅活採用異源的花鱸精子和同源的半滑舌鰨精子刺激半滑舌鰨卵子進行雌核發育。半滑舌鰨精液先用顯微鏡檢查精子活力(運動精子的百分率)，當活力達到60%以上者可用於紫外線滅活處理。精子的遺傳滅活條件為將100juL半滑舌鰨精液用^"子稀釋液MPRS(配方為KC10.39g/L,CaCl22H200.17g/L,NaHC030.25g/L,NaCl3,59g/L,NaH2P040.22g/L，MgCl20.23g/L,Glucose1.0g/L)稀釋10倍，平鋪於培養皿中，用90-110mJ/cm2紫外線照射，然後與5-10mL半滑舌鰨卵"授精"。異源精子為冷凍保存的花鱸精子。從液氮中取出花鱸冷凍精子，在37。C水浴復溫解凍後鏡檢精子活力，活力達到70%以上者用於紫外線滅活處理。將100juL解凍的花鱸精液用lmLMPRS溶液稀釋後，平鋪於培養皿中，分別用紫外線照射，劑量範圍為20，40,60,80,100,120，140，160mJ/cm2。照射後的精液分別和5-10mL半滑舌鰨卵受精，在22-23。C恆溫培育。結果表明，90-110mJ/cm2的紫外線照射精子刺激卵雌核發育的效果較好，胚胎發育率高。2.未受精卵與滅活精子的"授精"將經紫外線照射後的精液200-1000jaL加到半滑舌鰨未受精卵(10-100毫升)中，將精卵輕輕搖動混勻，隨後加入2-10毫升海水，繼續混勻後，再加入20-200毫升海水完成"4受^r，，過程，在22-23。C下培育2-IO分鐘，準備用於染色體加倍處理。3.雌核發育魚卵染色體加倍起始時間的確定染色體加倍採用冷休克處理方法，在"授精"後不同時間(2,3,4，5,6，7，8min),將卵倒入小抄網(直徑10-15釐米)，然後將盛有雌核發育卵的小抄網浸入3-6。C的海水浴中進行冷休克處理，冷休克處理時間為20-30min，冷^f木克處理完畢後將卵移入22-23。C海水中培養。統計受精率，單倍體率，雌核發育二倍體率。結果發現雌核發育卵在"授精"後4-6min進行冷休克處理都能夠誘導產生雌核發育二倍體，且以"授精"後5min的誘導率最高。4.雌核發育魚卵染色體加倍冷休克溫度和持續時間的篩選在確定了冷休克起始時間後，需要確定冷休克溫度和休克持續時間。將與紫外失活精子"授精"的卵，分成6個溫度梯度2。C，4°C,5°C,6°C,8°C,10°C，在每個溫度梯度分別處理15min,20min，25min,30min，35min和40min。共計36組試驗。最後統計受精率，單倍體率，雌核發育二倍體率。結果表明在休克溫度3。C-6。C，休克時間15-30min條件下都可以誘導雌核發育二倍體，其中在4.5-5.5'C處理20-25min的雌核發育誘導率最高。(二)、雌核發育魚苗的鑑定方法它的技術內容包括l.染色體分析鑑定雌核發育魚苗；2.通過微衛星分子標記鑑定雌核發育魚苗；3.通過半滑舌鰨雌性特異AFLP標記鑑定雌核發育魚苗。1.染色體分析鑑定雌核發育魚苗採用常規染色體製片方法，對半滑舌鰨雌核發育魚苗進行染色體分析，發現半滑舌鰨雌核發育魚苗的染色體數為42條，與半滑舌鰨普通魚苗染色體數目完全相同；同時我們還發現有些雌核發育魚苗含有2條巨型WW染色體，這些魚苗為雌核發育的鼎型魚苗。由此證明這些魚苗為雌核發育二倍體個體，與母本完全相同。2.用微衛星標記鑑定雌核發育魚苗；採取高鹽法提取雌核發育魚和正常魚苗基因組DNA,從我們篩選到的半滑舌鰨多態性微衛星引物中，選取微衛星引物Cyse31,其引物序列為Cyse31Nl:GACGGTCAAAAGTGGTGTGA;Cyse31Cl:TTTCCACTGTTCACCTGCTG.然後進行PCR擴增，PCR擴增條件為94。C熱變性5min,然後進行38個循環，每個循環包括94。C變性30s,56-62。C退火30s，72。C延伸30s,最後在72。C延伸7min。PCR擴增產物在6。/。的聚丙烯醯胺凝膠上進行電泳分離，採用銀染法染色。結果表明該引物對在半滑舌鰨普通魚苗中擴增出2個等位基因(即雜合子)的比例為55.6%，而在鱸魚精子誘導的雌核發育魚苗(25尾)中，有20尾魚苗只擴增出1個等位基因，純合率為80%,而只有5個個體擴增出2個等位基因，雜合率僅為20%,並且在所有檢測的雌核發育魚苗中僅出現2個等位基因。由以上結果可以證明雌核發育魚苗確實是由雌核發育而來。3.用半滑舌鰨雌性特異AFLP標記鑑定雌核發育魚苗採用我們以前建立的半滑舌鰨雌性特異AFLP標記和遺傳性別鑑定的PCR技術進行半滑舌鰨雌核發育魚苗遺傳性別的鑑定。其技術原理為含有W染色體的雌性個體中可以擴增出雌性特異DNA片段，不含W染色體的ZZ雄性個體則沒有這種特異DNA片段。採用雌性特異PCR引物Cse382Nl(序列為ATTCACTGACCCCTGAGAGC)和Cse382Cl(序列為GTAAACAGCACACACTCAACAA)，利用高鹽法提取半滑舌鰨雌核發育魚苗個體DNA作為模板，進行PCR擴增。PCR條件為95。C預變性5分鐘，然後95°C30秒、66°C30秒、72。Cl分鐘，35個循環，最後在72"C延伸IO分鐘，採用1%瓊脂糖電泳分析PCR產物。從10尾異精雌核發育半滑舌鰨魚苗中檢測到4尾魚苗含有382bp的雌性特異DNA片段，表明我們獲得的半滑舌鰨雌核發育魚苗中含有40%左右的超雌魚苗。本發明與已有技術對比其特點是本發明突破了半滑舌鰨人工催產和人工雌核發育的難題，成功地建立了半滑舌鰨人工催產技術，可以通過人工催產批量化獲得未受精卵；卵子受精率為60-89%,孵化率為34-79%;本發明建立了半滑舌鰨人工雌核發育技術，獲得了異源精子和同源精子誘導的雌核發育二倍體魚苗，採用AFLP標記證明雌核發育魚苗中含有WW超雌個體，這些個體可以用來生產半滑舌鰨全雌苗種；本發明建立的半滑舌鰨人工催產和雌核發育二倍體魚苗的誘導技術，技術先進，操作方便，方法高效、實用、可靠，其誘導半滑舌鰨雌核發育二倍體的百分率為0.4-6.3%;為半滑舌鰨苗種生產和全雌苗種研製提供了技術手段，在半滑舌鰨規模化育苗、性別控制和全雌魚苗培育上具有重大應用價值和廣闊的推廣應用前景。圖1:染色體加倍適宜起始時間的確定；圖2:適宜冷休克溫度的確定；圖3:適宜冷休克處理時間的確定；圖4:雌核發育半滑舌鰨的染色體分析；A:雌核發育產生的ZZ型個體；B:雌核發育產生的WW型個體，圖中可見2個巨大的染色體，即鼎染色體。圖5:半滑舌鰨雌核發育魚苗的微衛星鑑定；1-18為半滑舌鰨普通二倍體魚苗個體，M為pBR322DNA/#^I分子量標準，19-43為半滑舌鰨雌核發育魚苗個體。圖6:半滑舌鰨雌核發育魚苗的遺傳性別鑑定上部為雌性特異DM標記的4全測，下部為Actin基因作為對照。具體實施例方式下面以半滑舌鰨為例，對本發明的技術內容進行詳細說明本發明技術內容包括一、半滑舌鰨親魚人工催產和授精；二、半滑舌鰨雌核發育二倍體魚苗的誘導和鑑定方法。一、半滑舌鰨親魚人工催產和授精它的技術內容包括1.親魚的選擇；2.催產激素的選擇和劑量；3.人工催產及人工授精；1.親魚的選擇研究用半滑舌鰨親魚為山東萊州明波水產有限公司和山東海陽黃海水產有限公司人工培育的半滑舌鰨親魚，雌核發育誘導實驗也是在上述兩個公司進行。選擇體表無損傷的半滑舌鰨雌性和雄性成魚作為親魚，雌魚體重應在為1.5-3kg/尾；雄魚體重為150-350g/尾，按每平方米一雌二雄的密度進行室內流水養殖，投餵貝類、野雜蝦和活沙蠶等新鮮活餌料，每天的投斜量為魚體重的2-4%。對達到性成熟年齡(雌性3年、雄性2年)的親魚，共選擇了400尾親魚，在催產前2-3個月進行控溫控光；在此期間，水溫按每10天升高0.5-rC從17-19。C逐步升高到22-23°C，並維持在此溫度；光照時間按每10天延長1小時由每天8小時逐漸延長到16小時，並維持在16小時。通過觀察和手摸檢查選擇性腺明顯隆起、用手輕壓性腺上下兩側有明顯的充實感且性腺前端有一定的柔軟度的雌魚，用於注射激素進行人工催產。雄性親魚要選擇輕擠性腺部位，可以看到精液流出者方可用於催產。2.催產激素的選擇和劑量通過反覆的試驗發現，半滑舌鰨對絨毛膜促性腺激素(HCG)、促黃體素釋放激素類似物A2和A3以及地歐酮(D0M)等各種催產激素都比較敏感，用較小的劑量就可以誘導雌魚排卵，各種激素均能用於催產生產。但是，各種激素的催產劑量不宜太高，經過4莫索後，本發明找到了較為有效的激素種類及其劑量分別為HCG:雌魚50-120IU/kg,雄魚300-500IU/kg;LRH-A2:雌魚0.5-2.0jig/kg，；^l魚3-6ng/kg;LRH-A3:辦i魚0.4-2.0ng/kg，力#魚2-5|ag/kg;另外，幾種激素組合也有較好的效果HCG+LRH-A3:雌魚HCG40-60IU+LRH-A30.4-1.5jag/kg;LRH-A3+D0M:對,魚LRH-A3Q.4—1.8jugkg+DOMl-2mg/kg。3.人工催產及人工授精(1)激素注射選好親魚後，按以上催產劑量注射催產激素。催產親魚數量比例按雌雄=1:4進行。注射時可以用MS-222進行麻醉或直4妻注射，直接注射時要在桌上鋪一層厚度〉4cm的海綿，在海綿上鋪上一塊海水浸溼的大毛巾，親魚從水中撈起後，迅速用大毛巾包住，以防其受傷。注射時要注意，激素溶液的注射量雌魚不要超過lml,雄魚不要超過0.2ml,注射部位為側線上方頭部後方的肌肉較厚部分，進針角度不要超過45°，雄魚注射時還要注意進針深度，不要穿透魚體。採取一次注射方式。(2)效應時間確定將注射激素後到擠卵的時間定為效應時間。不同激素的效應時間不盡相同，而且效應時間與親魚池的水溫也密切相關。經過:l莫索後確定了各種激素在水溫為23。C時的效應時間如下HCG:39-48h;LRH-A2:36-44h;LRH—A3:35—43h;HCG+LRH-A3:34-42;LRH-A3+D0M:35-43h。(3)人工擠卵和授精到達效應時間以後，要每30min檢查一次，當雌魚性腺由硬明顯變軟時，可進行擠卵和人工授精。擠卵時的操作和注射催產激素時一樣進行。當雌魚從水中撈起後，要注意用手按住生殖孔部位，以防卵流出或噴出並迅速用毛巾包好魚體，生殖孔一側露在外側並^^去海水。用手在上下兩側從後到前輕壓性腺部位，即可將卵擠出，接在燒杯中。採精時，用手擠壓雄魚腹部，將擠出的精液用吸管吸到2-5毫升的小瓶中備用，或直接將精液擠到有卵的燒杯中。當進行生產性授精時，每條雌魚的卵(100-300毫升)用2-3條雄魚的精液(1-2毫升)授精即可。將精卵混合均勻，加入2倍於卵量的海水，混合均勻完成授精操作，20min後洗去多餘精液即可轉入孵化缸中進行孵化。採用如上方法，我們成功地進行了多次人工催產實驗，獲得未受精卵3500多毫升，現將幾次催產實驗的結果列於表l。表l、半滑舌鰨人工催產和授精結果tableseeoriginaldocumentpage15tableseeoriginaldocumentpage16二、半滑舌鰨雌核發育二倍體魚苗的誘導和鑑定方法，包括二部分內容(一)半滑舌鰨雌核發育二倍體魚苗的誘導；(二)半滑舌鰨雌核發育二倍體魚苗的鑑定方法。(一)半滑舌鰨雌核發育二倍體魚苗的誘導它的技術內容包括1、精子的遺傳滅活；2、未受精卵與滅活精子的"授精"；3、雌核發育魚卵染色體加倍起始時間的確定；4、雌核發育魚卵染色體加倍冷休克溫度及處理時間的確定。1.精子的遺傳滅活經過篩選比較，本發明的實驗表明，同源的半滑舌鰨精子和異源的花逢盧精子都可以用來刺激半滑舌鰨卵子進行雌核發育。半滑舌鰨精液先用顯微鏡檢查精子活力(運動精子的百分率)，當運動精子的百分率達到60%以上者可用於紫外線滅活處理。精子的遺傳滅活條件為將100mL半滑舌鰨精液用精子冷凍稀釋液MPRS(配方為KC10.39g/L，CaCl2.2H200.17g/L,NaHCO30.25g/L，NaCl3.59g/L,NaH2P040.22g/L，MgCh0.23g/L,Glucose1.0g/L)稀釋10倍，平鋪於培養皿中，用90-110mJ/cm2紫外線照射，然後與5-10mL半滑舌鰨卵"授精"。異源精子為我們冷凍保存的花鱸精子。從液氮中取出花鱸冷凍精子，在37。C水浴復溫解凍後鏡檢精子活力，活力達到70%以上者用於紫外線失活處理。將lOOiaL解凍的花f盧精液用lmLMPRS溶液稀釋後，平鋪於培養皿中，分別用紫外線照射，劑量範圍為20，40，60,80，100，120，140,160fflJ/cm2。照射後的精液分別和5-10mL半滑舌鰨卵受精，在22-23。C恆溫培育，在細胞分裂後，統計受精率。待發育至嚢胚期，原腸期，肌節期，尾芽期時分別統計所剩數量，單倍體率及其發育情況。綜合考慮受精率，單倍體率及發育情況，表明用90-110mJ/cfi^的紫外線照射後的精子刺激卵雌核發育的效果較好，胚胎發育率高。2.未受精卵與失活精子的"授精"將以上經紫外線照射後的精液加到半滑舌鰨未受精卵(10-100毫升)中，將精卵輕輕搖動混勻，隨後加入2-10毫升海水，繼續混允後再加入20-200毫升海水完成4受精"過程，在23。C下培育2-10分鐘，準備用於染色體加倍處理。3、雌核發育魚卯染色體加倍起始時間的確定染色體加倍採用冷休克處理方法。在"授精，，後不同時間(2,3，4，5，6,7，8min),將卵倒入小抄網(直徑10-15釐米)，然後將盛有雌核發育卵的小抄網浸入3-6。C的海水浴中進行冷^f木克處理，冷休克處理時間為20-30min,冷休克處理完畢後將小抄網中的卵轉入23。C海水中培養。同時用同批精子進行單倍體對照。統計受精率，單倍體率，雌核發育二倍體率。結果發現雌核發育卵在"授精"後4-6rain進行冷休克處理都能夠誘導產生雌核發育二倍體，且以"授精"後5min的誘導率最高。其雌核發育二倍體相對誘導率達2.4±0.7%(圖1)。4.染色體加倍冷休克溫度和持續時間的篩選用90-110mJ/ci^劑量的紫外線(UV)處理花f盧精子，並與半滑舌鰨卵在23。C下4受精，受精後5min按照如下條件進行篩選。冷休克溫度設置為2。C,4°C,5°C，6°C，8。C和10°C6個梯度，冷休克處理時間設置為15min，20min,25min,30min,35min和40min。共計36組試驗。最後統計受精率，單倍體率，雌核發育二倍體率。結果表明在休克溫度3。C-6。C，休克時間15-30min條件下都可以誘導雌核發育二倍體，其中以4.5-5.5°C,20-25min條件下二倍體誘導率最高(圖2和圖3)。(二)、半滑舌鰨雌核發育二倍體魚苗的鑑定方法它的技術內容包括l.通過染色體分析鑑定雌核發育魚苗；2.通過^t衛星分子標記鑑定雌核發育魚苗；3.通過半滑舌鰨雌性特異AFLP標記鑑定雌核發育魚苗。1.染色體分析鑑定雌核發育魚苗(1)半滑舌鰨胚胎和魚苗染色體製備根據染色體製備的常規方法進行改進後進行半滑舌鰨雌核發育胚胎和魚苗染色體的製備。主要步驟包括將胚胎或魚苗置於0.02%的秋水仙素中，在室溫下處理2個小時。然後把胚胎或魚苗放入0.075mol/L的KCL中低滲30分鐘。用新配製的卡諾氏液(曱醇冰醋酸=3:1)連續固定3次，每次20分鐘。再取單個胚胎或魚苗放入50%的冰醋酸中，用尖鑷子撕碎胚胎，使細胞游離；採用熱滴片法滴片，10%吉姆薩染液染色20分鐘，然後在IOOO倍顯微鏡下鏡檢。(2)染色體鑑定結果由於花鱸染色體數目為2n=48條，其核型為48t;而半滑舌鰨染色體數目為2n=42,其核型為421。因此花妒的染色體數目與半滑舌鰨相差很大，通過染色體分析即可證明雌核發育魚苗是否為雌核發育而來。如果雌核發育魚苗的染色體數目及核型與母本(半滑舌鰨)相同，則證明這些魚苗是雌核發育而來。本發明採用常規方法對半滑舌鰨雌核發育胚胎和魚苗進行了染色體分析，發現半滑舌鰨雌核發育魚苗的染色體數為42條，與半滑舌鰨染色體數目完全相同；同時我們還發現有些雌核發育個體含有2條巨型WW染色體，這些個體為雌核發育的WW類型(圖4)。由此證明這些魚苗為雌核發育二倍體個體。2.用微衛星標記鑑定半滑舌鰨雌核發育魚苗微衛星標記具有較高的多態性以及共顯性遺傳的特性，能夠檢測出種群及個體間的異質性，可以用於檢測雌核發育二倍體的遺傳結構及其與雌性親本的遺傳同質性。因此，我們利用微衛星標記鑑定雌核發育魚苗。(1)基因組DNA的提取採取高鹽法提取半滑舌鰨雌核發育個體和正常二倍體個體基因組DNA:首先將固定於無水乙醇中的魚苗或鰭條置於l.5ml離心管中，剪碎後加入400n1TNES裂解液(lOmMTris-HCl，pH7.5,400jaMNaCl，100mMEDTA,0.6%SDS)和IOjil蛋白酶K(10mg/ml),然後於55。C消化。消化完全後，加入140iaK包和氯化鈉溶液，混勻，12000rpm/min4。C離心30min。取上清液，加入兩倍體積-2(TC預冷的無水乙醇沉澱，然後將絮狀沉澱用無菌的吸頭挑出後用70。/。乙醇洗滌兩次，待乙醇完全揮發後，用50jalTE(10mMTris-HCl,pH8.0，10mMEDTA)溶解DNA。(2)PCR擴增PCR反應體系為IOnl，包括lxPCRbuffer[20mMTris-HCl，PH8.4,20mMKC1，10mM(NH4)2S04]，10—50ng基因組DNA，0.2pM引物，120juMdNTPs,1.5mMMgCl2和O.5Ura《酶(TaKaRa)。PCR擴增條件為94。C熱變性5min，然後進行38個循環，每個循環包括94°C變性30s,56-62。C退火30s，72。C延伸30s,最後在72。C延伸7min。用於4全測雌核發育半滑舌鰨的微衛星標記為Cyse31,其引物序列為正向引物序列GACGGTCAAAAGTGGTGTGA;反向引物序列TTTCCACTGTTCACCTGCTG(3)聚丙烯醯胺凝膠電泳在PCR產物中加入5jul的曱醯胺上樣液(其中包含O.01MEDTA，1mg/mU臭芬藍，1mg/ml二曱苯青)於95。C變性5分鐘，然後立刻放在冰水中。變性後的PCR產物於6。/。的變性聚丙烯醯胺凝膠上電泳，以pBR322DNA/#wI(TIANGEN)作為分子量標準，銀染法染色。(4)結果分析首先通過微衛星富集文庫法構建了半滑舌鰨微衛星富集文庫，從中篩選出多態性微衛星標記。然後用這些多態引物在正常魚苗和雌核發育魚苗中進行擴增，從中進一步篩選出在正常群體裡雜合率較高、在雌核發育群體裡純合率較高的標記。經過篩選，從半滑舌鰨微衛星富集文庫中篩選到的微衛星標記Cyse31可以用來鑑定半滑舌鰨雌核發育二倍體，該標記在18尾半滑舌鰨普通魚苗中擴增出2個等位基因(即雜合子)的比例為55.6%;而在25尾雌核發育魚苗中，有20尾個體只擴增出1個等位基因(純合子比例為80%)，僅有5尾個體擴增出2個等位基因，雜合子比例僅為20%(見圖5),並且在所有檢測的雌核發育個體中僅出現2個等位基因(圖5)。由以上結果可以證明雌核發育魚苗確實是由雌核發育而來。3.用半滑舌鰨雌性特異AFLP標記鑑定雌核發育魚苗採用我們以前建立的半滑舌鰨雌性特異標記和遺傳性別鑑定技術，可以鑑定出半滑舌鰨雌核發育魚苗的遺傳性別。才艮據半滑舌鰨雌性異配的特點，即半滑舌鰨雌性親魚產生2種卵子，Z型卵和W型卵，因此在雌核發育魚苗中就產生2種類型，一種是ZZ型雄魚，另一種則是WW型超雌魚。我們以前建立的半滑舌鰨遺傳性別鑑定的PCR技術可以從具有W染色體的個體中擴增出特異DNA片段，而ZZ雄性個體則沒有這種特異DNA片段。採用雌性特異PCR引物Cse382Nl(序列為ATTCACTGACCCCTGAGAGC)和Cse382Cl(序列為GTAAACAGCACACACTCAACAA)，利用高鹽法提取半滑舌鰨雌核發育魚苗個體DNA作為模板，進行PCR擴增。PCR反應體系為25.Oji1，包括2.5jul10xPCR緩衝液，L0|a12.5mMdNTP,2.0ju110pM引物混合液，基因組DNA0.8-1.5jul，雙蒸水16.3-17jul，Taq酶(5Us/|al)0.2/al。PCR條件為95。C預變性5分鐘，然後95。C30秒、66。C30秒、72。Cl分鐘，35個循環，最後在72。C延伸10分鐘，進行1%瓊脂糖電泳檢測，我們從10尾異精雌核發育半滑舌鰨魚苗中成功地檢測到4尾魚苗含有382bp的雌性特異DNA片段，而在用半滑舌鰨精子授精的10尾普通魚苗中，也才企測到4尾魚苗含有382bp的雌性特異DNA片段(圖6),表明我們獲得的半滑舌鰨魚苗中含有4oy。左右的ww超雌魚苗。三、雌核發育二倍體魚苗誘導實施結果採用上述建立的半滑舌鰨雌核發育方法，我們10多次成功地獲得了半滑舌鰨雌核發育二倍體魚苗。現將半滑舌鰨雌核發育魚苗研製的代表性結果列於表2。表2、半滑舌鰨雌核發育二倍體魚苗誘導的主要結果編號精子對照受精率°/。雌核發育二倍體相對誘導率(°/)獲得雌核發育二倍體魚苗數(尾)1花鱸670.93002花鱸561.34003花鱸782.85004花鱸430.62005花鱸742.510006花鱸702.510007花鱸68110008花鱸820.81209半滑舌鰨895.6300010半滑舌鰨696.3200011半滑舌鰨590.480權利要求1.一種半滑舌鰨親魚人工催產和授精方法，其特徵在於他的方法包括(1)親魚的選擇；(2)催產激素的選擇和劑量；(3)人工催產及人工授精；(1).親魚的選擇方法半滑舌鰨親魚為3齡雌魚和2齡雄魚，在催產前2-3個月進行控溫控光；在此期間，水溫按每10天升高0.5-1℃，從17-19℃逐步升高到22-23℃，並維持在此溫度；光照時間按每10天延長1小時，由每天8小時逐漸延長到16小時，並維持在16小時；通過觀察和手摸檢查選擇性腺明顯隆起、用手輕壓性腺上下兩側有明顯的充實感且性腺前端有一定的柔軟度的雌魚，用於注射激素進行人工催產；雄性親魚要選擇輕擠性腺部位，看到精液流出者方可用於催產；(2)、催產激素的選擇和劑量半滑舌鰨對幾種催產激素較為敏感，如絨毛膜促性腺激素HCG、促黃體素釋放激素類似物A2和A3以及地歐酮DOM，其中如下幾種激素及其劑量催產效果較好LRH-A2的適宜劑量為雌魚0.5-2.0μg/kg，雄魚3-6μg/kg；LRH-A3的適宜劑量為雌魚0.4-2.0μg/kg，雄魚2-5μg/kg；HCG+LRH-A3的適宜劑量為雌魚HCG40-60IU+LRH-A30.4-1.5μg/kg；LRH-A3+DOM的適宜劑量為雌魚LRH-A30.4-2.0μg/kg+DOM1-2mg/kg；(3).人工催產及人工授精技術內容包括A、激素注射；B、效應時間確定；C、人工擠卵和授精；A、激素注射選好親魚後，按催產劑量進行激素注射；注射時用MS-222進行麻醉或直接注射，親魚從水中撈起後，迅速用大毛巾包住，以防其受傷；激素溶液的注射量雌魚不要超過1ml/每尾，雄魚不要超過0.2ml/每尾，注射部位為側線上方頭部後方的肌肉較厚部分，進針角度不要超過45°，雄魚注射時不要穿透魚體；B、效應時間確定激素種類不同，注射後的效應時間也不同，各種激素22-23℃時的效應時間如下LRH-A236-44h；LRH-A335-43h；HCG+LRH-A334-42；LRH-A3+DOM35-43h；C、人工擠卵和授精到達效應時間以後，當雌魚性腺明顯由硬變軟，感覺性腺內的卵有明顯的流動感時，即進行擠卵和人工授精；用手在性腺上下兩側從後到前輕壓性腺部位，將卵擠出，接在燒杯中；採精時，用手擠壓雄魚腹部，擠出的精液用吸管吸到2-5毫升的小瓶中備用；當進行生產性授精時，每條雌魚產出的卵約100-300毫升，可用2-3條雄魚的精液約1-2毫升授精；將精卵混合均勻，加入兩倍於卵體積的海水，2-3分鐘後，再加入5-8倍於卵體積的海水完成受精過程，20min後洗去過多的精液即可轉入孵化缸進行孵化；2、一種半滑舌鰨雌核發育二倍體魚苗的誘導和鑑定方法，其特徵在於他的方法包括(1)半滑舌鰨卵子人工雌核發育方法；(2)雌核發育魚苗的鑑定方法；(1)、半滑舌鰨卵子人工雌核發育方法它的技術內容包括A、精子的遺傳滅活；B、未受精卵與失活精子的"授精"；C、雌核發育魚卵染色體加倍起始時間的確定；D、雌核發育魚卵染色體加倍冷〗木克溫度及處理時間的確定；A.精子的遺傳滅活釆用異源的花鱸精子和同源的半滑舌鰨精子刺激半滑舌鰨卵子進行雌核發育；半滑舌鰨精液先用顯微鏡檢查精子活力，當活力達到60%以上者可用於紫外線滅活處理；精子的遺傳滅活條件為將100inL半滑舌鰨精液用精子稀釋液MPRS稀釋10倍，平鋪於培養皿中，用90-110roJ/cm2紫外線照射，然後與5-lOmL半滑舌鰨卵"授精"；異源精子為冷凍保存的花鱸精子，從液氮中取出花鱸冷凍精子，在37。C水浴復溫解凍後鏡檢精子活力，活力達到60%以上者用於紫外線滅活處理；將100nL解凍的花鱸精液用lmLMPRS溶液稀釋後，平鋪於培養皿中，用90-110mJ/cm2紫外線照射，然後與5-10mL半滑舌鰨卵受精，在22-23。C恆溫培育；B.未受精卵與失活精子的"授精"經紫外線照射後的4青液200-1000IliL加到10-100毫升半滑舌鰨未受精卵中，將精卵輕輕搖動混勻，隨後加入2-10毫升海水，繼續混勻後，再加入20-200毫升海水完成"授精"過程，在22-23。C下培育2-6分鐘，準備用於染色體加倍處理；C.雌核發育魚卵染色體加倍起始時間的確定染色體加倍採用冷休克處理方法，在"授精，，後2,3,4,5,6，7,8min,將卯倒入直徑為10-15釐米的小抄網，將盛有雌核發育卵的小抄網浸入3-6。C的海水浴中進行冷休克處理，冷^木克處理時間為20-30min，冷休克處理完畢後將卵移入23。C海水中培養；統計受精率，單倍體率，雌核發育二倍體率；結果表明在授精後4-6min中都能夠誘導產生雌核發育二倍體，且以授精後5min的誘導率最高；D.染色體加倍冷休克溫度和持續時間的篩選在確定了冷休克起始時間後，需要確定冷休克溫度和休克持續時間；將與紫外失活精子"授精，，的卵，分成6個溫度梯度2。C,4°C,5°C,6°C,8。C和1(TC,在每個溫度梯度分別處理15min,20min,25min，30min,35min,40min;最後統計受精率，單倍體率，雄核發育二倍體率；結果表明在休克溫度3°C-6°C，休克時間15min-30min條件下都可以誘導雌核發育二倍體，其中在4.5-5.5。C處理20-25min的雌核發育誘導率最高；(2)、雌核發育魚苗的鑑定方法它的技術內容包括A.染色體分析筌定雌核發育魚苗；B.通過微衛星分子標記鑑定雌核發育魚苗；C.通過半滑舌鰨雌性特異AFLP標記鑑定雌核發育魚苗；A.染色體分析鑑定雌核發育魚苗採用常規染色體製片方法，對半滑舌鰨雌核發育魚苗進行染色體分析，發現半滑舌鰨雌核發育魚苗的染色體數為42條，與普通半滑舌鰨魚染色體數目完全相同；同時我們還發現有些雌核發育魚苗含有2條巨型WW染色體，這些魚苗是雌核發育的WW型魚苗；由此充分證明這些魚苗為雌核發育二倍體個體；B.用微衛星標記鑑定雌核發育魚苗採取高鹽法提取雌核發育魚和正常魚苗基因組DNA，從我們篩選到的半滑舌鰨多態性微衛星引物中，選取微衛星引物Cyse31，其引物序列為Cyse31Nl:GACGGTCAAAAGTGGTGTGA;Cyse31Cl:TTTCCACTGTTCACCTGCTG.然後進行PCR擴增，PCR擴增條件為94。C熱變性5min，然後進行38個循環，每個循環包括94。C變性30s,56-62。C退火30s,72。C延伸30s，最後在72。C延伸7min;PCR擴增產物在6"/。的聚丙烯醯胺凝月交上進行電泳分離，採用銀染法染色；結果表明該引物對在半滑舌鰨普通魚苗中擴增出具有2個等位基因的雜合子的比例為55.6%，而在25尾雌核發育魚苗中，有20尾只擴增出l個等位基因，僅有5個個體擴增出2個等位基因，雜合率僅為20%，並且在所有4企測的雌核發育魚苗中僅出現2個等位基因，由此證明這些魚苗是雌核發育而來；C.用半滑舌鰨雌性特異AFLP標記鑑定雌核發育魚苗採用半滑舌鰨雌性特異AFLP標記和遺傳性別鑑定的PCR技術進行半滑舌鰨雌核發育魚苗遺傳性別的鑑定；其技術原理為含有W染色體的雌性個體中可以擴增出雌性特異DNA片段，不含W染色體的ZZ雄性個體則沒有這種特異DNA片^殳；採用序列為ATTCACTGACCCCTGAGAGC的特異引物Cse382Nl和序列為GTAAACAGCACACACTCAACAA的特異引物Cse382Cl，利用高鹽法提取半滑舌鰨雌核發育魚苗個體DNA作為模板，進行PCR擴增；PCR反應體系為25.Oji1,包括2.5jil10xPCIU爰衝液，l.O)al2.5mMdNTP,2.0ju110pM引物混合液，基因組DNA0.8-1.5ji1,雙蒸水16.3-17jul，5U/ja1的Taq酶0.2ju1;PCR擴增條件為95。C預變性5分鐘，然後95。C30秒、66。C30秒、72。Cl分鐘，35個循環，最後在72。C延伸10分鐘，採用1%瓊脂糖電泳分析PCR產物；從10尾異精雌核發育半滑舌鰨魚苗中4僉測到4尾魚苗含有382bp的雌性特異DNA片段，表明我們獲得的半滑舌鰨雌核發育魚苗中含有40%左右的超雌魚苗。全文摘要一種半滑舌鰨人工催產和雌核發育二倍體魚苗的誘導方法，包括親魚人工催產、精子的遺傳失活、雌核發育二倍體魚苗的誘導及鑑定方法。本發明首次建立了半滑舌鰨人工催產獲得批量化未受精卵的方法，首次建立了採用半滑舌鰨精子和花鱸精子誘導半滑舌鰨卵子雌核發育獲得雌核發育二倍體魚苗的方法，篩選到人工催產有效的激素種類和劑量，篩選到適合半滑舌鰨卵雌核發育的冷休克起始時間、冷休克溫度和時間，建立了半滑舌鰨雌核發育魚苗的鑑定方法。本方法獲得半滑舌鰨卵的受精率為60-89％，孵化率為34-79％，雌核發育魚苗誘導率為0.4-6.3％；本發明具有先進、高效、實用、可靠的特點，在半滑舌鰨苗種繁育、性別控制和全雌育種上具有重大應用價值和廣闊的推廣應用前景。文檔編號A01K61/00GK101185425SQ20071011430公開日2008年5月28日申請日期2007年11月1日優先權日2007年11月1日發明者季相山,廖小林,徐建勇,楊景峰,武鵬飛,田永勝,翟介明,蘇鵬志,邵長偉,陳松林申請人:中國水產科學研究院黃海水產研究所