經引入編碼草酸氧化酶的基因生產抗桑條菌核病核盤黴攻擊的植物的製作方法

2023-09-16 20:27:15 1

專利名稱：經引入編碼草酸氧化酶的基因生產抗桑條菌核病核盤黴攻擊的植物的製作方法
技術領域：
本發明涉及編碼草酸氧化酶的基因、由該基因編碼的蛋白質，包含該基因的嵌合基因、以及將它們用於植物轉化以賦予植物抗真菌病抗性的方法。
菌核病是影響大量雙子葉植物的主要真菌病。其病原因子桑條菌核病核盤黴(Sclerotinia Sclerotiorum)是表現有很少宿主特異性的多屬主真菌。
該真菌可直接在植物的莖部攻擊植物，也可在葉子上攻擊然後播散到莖部，也可在花的頭狀花序水平上攻擊植物。前兩種情況，植物因營養供應中斷而枯萎;後一種情況，則可導致花的萎縮進而損害收成。
該真菌可產生破壞被感染植物細胞壁的溶解酶，並促進其在植物中的發育繁殖。這些酶在致病性中起著重要但似乎並非足夠的作用。這種真菌也產生草酸(Godov et al，1990)。這種草酸可降低被感染組織的pH值，進而促進溶解酶對細胞壁的水解作用。減少草酸的產生量或破壞之，將會延緩甚至抑制真菌的發育。
為產生「nos」抗性植物，可採用使草酸解毒的戰略。破壞該酸將限制被攻擊植物組織細胞內pH值的降低，從而使溶解酶只能在遠離表現其活性和效力最適pH值之pH值條件下發揮作用。這樣便可導致真菌致病性的降低。
可使用催化下列反應的草酸氧化酶實現本發明的目的
可從各種植物通常是單子葉植物中分離草酸氧化酶(Pieta et al，1984)，例如，可使用常規層析技術(Sephadex G-75過濾凝膠和MonoQ離子交換凝膠，Pharmacia)從大麥中純化這種蛋白質，按照下述比色法(Obzansky和Richardson，1983)監測酶促活性
MBTH＝3-甲基-2-苯並噻唑啉酮腙DMA＝N，N-二甲基α-丙氨酸經過上述處理後，有可能於變性條件下在丙烯醯胺凝膠上純化分子量為26，000道爾頓的蛋白質。用一部分純化的草酸氧化酶製取兔抗草酸氧化酶抗體;將蛋白質的其餘部分用來進行天然蛋白質(N末端)的序列分析，或者在溴化氰裂解後，對某些內部肽段作序列分析。所得結果如下N末端SDPDPLQDF-VADLDGKAVSVNGH內部肽No.2HFQFNVGKTEAY
CDNA將上述肽序列與得自蛋白質文庫Swiss-Prot的資料相比較，就能夠鑑定稱為Germine並由Dratewka-kos等人於1989年公開的小麥蛋白質。完成實驗，使我們能夠確定作者公開的CDNA編碼表現出草酸氧化酶活性的含201個胺基酸的蛋白質。涉及本專利申請中提到的其它實驗描述部分，我們將使用作者在J.Biol，chem，264，4896-4900-文之圖2中的核苷酸序列編號。
該CDNA的序列長度為1075個核苷酸，其中5′非轉譯區有85個殘基，開放讀碼為672個核苷酸(從86-757位)，3′非轉譯區有318個殘基。
根據此CDNA序列推斷的蛋白質序列與測定天然蛋白質得知的序列相比較，表明CDNA不僅編碼成熟草酸氧化酶，而且還編碼N末端部分中23個胺基酸的信號肽。因此草酸氧化酶最初是以前蛋白質的形式合成的(即信號肽加上成熟肽)，後者須經過一個成熟過程，除去信號肽以釋放出成熟的活性酶。
下文中，我們將使用編碼前蛋白質的部分(核苷酸86到757)，或只使用編碼成熟蛋白質的部分(從155位到757位)，在後一種情況下，AUG密碼子(編碼蛋氨酸)應位於ACC密碼子(編碼蘇氨酸，即成熟蛋白質的第一個胺基酸)的前面。
桑條菌核病核盤黴對植物的攻擊基本上是通過植物的莖，這樣便有利於在葉綠體組織中或植物的其他不同組織中表達草酸氧化酶;在前一種情況下，可使用1，5-二磷酸核酮糖羧基酶小亞基(Helianthus annuus)(SSuHa，Waksman et al，1987)的啟動子，對於後一種情況，我們將使用普遍存在的花椰菜花葉病毒(其一部分是複製的、並被稱為「雙(CaMV″)的35SRNA(CaMV35S)的啟動子。
例如可由下列元件來構造本發明的嵌合基因A、雙CaMV啟動子後面連接一部分編碼前蛋白質(信號肽加上成熟肽)的草酸氧化酶cDNA及得自pTi37藍曙紅(nopaline)合成酶基因(Bevan et al，1983)的終止子「nos」。
B、雙CaMV啟動子後面接有部分只編碼成熟蛋白質的草酸氧化酶cDNA，再後面是終止子「nos」。
C、基因與「A」相同，但以向日葵1，5-二磷酸核酮糖羧基酶小亞基(SSuHa)的啟動子代替雙CaMV啟動子。
D、基因與「B」相同，但用SSuHa的啟動子代替雙CaMV啟動子。
以使用土壤桿菌的系統或任何已知用於轉化植物細胞的其他系統將各嵌合基因導入植物細胞中。由這些轉化的細胞再生植物。這些植物均提高了對桑條菌核病核盤黴的抗性。
實施例1製備兩個編碼序列A、前蛋白質它得自於用HindⅡ消化(在位置66處)的上述cDNA。其粘性末端用klenow聚合酶處理成平頭。然後用NheⅠ消化(在位置811處)該DNA。
用SacⅠ平行消化質檢PVC19(Yanisch-Perro et al.，1985)。
經用Klenow聚合酶處理將所得到粘性末端修成平頭。然後用XgaⅠ(與NheⅠ相配合)消化質粒。
連接如上製備的cDNA片段和質粒。如此得到的新質粒定名為pRPA-oxo-01，其酶切圖示於


圖1中。
B、成熟蛋白質它得自於用BstNI消化(在位置173處)的上述cDNA。連接所得片段和該序列的接頭5』3』ATGACCGACCCAGACCCTCTCCTACTGGCTGGGTCTGGGAGAGGT3』 5』如此便導致對跨越TDPDPLQ至MTDPDPLQ之成熟蛋白質N末端序列的修飾。
然後用NheⅠ消化(在位置811處)該cDNA片段，使之能夠與按上述方法製得的質粒PUC19相連接。如此形成的新質粒被稱為pRPA-oxo-02，其酶切圖示於
圖1中。
實施例2製備嵌合基因a、製備含有啟動子和終止子nos的載體以雙CaMV為例該載體得自於按下述方法製得的質粒PRPA-BL-410;
「玉米RuBisCo/AroA基因之SSU的轉運肽」融合體玉米RuBisCO基因之SSU的轉運肽衍生於192bp的EcoRI-SphⅠ片段;它得自於Lebrun等人(1987)所述玉米RuBisco基因之SSu基因的cDNA，帶有跨越轉移起始密碼子的NcoⅠ位點和相當於轉送肽之切割位點的SphⅠ位點。
用T4噬菌體聚合酶處理SphⅠ末端，並使其與用EcoRI再切割之pRPA-BL104中的AroA基因並經klenow聚合酶處理的NcoⅠ末端連接，獲得玉米轉運肽和細菌EPSPS基因間的轉移融合體。
「玉米RuBisCO之SSU的轉運肽/玉米RuBisCO之SSU成熟部分的22胺基酸序列/AroA基因」融合體以相似方式，將玉米RuBisCO基因之SSU的228bp cDNA的EcoRI-Hind Ⅱ片段與klenow聚合酶處理的PRPA-BL104中之AroA基因的NcoⅠ末端相連接並用EcoRⅠ再次切割。得到玉米RuBisCO之SSU的轉運肽、玉米RuBisCO之SSU成熟部分的22胺基酸和細菌EPSPS基因間的轉移融合體。
向日葵RuBisCO之SSU的轉換肽該片段得自於由Waksman和Freyssinet(1987)分離的cDNA。按照Zoller和Smith(1984)的方法在轉換肽的裂解位點產生SphⅠ位點。如此製得的向日葵RuBisCO之SSu的轉換肽即為171bp的EcoRⅠ-SphⅠ片段。
「向日葵RuBisCO之SSu的轉換肽/玉米RuBisCO之SSU成熟部分22胺基酸序列/AroA基因」融合體用相當於所說的向日葵RuBisCO基因之SSU的轉換肽的171bp EcoRⅠ-SphⅠ切割含有「玉米RuBisCO之SSU的轉換肽/玉米基因成熟部分之玉米RuBisCO之SSU的22胺基酸序列」融合體的構建體。所得之構建體呈現有EcoRⅠ-SphⅠ片段的取代，並是「向日葵RuBisCO之SSU轉運肽/玉米RuBisCO之SSU成熟部分的22胺基酸序列/AroA基因」融合體。
使EcoRⅠ-SalⅠ片段與含有T-DNA之3′nos序列和右側端的SalⅠ-SstⅠ片段相連接。所得到的含有「向日葵RuBisCO之SSU的轉換肽/玉米RuBisCO之SSU成熟部分的22胺基酸序列/AroA基因/3′nos/T-DNA右側端」的EcoRⅠ-SstⅠ片段取代了含有雙CaMV啟動子質粒150Aα2的T-DNA右側端的EcoRⅠ-SstⅠ片段。轉移融合體「雙CaMV/向日葵RuBisCO之SSU的轉換肽/玉米RuBisCO之SSU成熟部分的22胺基酸序列/AroA基因/3′nos「在載體150α2中稱為PRPA-BL294。
「向日葵RuBisCO之SSU的轉換肽/玉米RuBisCO之SSU的22胺基酸序列/玉米RuBisCO之SSU的轉換肽/AroA基因」融合體用NcoⅠ-HindⅢ切割上述構建體以釋放出AroA基因。然後將其與含有「玉米RuBisCO之SSU的轉換肽/AroA基因」融合體的1.5kbp NcoⅠ-HindⅢ片段相連接。所得構建體呈現NcoⅠ-HindⅢ片段的取代並且是轉運融合體「向日葵RuBisCO之SSU的轉換肽/玉米基因成熟部分RuBisCO之SSU的22胺基酸序列/玉米RuBisCO之SSU的轉運肽/AroA基因」。
a、使EcoRⅠ-SalⅠ片斷與含有T-DNA之3′nos序列和右側端的SalⅠ-SstⅠ片斷連續。所得到的含有「向日葵RuBisCO之SSU的轉運肽/玉米基因成熟部分RuBisCO之SSU 22胺基酸序列/玉米RuBisCO之SSU的轉運肽/AroA基因/3′nos/T-DNA右側端的EcoRⅠ-SstⅠ片斷取代了含有包括雙CaMV啟動子之質粒150Aα2T-DNA右側端的EcoRⅠ-SstⅠ片斷。轉錄融合體」雙CaMV/向日葵RuBisCO之SSU的轉運肽/玉米基因成熟部分RuBisCO之SSU的22胺基酸序列/玉米RuBisCO之SSU的轉運肽/3′nos″在載體150Aα2中稱為PRPA-BL410。用EcoRⅠ和SalⅠ消化該質粒，以除去結構基因「最佳化轉運肽-成熟EPSPS編碼區」，即消除PRPA-BL-410(見
圖1)。
以SSUHa為例該載體得自於質粒PRPA-BL-207(已在歐洲專利申請，0，337，899中述及)，用EcoRⅠ和HindⅢ消化所說的質粒以除去腈水解酶編碼區，即消除PRPA-BL-201(見
圖1)。
b、嵌合基因的構建PRPA-oxo-03它是用EcoRⅠ和SalⅠ消化PRPA-oxo-01得到的。然後將所得到的編碼前蛋白質的片段分別插入在雙CaMV下遊和終止子nos上遊的EcoRⅠ和SalⅠ位點之間。
PRPA-oxo-04它是用EcoRⅠ和SalⅠ消化PRPA-oxo-02得到的。然後將所得到的編碼成熟蛋白質的片段分別插入在雙CaMV下遊和終止子nos上遊的EcoRⅠ和SalⅠ之間。
PRPA-oxo-05它是用EcoRⅠ和HindⅢ消化PRPA-oxo-01得到的。然後將所得的編碼前蛋白質的片段分別插入位於雙SSUHa下遊和終止子nos上遊的EcoRⅠ和HindⅢ位點之間。
PRPA-oxo-06它是用EcoRⅠ和HindⅢ消化PRPA-oxo-02得到的。然後將所得到的編碼成熟蛋白質的片斷分別插入位於SSUHa啟動子下遊和終止子nos上遊的EcoRⅠ和HindⅢ之間。
表Ⅰ四個嵌合基因的簡略說明代號 啟動子 草酸氧化 終止子酶編碼區PRPA-oxo-03 dCaMV 前蛋白質 nosPRPA-oxo-04 dCaMV 成熟蛋白質 nosPRPA-oxo-05 SSuHa 前蛋白質 nosPRPA-oxo-06 SSuHa 成熟蛋白質 nos
實施例3生產轉基因油菜a、轉化將上述各載體導入攜帶裝配型質粒pTVK291(Komari et al，1986)的非致瘤性瘤病土壤桿菌菌株EHA101(Hood et al，1987)中。
轉化油菜(westar變種)的方法基本上與Boulter等人(1990)所述相同，其中使用的細菌濃度為2.5×109個/ml(OD600nm＝1)。
b、植株再生再生方法基本上與Boulter等人(1990)所述相同。植物在De Block等人所介紹(1989)的培養基中生根。然後在溫室內進入開花階段。
實施例4檢測油菜對桑條菌核病核盤黴的抗性體外實驗一葉片在含有激素、添加1mM草酸的Murashige和Skoog(MS)培養基上生長11天後，對三片葉片稱重以檢測抗真菌抗性。
在這些條件下，觀察到從使用嵌合基因PRPA-oxo-03、PRPA-oxo-04、PRPA-oxo-05和PRPA-oxo-06之一修飾的油菜得到的葉片之質量有明顯增加，而從未經修飾的油菜得到的葉片質量則無變化甚至減少。
一根伸長在添加5mM草酸的水上生長兩天後檢查根伸長，體外測定上述抗性。在這種情況下觀察到用嵌合基因PRPA-oxo-03，PRPA-oxo-03，PRPA-oxo-04之一修飾之油菜植物的根能夠生長並增加了長度，而未修飾的油菜的根則在這些條件下未見生長。
體內實驗
在第一個花出現時，立即在花瓣上塗敷桑條菌核病核盤黴孢子，從而在花落期間自然發生葉子的感染，或者直接將菌絲體系塗敷在葉子上或將浸漬了菌絲體的花瓣置於葉子上，以汙染再生形成的油菜植物，然後在溫室中體內檢測抗性。用嵌合基因PRPA-oxo-03，PRPA-oxo-04、pRPA-oxo-05和pRPA-oxo-06之一修飾的植物使真菌不能發育，而且完全沒有出現菌核病的特徵性枯萎病症，而未修飾的植物則因桑條菌核病核盤黴的發育迅速枯萎。
權利要求
1.編碼草酸氧化酶的DNA序列。
2.一種蛋白質，即草酸氧化酶，它可用於使植物對抗由核盤黴真菌引起的病害。
3.包含根據權利要求1之DNA編碼序列的嵌合基因。
4.用於轉化植物的載體，它包含根據權利要求3的嵌合基因。
5.含有根據權利要求4之載體的被轉化的植物細胞。
6.得自根據權利要求5之細胞的被轉化的植物。
7.根據權利要求6的植物，其為雙子葉植物。
8.根據權利要求7的植物，其為油菜。
全文摘要
1)編碼草酸氧化酶的DNA序列。2)可用於使植物對抗由核盤黴真菌引起的病害。它可由嵌合基因和含有編碼序列的載體提供。3)它可使植物提高對核盤黴真菌引起之病害的抵抗力。
文檔編號A01N63/00GK1065683SQ92101989
公開日1992年10月28日 申請日期1992年2月28日 優先權日1991年3月5日
發明者喬治·弗雷西內, 阿蘭薩揚 申請人:羅納-普朗克農業化學公司