使靶細胞可逆染色的方法
2023-09-16 17:07:55 5
使靶細胞可逆染色的方法
【專利摘要】本發明涉及使靶細胞可逆染色的方法。本發明還涉及分離靶細胞或由存在至少一個共同特異性受體分子定義的靶細胞群的方法。本發明還提供了可用於實施本發明所述方法的試劑盒。
【專利說明】使靶細胞可逆染色的方法
[0001]相關專利申請的交叉引用
[0002]本專利申請要求於2011年7月18日向美國專利和商標局提交的美國臨時專利申請 61/508，943 的「Method of Reversibly Staining a Target Cell」的優先權的權益,該申請以引用的方式全文併入本文。
發明領域
[0003]本發明涉及使靶細胞可逆染色的方法。本發明還涉及分離由存在至少一種共同特異性受體分子定義的靶細胞或靶細胞群的方法。本發明還提供了可用於實施本發明的方法的試劑盒。
_4] 發明背景
[0005]細胞療法對許多疾病的治療是高效的已經得到證明。例如，原發性免疫缺陷可以通過造血幹細胞移植(HSCT)治癒，某些白血病可以通過異體HSCT和供者淋巴細胞輸注(DLI)的組合得到完全緩解(Kolb, H.J.等，Donor leukocyte transfusions fortreatment of recurrent chronic myelogenous leukemia in marrow transplantpatients.Blood76 (12)，2462-2465 (1990))。在一些臨床環境中，病毒特異性T細胞的過繼轉移對重建免疫功能低下患者對抗由巨細胞病毒(CMV)造成的威脅生命的併發症(Riddell，S.R.等,Restoration of viral immunity in immunodeficient humansby the adoptive transfer of T cell clones.Science257 (5067)，238-241 (1992))或由Epstein-Barr-病毒(EBV)介導的淋巴組織增生性疾病(Rooney，C.M.等，Use of gene-modified virus-specific T lymphocytes to controlEpstein-Barr-virus-related lymphoproliferation.Lancet345(8941), 9-13(1995))非常有效。同樣，無論是源自自身腫`瘤浸潤性淋巴細胞還是培養或體外設計的腫瘤抗原定向T細胞都是對改進療法有前景的候選項。
[0006]無論這些有趣的臨床觀察結果如何，細胞療法更廣泛轉移到臨床應用仍然需要等待。這主要是由於這樣的事實，用於產生免疫治療的細胞製備物的多數程序是非常費時、費力並且昂貴的。此外，已知的用於調節臨床療效的細胞群通常需要被富集到很高的純度，因為「不需要的」細胞的汙染可能會介導有害的且有時危及生命的副作用(如移植物抗宿主病(GvHD)是由異種反應性T細胞在同種異基因幹細胞移植和/或DLI治療中介導的)。已有研究表明，極少量過繼轉移T細胞可以促進有益的臨床療效，同樣的規則也適用於細胞群介導的負面影響。因此，提供適用於治療的定義明確的高純度細胞製備物成為使這些有前景的療法更有效和可預測並且降低潛在副作用風險的關鍵。
[0007]目前表面標記物介導的臨床細胞純化的方法通常依賴於單一的參數(如，⑶34，MHC多聚體)。但是，對於多數細胞群一無論直接是源自離體的還是在體外細胞培養後的一不同表面標記物的組合是必須的，以便從其它細胞中真正將這些細胞分隔出來。例如，天然存在的調節性T細胞(Treg)代表一類有前景的細胞亞群，其能預防基於同種異基因HSCT4 的急性 GvHD 或自身免疫疾病的發展(Riley, J.L.，June, C.H.，&Blazar, B.R.，HumanT regulatory cell therapy: take a billion or so and call me in the morning.1mmunity30(5)，656-665 (2009)，Randolph, D.A.&Fathman，C.G.，Cd4+Cd25+regulatory T cellsand their therapeutic potential.Annu Rev Med57，381-402 (2006))。
[0008]除了由大量細胞共有的CD4的表達，其它的標記物如其組成型表達的高親和性IL-2受體a鏈(⑶25)需要進一步減少異質性。然而，⑶25也表達於很大部分的非調節性細胞上，所述細胞包括最近活化的效應細胞和記憶T細胞。因此，已建議使用組合的染色模式，如CD4、CD25、CD 127和CD45RA的組合(Miyara，M.等，Functionaldelineation and differentiation dynamics of human CD4+T cells expressing theFoxP3transcription factor.1mmunity30(6), 899-911 (2009), Hoffmann, P.等，Onlythe CD45RA+subpopulation of CD4+CD25high T cells gives rise to homogeneousregulatory T-cell lines upon in vitro expansion.Bloodl08(13)，4260-4267(2006))來更精確地鑑定此與臨床相關的T細胞亞群。
[0009]目前所有可用的基於臨床標記物的細胞分離技術採用順磁性珠子，所述珠子將標記的細胞群保留在磁場內。由此，使用直接標記的靶細胞群的積極富集策略得到最高純度。但是，經由幾種不同標記物的組合的純化仍然很難達到，儘管分離具有最高純度的不同細胞群是必需的。另外，陽性篩選後，標記和珠子通常保留在細胞產物中，潛在地操縱分離的細胞群或負面地影響其功能/生活力如通過受體阻滯。特別是在臨床細胞分選中，保留的細胞標記會導致細胞產品在患者中的重大適用性調節障礙。為了規避陽性篩選的問題，許多臨床細胞處理程序已經變為耗竭設置。不幸的是，靶細胞的純度往往很低並且耗竭法常需要不同抗體的複雜混合物， 這就使得其生產和應用費力且價格昂貴。
[0010]因此，仍然需要提供一種用於細胞純化或分離的方法，該方法例如在細胞分選後允許從純化的細胞群中釋放且完全除去受體結合的所有組分和染色劑。
[0011]發明概沭
[0012]本發明一方面提供一種使用可檢測標記使靶細胞可逆染色的方法，所述靶細胞包含在其表面上的受體分子，所述方法包括:
[0013]使包含所述靶細胞的細胞混合物與下述物質接觸:
[0014](i)受體結合試劑，所述受體結合試劑包含至少一個(任意)結合位點B，其中結合位點B特異性結合至所述受體分子，其中所述受體結合試劑經由結合位點B和所述受體分子之間的結合的解離速率常數(Ktjff)的值為約0.5 X IO-W1或更大，所述受體結合試劑進一步包含至少一個結合配偶體C，其中所述結合配偶體C能夠(可逆)連接到多聚化試劑的結合位點Z,
[0015](ii)多聚化試劑，所述多聚化試劑包含用於受體結合試劑的結合配偶體C的可逆結合的至少兩個結合位點Z，其中受體結合試劑(i)和多聚化試劑(ii)形成結合至所述靶細胞的(多個)多價結合複合物，每個多價結合複合物包含結合至一個所述多聚化試劑的至少兩個所述受體結合試劑，所述多價結合複合物相對於所述受體結合試劑提供增加的親合力；和
[0016](iii)結合至所述多價結合複合物的所述可檢測標記，
[0017]其中所述靶細胞通過所述多價結合複合物與所述靶細胞的結合染色，並且基於所述受體結合試劑的所述結合配偶體C與所述多聚化試劑的所述結合位點Z之間的結合的破裂，所述靶細胞的染色是可逆的。
[0018]本發明的第二個方面提供此染色法用於分離由存在(至少一種共同特異性)受體分子定義的靶細胞群的用途。
[0019]本發明另一方面提供用於使用可檢測標記使靶細胞可逆染色(分離)的試劑盒，所述靶細胞包含在其表面的受體分子。此試劑盒包括:
[0020](i)至少一種受體結合試劑，所述至少一種受體結合試劑包含特異性結合至所述受體分子的(任意)結合位點B，其中所述受體結合試劑經由結合位點B和所述受體結合分子之間的結合的解離速率常數(Ktjff)的值為約0.5X IO-W1或更大，並且所述受體結合試劑進一步包含至少一個結合配偶體C，其中所述結合配偶體C能夠被多聚化試劑的結合位點Z (可逆)結合，
[0021](ii)至少一種多聚化試劑，所述至少一種多聚化試劑包含用於受體結合試劑的所述結合配偶體C的至少兩個結合位點Z，其中結合配偶體C與所述多聚化試劑的結合位點Z能夠形成可逆鍵合，
[0022](iii)可檢測標記，所述可檢測標記結合至或能夠結合至受體結合試劑⑴和/或多聚化試劑(ii)。
[0023]本發明的再一方面提供一種特異性結合至受體分子的受體結合試劑在使靶細胞可逆染色的方法中的用途，所述受體結合試劑包含至少一個結合位點B，其中所述結合位點B特異性結合至所述受體分子，其中所述受體結合試劑經由結合位點B和所述受體分子之間的結合的解離速率常數(Ktjff)的值為約0.SXlO-4Sec-1或更大。
[0024]本發明的又一個方面提供一種使用可檢測標記使靶細胞可逆染色的方法，所述靶細胞包含在其表面的(至少一種)受體分子，所述方法包括:
[0025]使包含所述靶細胞的細胞混合物與下述物質的接觸:
[0026](i)至少兩種受體結合試劑，每種受體結合試劑包含至少一個結合位點B，其中每種受體結合試劑的結合位點B特異性結合至所述受體分子，其中每種所述受體結合試劑經由結合位點B和所述受體分子之間的結合的解離速率常數(Ktjff)的值為約0.5X lOAec—1或更大，每種所述受體結合試劑進一步包含至少一個結合配偶體C，其中每種受體結合試劑的結合配偶體C能夠(可逆)結合至多聚化試劑的結合位點Z，
[0027](ii)多聚化試劑，所述多聚化試劑包含用於每種受體結合試劑的結合配偶體C的可逆結合的至少一個結合位點Z,
[0028]其中所述至少兩種受體結合試劑⑴和多聚化試劑(ii)形成結合至所述靶細胞的(多個)多價結合複合物，每個多價結合複合物包含結合至一個所述多聚化試劑的每種受體結合試劑中的至少一個，所述多價結合複合物相對於每種所述受體結合試劑提供增加的親合力；和 [0029](iii)結合至所述多價結合複合物的所述可檢測標記，
[0030]其中所述靶細胞通過所述多價結合複合物與所述靶細胞的結合染色，並且其中基於每種所述受體結合試劑的所述結合配偶體C與所述多聚化試劑的所述結合位點Z之間的結合的分裂，所述靶細胞的染色是可逆的。
[0031]本發明另一方面提供用於使用可檢測標記使靶細胞可逆染色(或分離)的試劑盒，所述靶細胞包含在其表面上的受體分子，所述試劑盒包括:[0032](i)至少兩種受體結合試劑，所述至少兩種受體結合試劑包含特異性結合至所述受體分子的結合位點B，其中每種所述受體結合試劑經由結合位點B和所述受體結合分子之間的結合的解離速率常數(Ktjff)的值為約0.5X Kr4sec-1或更大，並且每種所述受體結合試劑進一步包含至少一個結合配偶體C，其中每種受體結合試劑的結合配偶體C能夠被多聚化試劑的結合位點Z (可逆)結合，
[0033](ii)至少一種多聚化試劑，所述至少一種多聚化試劑包含用於每種受體結合試劑的所述結合配偶體C的的至少一個結合位點Z，其中每種結合試劑的結合配偶體C與所述多聚化試劑的所述結合位點Z能夠形成可逆鍵合，
[0034](iii)可檢測標記，所述可檢測標記結合至或能夠結合至受體結合試劑(i)和/或多聚化試劑(ii)。
[0035]附圖簡沭
[0036]將非限制性實施例與附圖結合考慮並參照發明詳述將會更好的理解本發明，其中:
[0037]圖1示出使用Fab片段作為(至少一個)受體結合試劑(就Fab片段而言且也通常在本發明的一個實施例中，受體結合試劑可含有用於受體分子的單個結合位點)的可逆染色法的原理。圖1a示出Fab片段用作受體結合試劑的說明性示例，其中鏈黴親和素結合肽即
為受體結合試劑的結合配偶體C。在這一實施例中，鏈黴親和素結合肽融合或綴合到Fab片段從而形成受體結合試劑。在圖1a所示實例中，多聚化試劑是鏈黴親和素突變蛋白(「5'//邙-Tacthl?」 )，其包含用於所述至少一個結合配偶體C的至少兩個結合位點Z。在圖1a所不實例中，多聚化試劑帶有滅光標記如操紅蛋白。在圖1b的實例中，再次一起示出了 Fab片段和綴合到作為標記的磁珠上的多聚化試劑。採用鏈黴親和素突變蛋白與Fab片段之間經由鏈黴親和素結合肽的多價結合複合物形成的可逆染色法在本文中也稱作「Fab-多聚體染色」。圖1c示出這種可逆Fab-多聚體染色法的示意圖概況。在這一實例中，從存在於血液樣品中的細胞混合物中染色/分離靶細胞。用於結合至存在於靶細胞上的細胞受體、Ktjff速率為約0.5 X KT4SecT1或更大的Fab片段通過Str印-tag?/5yr<?/?-Tactin?複合物形成可逆多聚化。靶細胞被多價結合複合物(通過如圖1c步驟a)中所示使細胞與多聚化試劑和受體結合試劑接觸)染色並可選地與缺乏同源性細胞表面受體分子的其它細胞分離，例如，利用螢光活化細胞分選術(圖1c步驟b)中標記為商標「FACS?」)。用與
S'mp-tag?.肽競爭的&/r/?-Tactin?i配體D-生物素後續處理分離染色的靶細胞導致Fab片段從多聚化試劑上移位，由此導致多聚化試劑複合物)的從靶細胞中釋放(如圖1c步驟c)所示)。保留的Fab片段，未複合，由於其高Ktjff速率
將在合理的時間窗(自發地)解離，並且可以通過洗滌完全從靶細胞表面移除(如圖1c步驟d)所示)。洗滌可以在這樣一個體積下進行，所述體積在每個洗滌步驟期間將Fab片段稀釋至至少等於Fab片段與同源細胞表面受體分子之間的結合的親和性解離常數(Kd)的濃度。圖1d示出與圖1c類似的染色過程，其中多聚化試劑綴合到磁珠上並且其中染色/分離步驟包括經由其上結合染色細胞的磁柱將染色細胞從未染色細胞中分離。
[0038]圖2示出Fab多聚體可逆染色所需的結合特性。圖2示出用不同抗-⑶4Fab突變體染色的抗-⑶4Fab多聚體的FACS分析，所述不同抗-⑶4Fab突變體對於Fab片段與作為受體分子的CD4的結合具有增加的Ktjff-速率(Fab片段的結合動力學的總結列於表I)。外周血單核細胞(PBMC )用融合至兩個順序排列的5y/rp-tag?,序列(市售商品名為「One-STrEP-tag」;結合配偶體C)的抗_CD4Fab片段(受體結合試劑)染色並用藻紅蛋白標記的 Strep- Tactin? (Strep-Tactin PE ；IBA GmbH, G6ttingen，德國；包含用於結合配偶
體C的至少2個結合位點Z的多聚化試劑)多聚化，然後在用D-生物素處理之前(第二列)或之後(第三列)進行分析。然後在僅用Str印-Tactin PE (未結合Fab片段)(第四列)移除Fab-單體的洗滌步驟後，檢測靶細胞表面上保留的Fab-單體(即用作受體結合試劑的Fab片段)。在上述細胞可逆染色後再次進行Fab多聚體的染色(第五列)，來控制生物素移除的完成，否則該生物素將會妨礙如第四列所示的保留Fab-單體僅用Strep-Tactin PE (未結合Fab片段)的染色，從而導致錯誤的實驗結論。或者，細胞用單體Fab片段培養、洗滌並在用Str印-Tactin PE? (第一，即最左邊的列)染色後進行分析。示出了活的⑶3+T細胞。點圖中的數字表示門內細胞的百分比。
[0039]圖3示出圖2的FACS分析的備選方案，即Fab多聚體染色可逆性的蛋白質印跡分析。CD4Fab多聚體利用列於表1並進一步如圖2具體說明的不同抗_CD4Fab_突變體和5^-c^-Tactin? PE (IBA GmbH, G6ttingen,德國)生成。PBMC 與不同 CD4Fab 多聚體一起
孵育，且每個樣品中的一致的細胞染色用流式細胞儀檢測(與淺色直方圖對比，實線代表未染色細胞)。然後，細胞用D-生物素處理並隨後洗滌。最後，經洗滌的細胞裂解，並用高特異性的抗'抗體(StrepMAB-Classic Horse Radish Peroxidase (HRP)綴合物；
IBA GmbH, Gdttingen，德國)分析溶解(S)和未溶解(I)級分的保留Fab-單體。為了控制
一致量的不溶細胞物質的應用，同時用來自兔的針對P -肌動蛋白的第一抗體(Santa CruzBiotechnology Inc., Santa Cruz, USA)和綴合到HRP的針對兔Ig (免疫球蛋白)的第二抗體(Sigma, St.Louis, USA)來檢測P -肌動蛋白。
[0040]發明詳沭
[0041]本發明提供一種使在細胞表面具有受體分子的靶細胞或靶細胞群可逆染色的方法。對照於描述於美國專利7，776，562或國際專利申請W002/054065的方法，本發明是基於這樣的發現，在該方法中，受體結合試劑與靶細胞表面上的受體分子的低親和性結合併不是可逆性必須的。相反，本發明已經發現不考慮結合強度，意味著無論受體結合試劑和受體分子之間結合的解離常數(Kd)是否具有低親和性，例如在Kd為約10_3到10_7M的範圍內，或是否具有高親和性，例如在Kd為約10_7到IO-kiM的範圍內，靶細胞都能被可逆染色，只要受體結合試劑經由結合位點B與受體分子的結合的解離發生得足夠快。以Ktjff速率(也稱為受體結合試劑(經由結合位點B)與受體分子之間的結合的解離速率常數)表示，Ktjff速率為約0.5X10_4sec_1或更大，約IXKr4SecT1或更大，約SXKr4SecT1或更大，約
`3X KT4SecT1或更大，約4X KT4SecT1或更大，約5X KT4SecT1或更大，約I X KT3SecT1或更大，約 1.5 X KT3SecT1 或更大，約 2 X KT3SecT1 或更大，約 3 X KT3SecT1 或更大，約 4X KT3SecT1 或更大，約SXKr3SecT1或更大，約IXKr2SecT1或更大，或約5X Kr1SecT1或更大。本文關於Koff速率、km速率或Kd時所用術語「約」是指包含±0.1%、±0.2%、±0.3%、±0.4%、±0.5%、±0.7%、±0.9%、土 1.0%、土 1.2%、土 1.4%、土 1.6%、土 1.8%、±2.0%、±2.2%、±2.4%、±2.6%、±2.8%、±3.0%、±3.5%、±4.0.%、±4.5%、±5.0%、±6.0%、±7.0%、±8.0%、±9.0%、± 10.0%、± 15.0% 或 ±20.0% 的誤差容限。
[0042]在本文中，值得注意的是受體結合試劑L與其受體P (例如細胞表面受體分子)之間複合物(C)的形成可以描述為著名的兩狀態過程
[0043]
【權利要求】
1.一種使用可檢測標記使靶細胞可逆染色的方法，所述靶細胞包含在其表面上的受體分子，所述方法包括: 使包含所述靶細胞的細胞混合物與下述接觸: (i)受體結合試劑，所述受體結合試劑包含至少一個結合位點B,其中所述結合位點B特異性結合至所述受體分子，其中所述受體結合試劑經由所述結合位點B和所述受體分子之間的結合的解離速率常數的值為大約0.5X IO-W1或更大，所述受體結合試劑進一步包含至少一個結合配偶體C，其中所述結合配偶體C能夠可逆結合至多聚化試劑的結合位點Z ； (ii)多聚化試劑，所述多聚化試劑包含用於所述受體結合試劑的結合配偶體C的可逆結合的至少兩個結合位點Z， 其中所述受體結合試劑(i)和所述多聚化試劑(ii)形成結合至所述靶細胞的多價結合複合物，每個多價結合複合物包含結合至到一個所述多聚化試劑的至少兩個所述受體結合試劑，所述多價結合複合物相對於所述受體結合試劑提供增加的親合力；和 (iii)所述可檢測標記，所述可檢測標記結合至或能夠結合至所述多價結合複合物， 其中所述靶細胞通過所述多價結合複合物與所述靶細胞的結合染色，並且其中經所述受體結合試劑的所述結合配偶體C與所述多聚化試劑的所述結合位點Z之間的結合的破裂，所述靶細胞的染色是可逆的。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述結合位點Z與所述配偶體C的可逆結合的解離常數(Kd)在10_2M到10_13M的範圍內。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述受體分子結合試劑與所述受體分子之間的結合的解離速率常數(Iw)的值為約IXKr4SecT1或更大，約2X KT4SecT1或更大，約3X KT4SecT1或更大，約4X KT4SecT1或更大，約5X KT4SecT1或更大，約I X KT3SecT1或更大，約 1.5 X KT3SecT1 或更大，約 2 X KT3SecT1 或更大，約 3 X KT3SecT1 或更大，約 4X KT3SecT1 或更大，約5X10_3sec_1或更大，或約IXKr2SecT1或更大。
4.根據權利要求1至3中任一項所述的方法，其特徵在於，所述受體結合試劑與所述受體分子之間的結合的解離常數(Kd)在10_2M到KTkiM的範圍內。
5.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述受體結合試劑與所述受體分子之間的結合的解離常數(Kd)在下述範圍內:約10_3M至約KTkiM,或約10_3M至約10_9M，或約10_3M至約I(T8M,或約KT3M至約I(T7M,或約KT7M至約I(T10M,或約KT7M至約1(T9M。
6.根據權利要求1至5中任一項所述的方法，其進一步包括從存在於所述細胞混合物中的非靶細胞分離所述染色的細胞。
7.根據權利要求1至6中任一項所述的方法，其進一步包括通過破裂所述受體結合試劑的所述結合配偶體C與所述多聚化試劑的所述結合位點Z之間的結合從所述靶細胞中移除所述染色。
8.根據權利要求6至7中任一項所述的方法，其特徵在於，所述多聚化試劑的移除導致所述受體結合試劑從所述染色的細胞的解離。
9.根據權利要求1至8中任一項所述的方法，其特徵在於， (a)所述結合配偶體C包含生物素，所述多聚化試劑包含可逆結合至生物素的鏈黴親和素類似物或抗生物素蛋白類似物；(b)所述結合配偶體C包含可逆結合至鏈黴親和素或抗生物素蛋白的生物素類似物，所述多聚化試劑包含可逆結合至所述生物素類似物的鏈黴親和素、抗生物素蛋白、鏈黴親和素類似物、或抗生物素蛋白類似物，或 (c)所述結合配偶體C包含鏈黴親和素或抗生物素蛋白結合肽，所述多聚化試劑包含可逆結合至所述鏈黴親和素或抗生物素蛋白結合肽的鏈黴親和素、抗生物素蛋白、鏈黴親和素類似物、或抗生物素蛋白類似物。
10.根據權利要求9所述的方法，其特徵在於，所述結合配偶體C包含鏈黴親和素-結合肽Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys,所述多聚化試劑包含鏈黴親和素類似物Val44-Thr45-Ala46-Arg47 或鏈黴親和素類似物 Ile44-Gly45-Ala46-Arg'
11.根據權利要求1至10中任一項所述的方法，其特徵在於，所述結合配偶體C與所述多聚化試劑的所述結合位點Z之間的結合在二價陽離子存在下進行。
12.根據權利要求11所述的方法，其特徵在於，所述結合配偶體C包含鈣調蛋白結合肽，所述多聚化試劑包含鈣調蛋白，或 其特徵在於，所述結合配偶體C包含FLAG肽，所述多聚化試劑包含能結合所述FLAG肽的抗體，或 其特徵在於，所述第一結合C包含寡聚組氨酸標籤，所述多聚化試劑包含結合所述寡聚組氨酸標籤的抗體。
13.根據權利要求11或12所述的方法，其特徵在於，所述結合配偶體C與所述多聚化試劑的所述結合位點Z之間的結合通過金屬離子螯合破裂。
14.根據權利要求13所述的方法，其特徵在於，所述金屬螯合通過添加EDTA或EGTA完成。
15.根據權利要求1至14中任一項所述的方法，其特徵在於，所述多聚化試劑是鏈黴親和素或抗生物素蛋白或者鏈黴親和素或抗生物素蛋白的任意類似物的低聚物或聚合物。
16.根據權利要求15所述的方法，其特徵在於，所述低聚物或聚合物通過多糖交聯。
17.根據權利要求1至16中任一項所述的方法，其特徵在於，所述結合配偶體C包含抗原，所述多聚化試劑包含針對所述抗原的抗體。
18.根據權利要求17所述的方法，其特徵在於，所述抗原是表位標籤。
19.根據權利要求18所述的方法，其中所述表位標籤選自Myc-標籤(序列:EQKLISEEDL )、HA-標籤(序列:YPYDVPDYA)、VSV-G-標籤(序列:YTDIEMNRLGK)、HSV_ 標籤(序列:QPELAPEDPED)、V5-標籤(序列:GKPIPNPLLGLDST)和穀胱甘肽-S-轉移酶。
20.根據權利要求17所述的方法，其特徵在於，所述抗原包含蛋白質。
21.根據權利要求20所述的方法，其特徵在於，所述蛋白質選自麥芽糖結合蛋白(MBP)、幾丁質結合蛋白(CBP)或硫氧還蛋白。
22.根據前述權利要 求中任一項所述的方法，其特徵在於，特異性結合至所述受體分子的所述受體結合試劑選自抗體、二價抗體片段、單價抗體片段、具有抗體樣結合特性的蛋白質性結合分子和MHC分子。
23.根據權利要求22所述的方法，其特徵在於，所述二價抗體片段是(Fab)/-片段或二價單鏈Fv片段。
24.根據權利要求23所述的方法，其特徵在於，所述單價抗體片段選自Fab片段、Fv片段和單鏈Fv片段(scFv)。
25.根據權利要求22所述的方法，其特徵在於，所述具有抗體樣結合特性的蛋白質性結合分子選自適配體、基於脂質運載蛋白家族的多肽的突變蛋白、重組蛋白、基於錨蛋白支架的蛋白、基於結晶支架的蛋白、纖連蛋白、和高親和性多聚體。
26.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其特徵在於，所述接觸在溫度<15°C下進行。
27.根據權利要求26所述的方法，其特徵在於，所述接觸在溫度<4°C下進行。
28.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其特徵在於，所述靶細胞是哺乳動物細胞。
29.根據權利要求28所述的方法，其特徵在於，所述哺乳動物細胞是淋巴細胞或幹細胞。
30.根據權利要求29所述的方法，其特徵在於，所述淋巴細胞是T細胞、T輔助細胞、B細胞或自然殺傷細胞。
31.根據權利要求30所述的方法，其特徵在於，所述T細胞選自CMV-特異性CD8+T淋巴細胞、細胞毒性T細胞、記憶T細胞和調節性T細胞。
32.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其特徵在於，所述可檢測標記是螢光染料或磁性標記。
33.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其特徵在於，靶細胞通過一組至少兩種不同受體分子的方式順序染色和分離，其中採用至少兩種不同受體結合試劑，每種受體結合試劑包含特異性結合至所述至少兩種不同受體分子的組中的預選受體分子的結合位點B。
34.根據權利要求33所述的方法，其特徵在於，結合至所述至少兩種不同受體分子的組的第二或任何其它受體分子的受體結合試劑進一步包含能夠被多聚化試劑的結合位點Z結合的至少一個結合配偶體C。
35.根據權利要求34所述的方法，其特徵在於，所述受體結合試劑經由所述結合位點B與所述第二或任何其它受體分子特異性結合之間的結合的解離速率常數(I^ff)的值為約0.5X 10 4sec 1 或更大。
36.根據權利要求34或35所述的方法，其特徵在於，所述第二或任何其它受體分子與特異性結合所述第二或任何其它受體分子的所述受體結合試劑之間的結合的解離常數(Kd)在10_2至KT7M的範圍內。
37.根據權利要求1至36中任一項所述的方法在由存在至少一種共同特異性受體定義的細胞群的分離中的用途。
38.根據權利要求37所述的用途，其特徵在於，所述由存在共同特異性受體定義的細胞群是淋巴細胞群或幹細胞群。
39.根據權利要求3 8所述的用途，其特徵在於，所述淋巴細胞群是抗原特異性T細胞群、T輔助細胞群、B細胞群或自然殺傷細胞群。
40.根據權利要求39所述的方法，其特徵在於，所述T細胞選自CMV特異性CD8+T淋巴細胞、細胞毒性T細胞、記憶T細胞和調節性T細胞。
41.根據權利要求38所述的用途，其用於所述淋巴細胞群或所述幹細胞群的功能狀態的測定。
42.根據權利要求38所述的用途，其用於淋巴細胞群的純化以用於體外擴增。
43.根據權利要求38所述的用途，其用於幹細胞群的純化，所述幹細胞群用於再生治療。
44.根據權利要求43所述的用途，其特徵在於，所述幹細胞群是CD34+特異性群或Nanog+ 群。
45.根據權利要求38所述的用途，其特徵在於，所述經純化的細胞群為用於調節免疫應答的⑶4+T輔助細胞。
46.根據權利要求38所述的用途，其用於淋巴細胞群的純化，所述淋巴細胞群用於過繼轉移、癌症治療、細菌感染治療、病毒感染治療或免疫療法。
47.根據權利要求46所述的用途，其特徵在於，所述經純化的細胞群是對相關抗原特異性的CD8+T細胞，對白血病相關抗原特異性的CD8+T細胞，對黑色素瘤相關抗原特異性的⑶8+T細胞，對病毒抗原特異性的CD8+T細胞。
48.根據權利要求47所述的用途，其特徵在於，所述對病毒抗原特異性的CD8+T細胞為巨細胞病毒(CMV)磷蛋白65-特異性⑶8+T細胞或EB病毒-EBNA抗原-特異性⑶8+T細胞。
49.根據權利要求46所述的用途，其特徵在於，所述經純化的細胞群是用於自身免疫疾病、I型糖尿病、腸炎、過敏治療的Treg細胞。
50.根據權利要求49所述的用途，其特徵在於，所述自身免疫疾病是移植物抗宿主病(GvHD)或移植物排斥反應。
51.根據權利要求49或50所述的用途，其特徵在於，所述Treg細胞群是CD4+CD25+.CD45RA+Treg 細胞。
52.根據權利要求46所述的用途，其特徵在於，所述經純化的細胞群是CD62L+CD8+特異性中央記憶T細胞。
53.一種用於使用可檢測標記使靶細胞可逆染色的試劑盒，所述靶細胞包含在其表面上的受體分子，所述試劑盒包含: (i)至少一種受體結合試劑，所述至少一種受體結合試劑包含特異性結合至所述受體分子的結合位點B，其中所述受體結合試劑經由所述結合位點B和所述受體結合分子之間的結合的解離速率常數的值為約0.5X IO-W1或更大，並且所述受體結合試劑進一步包含至少一個結合配偶體C，其中所述結合配偶體能夠被多聚化試劑的結合位點Z可逆結合； (ii)至少一種多聚化試劑，所述至少一種多聚化試劑包含用於所述受體結合試劑的所述結合配偶體C的至少兩個結合位點Z，其中所述結合配偶體C與所述多聚化試劑的所述結合位點Z能夠形成可逆鍵合； (iii)可檢測標記，所述可檢測標記結合至或能夠結合至所述受體結合試劑(i)和/或所述多聚化試劑(ii)。
54.根據權利要求53所述的試劑盒，其特徵在於，所述結合配偶體C與所述結合位點Z之間的結合的解離常數(Kd)在10_2至10_13M的範圍內。
55.特異性結合至受體分子的受體結合試劑在根據權利要求1-35中任一項所述的使靶細胞可逆染色的方法中的用途，所述受體結合試劑包含至少一個結合位點B，其中所述結合位點B特異性結合至所述受體分子，其中所述受體結合試劑經由所述結合位點B與所述受體分子之間的結合的解離速率常數(Iw)的值為約0.5X IO-W1或更大。
56.根據權利要求55所述的用途，其特徵在於，所述受體結合試劑選自抗體、二價抗體片段、單價抗體片段、具有抗體樣結合性質的蛋白質性結合分子和MHC分子。
57.根據權利要求56所述的用途，其特徵在於，所述二價抗體片段是(Fab)/-片段、二價單鏈Fv片段或雙特異抗體。
58.根據權利要求57所述的方法，其特徵在於，所述單價抗體片段選自Fab片段、Fv片段、和單鏈Fv片段(scFv)。
59.根據權利要求58所述的方法，其特徵在於，所述具有抗體樣結合性質的蛋白質性結合分子選自適配體、基於脂質運載蛋白家族的多肽的突變蛋白、重組蛋白、基於錨蛋白支架的蛋白、基於結晶支架的蛋白、纖連蛋白、和高親和性多聚體。
60.一種使用可檢測標記使靶細胞可逆染色的方法，所述靶細胞包含在其表面上的受體分子，所述方法包括: 使包含所述靶細胞的細胞物與下述接觸: (i)至少兩種受體結合試劑，每種所述受體結合試劑包含至少一個結合位點B，其中每種受體結合試劑的所述結合位點B特異性結合至所述受體分子，其中每種所述受體結合試劑經由所述結合位點B和所述受體分子之間的結合的解離速率常數(I^ff)的值為約0.5 X IO-W1或更大，每種所 述受體結合試劑進一步包含至少一個結合配偶體C，其中每種受體結合試劑的結合配偶體C能夠可逆結合至多聚化試劑的結合位點Z ； (ii)多聚化試劑，所述多聚化試劑包含用於每種所述受體結合試劑的結合配偶體C的可逆結合的至少一個結合位點Z, 其中所述至少兩種受體結合試劑(i)和所述多聚化試劑(ii)形成結合至所述靶細胞的多價結合複合物，每個多價結合複合物包含結合至一個所述多聚化試劑的每種受體結合試劑中的至少一種，所述多價結合複合物相對於每種所述受體結合試劑提供增強的親合力；和 (iii)所述可檢測標記，所述可檢測標記結合至或能夠結合至所述多價結合複合物， 其中所述靶細胞通過所述多價結合複合物與所述靶細胞的結合染色，並且其中經每種所述受體結合試劑的所述結合配偶體C與所述多聚化試劑的所述結合位點Z之間的結合的破裂，所述靶細胞的染色是可逆的。
61.根據權利要求60所述的方法，其特徵在於，所述結合位點Z與每種受體結合試劑的所述配偶體C之間的結合的解離常數(Kd)在Kr2至IO-3M的範圍內。
62.一種用於使用可檢測標記使靶細胞可逆染色的試劑盒，所述靶細胞包含在其表面上的受體分子，所述試劑盒包含: (i)至少兩種受體結合試劑，所述至少兩種受體結合試劑包含特異性結合至所述受體分子的結合位點B，其中每種所述受體結合試劑經由所述結合位點B和所述受體結合分子之間的結合的解離速率常數的值為約0.5X IO-W1或更大，並且每種所述受體結合試劑進一步包含至少一個結合配偶體C，其中每種所述受體結合試劑的結合配偶體能夠被多聚化試劑的結合位點Z結合， (ii)至少一種多聚化試劑，所述至少一種多聚化試劑包含用於每種所述受體結合試劑的所述結合配偶體C的至少一個結合位點Z，其中每種結合試劑的結合配偶體C與所述多聚化試劑的所述結合位點Z能夠形成可逆鍵合， (iii)可檢測標記，所述可檢測標記結合至或能夠結合至所述受體結合試劑(i)和/或所述多聚化試劑(ii)。
63.根據權利要求62所述的試劑盒，其特徵在於，所述結合位點Z與每種受體結合試劑的所述配偶體C之間的結合的解`離常數(Kd)在Kr2至KT3M的範圍內。
【文檔編號】C07K14/36GK103797028SQ201280045377
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2012年7月17日 優先權日:2011年7月18日
【發明者】託馬斯·施密特, 克裡斯蒂安·施滕貝爾, 迪爾克·H·布施, 洛塔爾·格爾梅羅特 申請人:Iba 股份有限公司