使用siRNA敲減基因表達和改善實體器官和細胞移植的組合物和方法

2023-09-16 17:08:35

專利名稱：使用siRNA敲減基因表達和改善實體器官和細胞移植的組合物和方法
本申請要求美國臨時申請號60/741,157的優先權，其全部公開內容引入這裡作為參考。
發明領域 本發明提供了使用siRNA介導的基因表達下調以預防實體器官或組織移植中的同種異體移植排斥或異種移植排斥和缺血/再灌注損傷的組合物和方法。

背景技術：
實體器官移植是治療末期器官衰竭的唯一有效療法(1，2)。世界各地移植程序已經變得日益成功且這種操作變得愈加常規(3，4)。儘管一年生存率的結果給人深刻印象，但是器官移植仍然面臨嚴重的問題。免疫系統成為所移植器官長期存活的最顯著障礙。如果不用有效的免疫抑制劑終生治療以阻止免疫反應的話，器官移植物將始終被排斥。然而，當前的抗排斥藥物非選擇性地降低全身免疫力和長期增加機會感染和腫瘤發生的風險。因此，正在尋求替換的策略。
過去十年中分子技術的進步使我們對引起免疫反應和缺血/再灌注損傷所需的信號都加深了了解。設計靶向這些新信號的試劑提供了它們會最終允許移植器官長期存在且不接受藥物的希望。
移植免疫學是指同種異體移植物或異種移植物從供體取出，然後移植給受體後所發生的多方面的事件過程。在移植物和移植部位，組織都受損。之後立即發生炎症反應，如同生物化學級聯的激活。當抗原被識別時一系列特異性和非特異性的細胞反應隨之發生。最後，損害通過組織修復和強化被控制；如果損害是非病理性的，則移植物存活。
與抗原無關的組織損傷的原因(即缺血、低體溫、再灌注損傷)是當收穫移植物時血液供應的機械性創傷以及破壞的結果。
相反，抗原依賴性的組織損傷的原因包括免疫介導的損傷。巨噬細胞釋放細胞因子(例如，腫瘤壞死因子、白介素-1)，這通過刺激炎性內皮反應使炎症強度加強；這些內皮改變有助於募集大量T細胞到達移植部位。損傷組織釋放觸發幾個生物化學級聯的促炎介質(例如，Hageman因子[因子XII])。凝血級聯誘發血纖維蛋白和幾種相關的血纖維蛋白肽，它們促進局部血管通透性並吸引嗜中性白細胞和巨噬細胞。激肽級聯主要產生緩激肽，其促進血管舒張、平滑肌收縮和增加血管通透性。
抗體-抗原複合物(即免疫複合物)的形成激活補體系統的傳統途徑。當C1q對接到免疫複合物內的抗體上時，它通過傳統途徑激發激活過程，同時補體因子C3可識別受損細胞表面作為旁路途徑激活的受體。激活的補體通過膜攻擊複合物(例如，C5b、C6、C7、C8、C9)和細胞結合配體例如C4b和C3b(其激活白細胞承載補體受體)的沉積引起損害。此外，生物活性過敏毒素C5a和C3a的產生引起炎性細胞流入和激活。這些趨化物也啟動肥大細胞脫粒，其釋放幾種介質。組胺和5-羥色胺增加血管通透性。前列腺素E2促進血管舒張和血管通透性。白細胞三烯B4和D2促進白細胞蓄積和血管通透性。激活補體的另一種方式是通過組織缺血和再灌注，其使磷脂和線粒體蛋白暴露。這些副產物通過結合C1q或甘露糖結合凝集素或因子C3b而直接激活補體。
目前，成功的同種異體移植需要全身使用免疫抑制藥物。由於毒性和對癌症和感染的易感性增加，這些可引起嚴重的發病。局部產生的免疫抑制分子局限於移植部位會降低對常規、通用的免疫抑制治療的需要，並由此引起較少的副作用。這在疾病，如1型糖尿病中特別突出，這種疾病不立即危及生命，然而胰島同種異體移植可以達到治癒。當聯合使用抗體時，抗CD4策略可能越發有效；相似的策略也可以預防異種移植排斥。抑制宿主的免疫反應也會增加癌症的風險。抑制免疫反應以避免移植排斥和移植物抗宿主疾病(GVHD)的嘗試使身體與傳染性物質(例如細菌、病毒、真菌等等)鬥爭的能力削弱。
RNA幹擾(RNAi)化合物，中間體短幹擾RNA寡核苷酸(siRNA)提供了獨特的策略，在同一治療中聯合使用多個siRNA雙鏈體以靶向多個引起疾病的基因，因為所有siRNA雙鏈體在化學上是同質的，具有相同來源和相同製造方法(5，6，7，8)。預計這種siRNA抑制劑具有好得多的臨床功效，毒性和安全憂慮最小。遺傳修飾對於器官移植是有前景的治療策略。基於吸引人的沉默特定基因表達的RNA幹擾技術(9，10)，siRNA療法可以代表預防缺血/再灌注損傷以及移植受體中的器官排斥的吸引人和有效的方法。
發明概述 本發明提供了尋靶多核苷酸，其靶向待捐獻給受體的器官細胞中存在的免疫調節或免疫效應基因。這些多核苷酸的靶可以來源於表1-15(參見下文)中列出的免疫調節和免疫效應基因的序列。例如，尋靶多核苷酸可以靶向C3、ICAM1、VCAM-1、IFN-γ、IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α、CD80、CD86、MHC-II、MHC-I、CD28、CTLA-4或PV-B19基因中的序列。尋靶多核苷酸可以包含靶向表1-15中所列一個或多個序列的siRNA雙鏈體。尋靶多核苷酸可以是單鏈線性多核苷酸、雙鏈線性多核苷酸或髮夾多核苷酸。
本發明還提供了通過在將器官移植入受體前，使器官與包含本發明的尋靶多核苷酸的組合物接觸來抑制移植器官排斥的方法。該方法可有效下調或抑制在移植前貯藏期間器官或器官的細胞中免疫調節或免疫效應靶基因的表達。在一個實施方案中，用包含本發明的尋靶多核苷酸的組合物灌注該器官。在另一個實施方案中，將該器官浸泡或浸沒在包含本發明的尋靶多核苷酸的組合物中。還可以將該組合物給予器官受體。在本發明的一些實施方案中，該器官可以是受體自己的器官。所述器官的受體可以是人。與包含本發明的尋靶多核苷酸的組合物接觸的器官、組織和細胞包括腎、肝、肺、胰、心臟、小腸、角膜、上皮細胞、血管內皮、血管平滑肌細胞、心肌和移植時器官中居留的過客白細胞。
包含本發明的尋靶多核苷酸的組合物還可以包含載體，包括但不限於灌注流體、高滲枸櫞酸鹽溶液、PolyTran聚合物溶液、TargeTran納米顆粒溶液或威斯康星大學溶液(University of Wisconsinsolution)。該組合物還可以包含小分子藥物、單克隆抗體藥物，及其他免疫調節劑。在一些實施方案中，該組合物包含多個本發明的尋靶多核苷酸。組合物可以含有許多可靶向多個基因序列的本發明的尋靶多核苷酸。在一個實施方案中，該尋靶多核苷酸是靶向C3、TNF-α和IL-8基因序列的混合物。
附圖簡述

圖1是顯示大鼠腎細胞中C3 mRNA相對表達的柱狀圖。用IL-1和IL-6刺激細胞以增加C3表達。三個候選C3 siRNA序列(C3-1、C3-2、C3-3)或FITC標記的混雜siRNA以各種濃度轉染到細胞中。用Lipofectamine和無siRNA(+lipofectamine)處理一組細胞，而刺激另一組細胞產生C3，既不用Lipofectamine也不用siRNA(-lipofectamine)處理。轉染後48小時，通過實時PCR測定細胞中C3 mRNA水平。虛線表示未受刺激的細胞的C3表達。該實驗表明通過siRNA敲減基因的可行性和功效。C3-3 siRNA被選為候選者用於進一步實驗。
圖2是顯示用IL-1和IL-6刺激以增加C3表達的大鼠腎細胞中C3 mRNA相對表達的柱狀圖。這些細胞也用各種濃度的C3-3候選序列進行轉染。實時PCR測定刺激48小時後的C3 mRNA表達表明這個siRNA序列導致C3表達與未用siRNA處理的受刺激細胞相比降低。使測定標準化為細胞中未受刺激的C3 mRNA表達(虛線)。
圖3是顯示移植的大鼠腎臟中C3 mRNA的相對表達水平的柱狀圖。該腎臟在移植前，不用或用含有各種量的混雜或C3特異性siRNA的納米顆粒來處理。每個數據點含有來自4個獨立的腎臟的數據，且每個PCR反應一式三份進行。將這些實驗條件下的C3 mRNA水平與正常非移植腎(NKC，正常腎對照)和未用siRNA處理的移植腎(ISCH，缺血對照)的C3 mRNA水平相比較。該圖證明移植前用C3特異性siRNA處理的腎臟中的C3 mRNA水平與正常非移植腎和未用C3特異性siRNA處理的移植腎中的C3 mRNA水平相比較低。用各種比例的PolyTran包裹C3特異性siRNA，在圖1中標記如下C310μg C3 siRNA在PolyTran中以1:4.5；裸C310μg C3 siRNA無PolyTran；C3 3:1:10μg C3 siRNA在PolyTran中以13；C3 1.5:1:10μg C3 siRNA在PolyTran中以1:1.5。為了檢驗siRNA特異性的要求，在移植前，用混雜siRNA處理了兩組腎FITC10μg混雜FITC標記的siRNA；SCRAM CON10μg混雜未標記的siRNA。
圖4是一組顯示移植的大鼠腎的組織學分析的兩個圖。上圖顯示了移植後48小時未處理的腎。組織病理學揭示表示急性腎小管壞死(ATN)的普遍的腎小管衰減和腎小管擴張。這個特殊的病理與移植後移植組織最初無功能相關。下圖描繪了移植後48小時，用C3 siRNA(與PolyTran以1:4.5的比例)預處理的腎。這個腎的組織病理學顯示較少的ATN。
圖5顯示了呈現實驗結果的兩個柱狀圖，該實驗用來鑑定可用於將含siRNA的納米顆粒靶向特定器官的短肽。使用噬菌體展示來鑑定集中於移植腎的候選肽。圖5的上圖顯示了一個實驗的例證性數據，三輪噬菌體文庫注射、回收和擴充後，從腎回收的噬菌體濃度(以每克組織的噬菌斑形成單位計)不斷增加。在對照實驗中，用鏈黴抗生物素蛋白作為噬菌體結合的靶(R3vsStrep)。圖5的下圖顯示了第三輪生物淘選後，受體的移植腎(Tx腎)、正常腎(N腎)、胰、心臟和肺中回收的噬菌體數量。該數據顯示了與從其他器官回收到的噬菌體數量相比的噬菌體駐入移植腎的選擇性。
發明詳述 如本文使用的「寡核苷酸」和基於此的類似術語是指由天然存在的核苷酸組成的短聚合物，以及由合成或修飾的核苷酸組成的聚合物，如前段剛剛描述過。寡核苷酸長度可以是10個或更多個核苷酸，或長度是15、或16、或17、或18、或19、或20個或更多個核苷酸，或長度是21、或22、或23、或24個或更多個核苷酸，或長度是25、或26、或27、或28、或29、或30個或更多個核苷酸，或長度是35個或更多個、40個或更多個、45個或更多個，直至大約50個核苷酸。siRNA寡核苷酸可以具有15至30個核苷酸之間任意數量的核苷酸。在許多實施方案中，siRNA可以具有21至25個核苷酸之間任意數量的核苷酸。
在許多實施方案中，siRNA可以具有兩個平末端、或兩個粘末端、或一個平末端和一個粘末端，或一個末端具有突出端。突出核苷酸的範圍可以是一至四個或更多。
RNA幹擾(RNAi) 根據本發明，免疫調節或免疫效應基因靶的基因表達被RNA幹擾減弱。免疫調節或免疫效應基因的表達產物通過特異性雙鏈siRNA核苷酸序列被靶向，該核苷酸序列與免疫調節或免疫效應基因靶序列的至少一個片段互補，該片段含有15至30個之間任意數量的核苷酸，或在多個情況下，其含有21至25個核苷酸之間任意數量的核苷酸，或更多個。這個靶可以存在於5′非翻譯(UT)區、編碼序列中、或3′UT區。參見例如PCT申請WO00/44895、WO99/32619、WO01/75164、WO01/92513、WO01/29058、WO01/89304、WO02/16620和WO02/29858，每篇文獻的全部內容引入這裡作為參考。
根據本發明的方法，使用siRNA抑制了免疫調節或免疫效應基因表達，和因此抑制由於不利的免疫反應造成的缺血/再灌注損傷或器官移植排斥。根據本發明的尋靶多核苷酸包括siRNA寡核苷酸。這種siRNA還可以通過化學合成與預定序列相同或相似的核苷酸序列來製備。參見例如Tuschl，Zamore，Lehmann，Bartel和Sharp(1999)，Genes & Dev.133191-3197，其全部內容引入這裡作為參考。可供選擇地，尋靶siRNA可以使用靶向多核苷酸序列而獲得，例如通過在無細胞體系，例如但不限於果蠅提取物中消化免疫調節或免疫效應核糖多核苷酸序列，或通過重組雙鏈cRNA轉錄。
對於由相同長度的16-30nt正義鏈和16-30nt反義鏈組成的siRNA雙鏈體，通常觀察到有效的沉默。在多個實施方案中，siRNA成對雙鏈體的每條鏈在3′末端具有另外2nt突出端。2nt 3′突出端的序列為siRNA靶識別特異性做出另外的微薄貢獻。在一個實施方案中，3′突出端的核苷酸是核糖核苷酸。在可供選擇的實施方案中，3′突出端的核苷酸是脫氧核糖核苷酸。3′脫氧核苷酸的使用使胞內穩定性增加。
本發明的重組表達載體當導入細胞內時，被加工以提供包含靶向器官內免疫調節或免疫效應基因的siRNA序列的RNA。這種載體可以是克隆入表達載體的DNA分子，包含以允許表達的方式側接免疫調節或免疫效應基因尋靶序列的可操作連接的調節序列。在這個載體中，與靶RNA反義的RNA分子由第一啟動子(例如克隆DNA3′的啟動子序列)轉錄，和對於RNA靶是正義鏈的RNA分子由第二啟動子(例如克隆DNA5′啟動子序列)轉錄。然後正義和反義鏈在體內雜交產生靶向免疫調節或免疫效應基因序列的siRNA構建體。可供選擇地，可以利用兩個構建體產生siRNA構建體的正義和反義鏈。此外，克隆的DNA可以編碼具有二級結構的轉錄物，其中單個轉錄物兼備來自靶基因或基因的正義和互補反義序列。在這個實施方案的一個實施例中，髮夾RNAi產物與全部或部分靶基因相似。在另一實施例中，髮夾RNAi產物是siRNA。側接免疫調節或免疫效應基因序列的調節序列可以相同或可以不同，以致可以單獨，或以時間或空間方式調節它們的表達。
在某些實施方案中，siRNA通過將免疫調節或免疫效應基因序列克隆入載體而被胞內轉錄，該載體含有例如來自較小核RNA(snRNA)U6或人RNA酶PRNAH1的RNA pol III轉錄單位。載體系統的一個實例是GeneSuppressorTM RNA幹擾試劑盒(Imgenex Corp.)。U6和H1啟動子是III型Pol III啟動子的成員。U6樣啟動子的+1核苷酸總是鳥嘌呤核苷，而對於H1啟動子的+1是腺嘌呤核苷。這些啟動子的終止信號定義為五個連續的胸腺嘧啶核苷。轉錄物典型地在第二個尿嘧啶核苷後切開。在這個位置切開導致所表達siRNA中產生3′UU突出端，其類似於合成的siRNA的3′突出端。長度小於400個核苷酸的任何序列可以被這些啟動子轉錄，因此它們是理想的適於表達例如大約50個核苷酸的RNA莖環轉錄物中大約21個核苷酸的siRNA。已經研究了RNAi的特性和影響siRNA功效的因素(參見例如Elbashir，Lendeckel和Tuschl(2001).Genes & Dev.15188-200)。
尋靶多核苷酸長度通常是300個核苷酸或更少，並包括第一核苷酸序列，該序列靶向存在於捐獻器官的細胞中或捐獻器官一旦從供體取出而伴隨的過客細胞中的基因序列，和當捐獻器官引入受體受試者體內時，第一核苷酸序列引發免疫調節或免疫效應反應。在多核苷酸中，任何T(胸腺嘧啶核苷)或任何U(尿嘧啶核苷)可以任選被另一個取代。另外，在多核苷酸中，第一核苷酸序列由a)長度是15至30個的任意數量或更多個的核苷酸的序列，或b)a)給定序列的互補物組成。這種多核苷酸本文術語可以稱作線性多核苷酸。單鏈多核苷酸常常是雙鏈siRNA中的一條鏈。
在相關方面，如上所述的多核苷酸進一步包括通過環序列與第一核苷酸序列隔開的第二核苷酸序列，以致第二核苷酸序列 a)具有基本上與第一核苷酸序列相同的長度，和 b)基本上與第一核苷酸序列互補。
在這個後一結構中，術語稱為髮夾多核苷酸，第一核苷酸序列與第二核苷酸序列雜交形成髮夾，該髮夾的互補序列通過環序列連接。髮夾多核苷酸被胞內消化形成雙鏈siRNA。
在多個實施方案中，線性多核苷酸和髮夾多核苷酸的靶是存在於捐獻器官的細胞中，或捐獻器官伴隨的過客細胞中的基因序列，和第一核苷酸序列是 a)靶向選自所附表1-15給出序列的序列的尋靶序列； b)比a)中給出序列更長的尋靶序列，其中尋靶序列靶向選自表1-15的序列； c)a)或b)中給出序列的片段，其中該片段由長度至少15個核苷酸的相鄰鹼基序列組成，且最多比所選序列短一個鹼基； d)尋靶序列，其中直至5個核苷酸不同於a)-c)中給出的序列，或 e)a)至d)中給出的任何序列的互補物。
在線性多核苷酸或髮夾多核苷酸的各種實施方案中，第一核苷酸序列的長度是21至25個任意數量的核苷酸。
在多個實施方案中，線性多核苷酸或髮夾多核苷酸由尋靶序列組成，該尋靶序列靶向選自表1-15的序列，並任選包括與所選序列3′結合的二核苷酸突出端。在線性多核苷酸或髮夾多核苷酸的又一另外的實施方案中，第一核苷酸序列3′末端的二核苷酸序列是TT、TU、UT或UU，和包括核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或二者。在各種更多實施方案中，線性或髮夾多核苷酸可以是DNA，或可以是RNA，或可以由脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸組成。
對特別是人基因特異性的siRNA寡核苷酸的示例序列列於下面表1a至15b。對於所列基因，該表包括21聚體，具有突出端，和25聚體，具有平末端。對移植供體是其他哺乳動物的基因特異性的潛在siRNA寡核苷酸序列應該參照相應的人基因來設計，但是應著眼於那些動物的基因序列。
表1 C3基因中siRNA靶向的序列 C3基因人補體成分3(C3)，登錄號NM_000064，基因ID4557384，選擇25個siRNA候選物靶向下列基因序列 表1a.23聚體序列 表1b.25聚體siRNA正義鏈序列 表2 ICAM1基因中siRNA靶向的序列 ICAM1基因人細胞間粘附分子1(CD54)、人鼻病毒受體(ICAM1)，登錄號NM_000201，基因ID4557877，選擇19個siRNA靶向下列基因序列 表2a.23聚體DNA正義鏈序列 表2b.25聚體siRNA正義鏈序列 表3 VCAM1基因中siRNA靶向的序列 VCAM1基因人血管細胞粘附分子1(VCAM1)，轉錄變體2，mRNA。
登錄號NM_080682.GI18201908；轉錄變體1，mRNA。
登錄號NM_001078，GI18201907；人血管細胞粘附分子1mRNA，完整cds gi|1179885|gb|M30257.1|HUMCAM1V[179885]，人血管細胞粘附分子1mRNA，完整cds， gi|340193|gb|M60335.1|HUMVCAM1[340193]，人血管細胞粘附分子-1(VCAM1)基因，完整cds， gi|340195|gb|M73255.1| HUMVCAM1A[340195]，人血管細胞粘附分子1(VCAM-1)的人mRNA， gi|37648|emb|X53051.1|HSVCAM1[37648] 選擇25個siRNA候選物靶向下列基因序列 表3a.23聚體DNA正義鏈序列 表3b.25聚體siRNA正義鏈序列 表4 靶向人IFN-γ(登錄號NM_000619)的siRNA序列 表4a.19聚體siRNA 表4b.25聚體siRNA正義鏈序列 表5 靶向人IL-1(登錄號NM_033292)的siRNA序列 表5a.19聚體siRNA正義鏈序列 表5b.25聚體siRNA正義鏈序列 表6 靶向人IL-6(登錄號NM_000600)的siRNA序列 表6a.19聚體siRNA正義鏈序列 表6b.25聚體siRNA正義鏈序列 表7 靶向IL-8(登錄號NM_000584)的siRNA序列 表7a.19聚體siRNA正義鏈序列 表7a.25聚體siRNA正義鏈序列 表8 靶向TNF-α(登錄號NM_004862)的siRNA序列 表8a.19聚體siRNA正義鏈序列 表8b.25聚體siRNA正義鏈序列 表9 靶向人CD80(登錄號NM_005191)的siRNA序列 表9a.19聚體siRNA正義鏈序列 表9b.25聚體siRNA正義鏈序列 表10 靶向人CD86(登錄號NM_175862)的siRNA序列 表10a.19聚體siRNA正義鏈序列 表10b.25聚體siRNA正義鏈序列 表11 靶向人MHC-II(登錄號NM_002119)的siRNA序列 表11a.19聚體siRNA正義鏈序列 表11b.25聚體siRNA正義鏈序列 表12 靶向人MHC-I(登錄號NM_005516)的siRNA序列 表12a.19聚體siRNA正義鏈序列 表12b.25聚體siRNA正義鏈序列 表13 靶向人CD28(登錄號NM_006139)的siRNA序列 表13a.19聚體siRNA正義鏈序列 表13b.25聚體siRNA正義鏈序列 表14 靶向人CTLA4(登錄號AF414120)的siRNA序列 表14a.19聚體siRNA正義鏈序列 表14b.25聚體siRNA正義鏈序列 表15 靶向人細小病毒B19(登錄號AY903437)的siRNA序列 表15a.19聚體siRNA正義鏈序列 表15b.25聚體siRNA正義鏈序列 在一個實施方案中，25個鹼基對，具有平末端的siRNA雙鏈體在體外和體內都顯示出比19個鹼基對，在兩個3′末端都具有突出端更有效的基因敲減功效。
在本發明的另外的方面提供了雙鏈多核苷酸，其包括如上所述的第一線性多核苷酸鏈，和與第一鏈的至少第一核苷酸序列互補並與其雜交形成雙鏈siRNA組合物的第二多核苷酸鏈。
製劑 使用各種載體來製備含有siRNA的製劑或藥物組合物。在幾個實施方案中，本發明的siRNA多核苷酸通過脂質體介導的轉染被遞送至培養的細胞或等待移植的器官的細胞中，例如通過使用市場上可買到的試劑或技術，例如OligofectamineTM、LipofectAmineTM試劑、LipofectAmine 2000TM(Invitrogen)，以及通過電穿孔，和相似技術。
含有siRNA的藥物組合物包括保護siRNA穩定性、延長siRNA壽命、增強siRNA功能或使siRNA靶向特定組織/細胞的附加組分。這些包括各種可生物降解的聚合物、陽離子聚合物(例如聚乙烯亞胺)、陽離子共聚物例如組氨酸-賴氨酸(HK)多肽，參見例如PCT出版物Mixson等的WO01/47496、 Bio聚體ieux的WO 02/096941和麻省理工學院的WO 99/42091、聚乙二醇化的陽離子多肽和配體摻入聚合物等帶正電荷的多肽、PolyTran溶液(HK聚合物和多糖的鹽水或水溶液，多糖例如天然多糖，又名硬葡聚糖)、TargeTran(由包括靶向配體的綴合RGD-PEG-PEI聚合物組成的納米顆粒的鹽水或水懸液)、表面活性劑(Infasurf；Forest Laboratories，Inc.；ONY Inc.)，和陽離子聚合物(例如聚乙烯亞胺)。

(calfactant)是分離自小牛肺的用於氣管內灌注的天然肺表面活性劑；它含有磷脂、天然脂類和疏水表面活性劑締合的蛋白B和C。
這些聚合物可以是單維或多維的，也可以是直徑小於20微米、20至100微米、或100微米以上的微粒或納米顆粒。所述聚合物可以攜帶對於特定組織或細胞的受體或分子特異性的配體分子，因此用於siRNA的定向遞送。siRNA多核苷酸也可以通過基於陽離子脂質體的載體，例如DOTAP、DOTAP/Cholesterol(Qbiogene，Inc.)和其他類型的脂質水溶液來遞送。此外，低百分比(5-10％)葡萄糖水溶液，和Infasurf是空運遞送siRNA的有效載體(Li B.J.et al，2005，Nature Medicine，11，944-951)。
此外，載體可以包括高滲枸櫞酸鹽溶液(560mOsm/kg氫氯化葡甲胺，560mOsm/kg碘克酸葡甲胺和600mOsm/kg碘克酸鈉等等)。威斯康星大學溶液具有增加和延長心臟、腎、肺和肝保藏的潛能。威斯康星大學溶液廣泛用於冷藏和運輸指定為胰島分離物的人供體胰。
該組合物可以進一步包含聚合載體。該聚合載體可以包括與RNA分子結合的陽離子聚合物。該陽離子聚合物可以是胺基酸共聚物，包括例如組氨酸和賴氨酸殘基。該聚合物可以包括分支聚合物。
該組合物可以包含尋靶合成載體。該合成載體可以包括陽離子聚合物、親水聚合物和靶向配體。該聚合物可以包括聚乙烯亞胺，親水聚合物可以包括聚乙二醇或聚縮醛，和靶向配體可以包括包含RGD序列的肽。
siRNA/載體可以以非特異性方式配製為貯藏溶液或灌注介質，或配製為經體循環的靶向遞送系統。
改善實體器官和細胞的移植 本發明提供了預防實體器官移植中的同種異體移植排斥和缺血/再灌注損傷的方法，是通過導入RNA幹擾(siRNA)來沉默或下調靶基因表達。在本發明的方法中，siRNA以器官貯藏溶液的形式用於意欲移植的器官，即從供體取出後和當正在運輸給受體時。移植器官、組織和/或細胞的供體或受體可以是哺乳動物，包括但不限於人、非人哺乳動物、非人靈長類動物、大鼠、小鼠、豬、狗、牛和馬。指定用於移植的器官由包含siRNA寡核苷酸或多個siRNA寡核苷酸作為混合物的器官貯藏溶液維持。siRNA可以容易地和選擇性到達供體器官和細胞，這促進潛在有害的全身副作用的降低。
在目前的實踐中，供體器官經受衝洗並貯藏在靜態或再循環系統，處於低體溫條件(對於人，低於37℃，例如4℃)或正常熱力條件下(對於人是37℃)，處於特別配製的溶液(器官保藏溶液)中，為了洗去雜質和降低運輸過程中的損害。本發明的方法包括器官保藏過程中供體器官和細胞的siRNA轉染。這是一種有吸引力的方法，因為siRNA離體施加給待捐獻的器官不會全身給予器官受體，且治療可以專門遞送至炎症部位。這種方法可用於預防移植失敗，而無全身副作用。
siRNA轉染製劑用於在原位和/或離體，或靜態或機械灌注器官貯藏器中衝洗實體供體器官。配製的溶液具有局部注射給實體器官和通過將其浸沒在siRNA製劑中而浸泡整個實體器官的用途。
siRNA試劑可以作為單個或多個雙鏈體使用，靶向單個或多個基因，轉染或不轉染載體來處理移植器官(組織)和細胞。轉染試劑包括但不限於合成聚合物、脂質體和糖等等。siRNA試劑還可以和其他試劑一起使用，例如小分子和單克隆抗體抑制劑、免疫調節劑和其他類型寡核苷酸。用siRNA/載體溶液注射和浸沒用於移植的器官會將組織損傷和宿主排斥降至最低，和因此將增加移植器官在器官功能和存活率和使伴隨發病率最小化方面的成功。
也在本發明中，在移植過程中可以用siRNA/載體製劑處理各種器官和細胞。所有實體器官移植基本上都需要手術製備供體，可以包括身體或待用於移植的具體器官的衝洗灌注。灌注可以用一種或多種流體。取出器官，在運輸給受體過程中貯藏，和器官手術移植給受體。對本發明方法有用的器官包括但不限於腎、肝、心臟、胰、胰島、小腸、肺、角膜、肢體和皮膚，以及這些器官中每一種器官相應的培養細胞。一個實例，肝細胞系開始發展為分離的肝細胞移植的萬能供體，這是比用於治療代謝性肝疾病的常位肝移植創傷小的方法。經由途徑例如CD28/B7或CD40/CD40L共同刺激是這種移植成功的主要憂慮(2)。因此，使用siRNA/載體製劑沉默CD28或CD40途徑將是改善移植成功率的優良策略。
另一個腎移植失敗的實例是實體器官移植後細小病毒B19(PV-B19)的感染，其可以引起純紅細胞再生障礙性貧血(PRCA)。免疫抑制的移植受體的PV-B19感染合併嚴重的發病(1)。使用siRNA抑制PV-B19或任何其他病毒感染和複製是通過在移植初期期間處理供體器官和移植受體，從而改善腎移植的輔助療法。
在另一個方面，本發明提供了包含一個或多個siRNA雙鏈體的組合物，其中siRNA可以同時靶向涉及異體移植物或異種移植排斥或缺血/再灌注損傷的幾個基因。多個siRNA雙鏈組合可以更有效用於移植同種異體移植排斥或缺血/再灌注損傷。
免疫調節過程提供了使用本發明方法進行siRNA沉默的過多分子靶，例如(1)與激活相關的淋巴細胞上的分子；(2)刺激淋巴細胞的抗原呈遞細胞(APCs)上的分子，例如II型MHC和共刺激分子；(3)可溶分子信號，例如細胞因子，例如TNF-α、IFN-β、IL-1、IL-6、IL-8；(4)與淋巴細胞滲出和回復原位相關的分子，例如血管細胞粘附分子-1、細胞間粘附分子-1；和(5)免疫效應分子，例如但不限於補體因子C3。另外候選靶基因包括細胞間粘附分子-1、I型主要組織相容性複合體、II型主要組織相容性複合體、IFN-γ、CD80、CD86、CD40和CD40L。
本發明還提供了方法和組合物，其使用siRNA寡核苷酸混合物(siRNA-OC)作為本發明方法中有用的治療劑或達到更強的抗血管生成功效，用於治療癌症和炎症。siRNA寡核苷酸混合物包含靶向至少三個mRNA靶的至少三個雙鏈體。siRNA寡核苷酸混合物可以包含表1-15所列的任何siRNA序列。在一個實施方案中，siRNA寡核苷酸混合物包含補體C3、MHC-II和IFNγ特異性的siRNA。本發明基於兩個重要方面第一，siRNA雙鏈體是很強效的基因表達抑制劑，和每一個siRNA分子由具有相同化學性能的短的雙鏈RNA寡核苷酸組成(21-23nt，或24-25nt，或26-29nt)；第二，異體移植物或異種移植排斥和缺血/再灌注損傷部分地與內源基因過表達相關。因此，使用靶向多個基因的siRNA-OC代表了有利的治療方法，這是由於siRNA雙鏈體的化學均一性和下調引起多種疾病或損傷的基因的協同效應。本發明定義siRNA-OC是靶向至少三個基因的siRNA雙鏈體的組合，這些雙鏈體以各種比例，各種物理形式，並同時通過相同途徑，或不同途徑和時間施加給病變組織。
siRNA介導的沉默可以與靶向一個這種基因的單個siRNA，或靶向同一基因內幾個靶序列，或靶向不同類型的各種基因的多個siRNA的組合(例如本段確定的)一起應用。例如，包含多個siRNA雙鏈體的組合物可以以相同或不同比例存在。因此，在三個siRNA的混合物中，雙鏈體I、雙鏈體II和雙鏈體III每個可以以每個總siRNA試劑的33.3％(w/w)存在，或作為非限制性實例，分別以20％、45％和35％存在。
除非另外定義，本文使用的所有技術和科學術語與本發明所屬領域普通技術人員通常理解的含義相同。示例的方法和材料描述如下，儘管與本文描述的類似或等同的方法和材料可以用在本發明的實踐或測試中。本文提及的所有出版物及其他參考文獻的全部內容引入作為參考。在衝突的情況下，本說明書，包括定義將操縱。儘管本文引用了多個文件，這個引證不構成任何這些文件形成本領域公知常識的一部分的認同。貫穿本說明書和權利要求書，單詞「包含」將被理解為暗示內含所述整數或整數組，但不排除任何其他整數或整數組。材料、方法和實施例僅是示例性的，不意欲限制。
實施例1siRNA介導的C3體外表達敲減 RNA幹擾阻斷依照它們的序列的小獨特區段的基因表達。可以利用這個自然過程減少特異性基因的轉錄。在移植中，經確認來自供體的補體C3迅速上調缺血/再灌注損傷(I/RI)，有助於組織損傷。補體C3被稱作各種形式損傷和免疫調節的局部介質，和是移植缺血/再灌注損傷後基因敲減的有效靶，該靶很可能也參與異體免疫調節。本研究設法開發siRNA下調供體器官中的C3基因表達。
用10μg/ml IL-1和0.1μg/ml IL-6刺激大鼠腎上皮細胞系以上調C3基因表達。刺激後72小時，用一板C3特異性siRNA之一轉染細胞。
48小時後，實時PCR測定C3表達。結果表明刺激後，未轉染細胞中C3表達上調(圖1)。siRNA處理的細胞與未用siRNA處理的對照細胞相比顯示C3表達降低達到60％。這些實驗從不特異性誘導IFNγ上調(siRNA的潛在非靶效應)的板中鑑定到最有效的C3 siRNA序列(在圖1中標記為C3-3 siRNA)。
上述實驗獲得的候選C3 siRNA轉染刺激的大鼠腎上皮細胞以表達C3，如上所述。這個C3特異性siRNA的濃度範圍產生顯著的(P<0.05)C3 mRNA敲減，如實時PCR測定(圖2)。這個實驗證明鑑定的C3 siRNA序列用於體內測試的技術可行性和功效。
實施例2siRNA介導的C3體內表達敲減 然後如上述實驗測定的最有效C3 siRNA包裝入促進體內siRNA轉染的合成聚陽離子納米顆粒。納米顆粒由PolyTran、分支組氨酸(H)和賴氨酸(K)聚合物家族組成，可有效體外、體內和離體傳遞siRNA。它們的核心序列如下R-KR-KR-KR，其中R＝[HHHKHHHKHHHKHHH]2KH4NH4。對於體內實驗，初步測試下列分支HK聚合物將遞送入siRNA異體移植物細胞的功效H3K4b。這個分支聚合物具有如上所述的相同核心和結構，除了R分支不同R＝KHHHKHHHKHHHKHHHK。選擇這些聚合物是因為它們對於不同形式核酸的體外或體內功效。分支HK聚合物溶於水溶液，然後以所列質量比與siRNA水溶液混合，形成直徑平均粒度150-200nm的納米顆粒。HKP-siRNA水溶液是半透明的，無引人注目的沉澱聚集體。這些溶液可以在4℃保存至少三個月。
向高滲枸櫞酸鹽灌注液體中添加納米顆粒並給予供體大鼠腎。冷缺血4小時後，腎移植入同種同基因的宿主。兩天後，收穫腎並用實時PCR測定C3基因表達。非移植、未處理腎充當陰性對照(在圖3中標記為NKC)，而未用siRNA處理的灌注移植腎充當陽性對照(在圖3中標記未ISCH)。以移植的未處理腎的mRNA水平對siRNA處理的腎的水平進行標準化。圖3顯示了結果。
結果證明C3-siRNA使移植後C3基因表達與未處理移植物相比降低62.56％(P<0.05，n＝4)，降至低於正常腎中檢測到的水平。當與混雜FITC標記的siRNA對照相比，C3基因表達減少73.34％(P<0.05，n＝4)。FITC標記的混雜siRNA對照比未處理腎顯示出更強的C3基因表達下調，暗示非靶效應。組織學顯示移植前用C3siRNA處理的腎免於缺血/再灌注損傷(I/RI)(圖4)，但是用FITC標記的混雜siRNA灌注的細胞和組織的直接螢光顯微術顯示組織中不含任何可檢測到的siRNA。
總之，與對照相比，siRNA抑制C3基因表達有效地降低了局部C3活性。納米顆粒策略看起來克服了有效siRNA遞送的問題。現在看來可能開發系列特異性siRNA以降低供體器官中的促炎基因表達，作為常規免疫抑制或誘發耐受的輔助治療。
實施例3通過噬菌體展示確定集中於移植腎的肽序列 為了提供含siRNA的納米顆粒的器官靶向特異性，可以通過噬菌體展示鑑定集中於感興趣器官的肽。使用這個方法鑑定如上所述的腎移植大鼠模型的候選靶向肽。用高滲枸櫞酸鹽衝洗供體腎並在移植入同種同基因宿主前於4℃儲存4小時。48小時後，麻醉受體並經尾靜脈注射製備的半胱氨酸限制的7聚體噬菌體文庫(New EnglandBiolabs)。5分鐘後，收穫移植腎和從腎取出噬菌體，第一輪「體內生物淘選」。在注射給另一個腎移植受體前，提取的噬菌體在大腸桿菌中擴充。重複這種生物淘選總共三輪。每輪後，取噬菌體樣品，估計移植腎中存在的數量。每次擴充後，噬菌體樣品以菌落生長在瓊脂平板上，因此可以分離噬菌體並可以測定表達文庫肽的DNA序列。圖5(下圖)顯示了每輪生物淘選後，從移植腎中回收的噬菌體(隨機噬菌體)與對照尋靶鏈黴抗生物素蛋白(R3vsStrep)相比增加的數量。鑑定的集中於腎的肽序列的實例是C-LPSPKRT-C、C-LPSPKKT-C、C-PTSVPKT-C。第三輪生物淘選後，噬菌體集中於移植腎，和在受體的其他器官中找到的數量低得多(圖5，下圖)。這些候選肽摻入TargeTran納米顆粒以提供siRNA靶向移植器官的特異性。
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權利要求
1.靶向待捐獻給受試者的器官的細胞中存在的免疫調節或免疫效應基因的尋靶多核苷酸。
2.根據權利要求1的尋靶多核苷酸，其中多核苷酸是單鏈線性多核苷酸、雙鏈線性多核苷酸或髮夾多核苷酸。
3.根據權利要求1的尋靶多核苷酸，其包含靶向選自表1-15公開序列的序列的第一核苷酸序列。
4.一種抑制移植器官被該器官的受體排斥的方法，包括在將器官移植給受體前，使其與包含根據權利要求1的尋靶多核苷酸的組合物接觸的步驟。
5.根據權利要求4的方法，其中該組合物包含根據權利要求2的尋靶多核苷酸。
6.根據權利要求4的方法，其中該組合物包含根據權利要求3的尋靶多核苷酸。
7.根據權利要求4的方法，其中接觸步驟包括用該組合物灌注該器官。
8.根據權利要求4的方法，其中接觸步驟包括將該器官浸泡或浸沒在該組合物中。
9.根據權利要求4的方法，其中該組合物包含多個根據權利要求1的尋靶多核苷酸。
10.根據權利要求4的方法，其中在移植給受試者前的器官貯藏期間，接觸步驟有效下調免疫調節或免疫效應靶基因。
11.根據權利要求4的方法，其中多核苷酸抑制器官的細胞中的靶基因表達。
12.根據權利要求4的方法，其中所述器官是供體的器官。
13.根據權利要求4的方法，其中所述器官是腎。
14.根據權利要求4的方法，其中所述器官是肝。
15.根據權利要求4的方法，其中所述移植器官是肺。
16.根據權利要求4的方法，其中所述器官是胰。
17.根據權利要求4的方法，其中所述器官是心臟。
18.根據權利要求4的方法，其中所述器官是小腸。
19.根據權利要求4的方法，其中所述器官是角膜。
20.根據權利要求4的方法，其中該器官包含選自下組的細胞上皮細胞、血管內皮、血管平滑肌細胞、心肌(心臟)和移植時器官中居留的過客白細胞。
21.根據權利要求4的方法，其中所述受體是人。
22.根據權利要求6的方法，其中尋靶多核苷酸靶向選自表1所列序列的C3(補體C3)序列。
23.根據權利要求6的方法，其中尋靶多核苷酸靶向選自表2所列序列的ICAM1(細胞間粘附分子-1)序列。
24.根據權利要求6的方法，其中尋靶多核苷酸靶向選自表3所列序列的VCAM-1(血管細胞粘附分子-1)序列。
25.根據權利要求6的方法，其中尋靶多核苷酸靶向選自表4所列序列的IFN-γ(幹擾素γ)序列。
26.根據權利要求6的方法，其中尋靶多核苷酸靶向選自表5所列序列的IL-1(白介素-1)序列。
27.根據權利要求6的方法，其中尋靶多核苷酸靶向選自表6所列序列的IL-6(白介素-6)序列。
28.根據權利要求6的方法，其中尋靶多核苷酸靶向選自表7中所列序列的IL-8(白介素-8)序列。
29.根據權利要求6的方法，其中尋靶多核苷酸靶向選自表8中所列序列的TNF-α(腫瘤壞死因子-α)序列。
30.根據權利要求6的方法，其中尋靶多核苷酸靶向選自表9中所列序列的CD80序列。
31.根據權利要求6的方法，其中尋靶多核苷酸靶向選自表10中所列序列的CD86序列。
32.根據權利要求6的方法，其中尋靶多核苷酸靶向選自表11中所列序列的MHC-II(II型主要組織相容性複合體)序列。
33.根據權利要求6的方法，其中尋靶多核苷酸靶向選自表12中所列序列的MHC-I(I型主要組織相容性複合體)序列。
34.根據權利要求6的方法，其中尋靶多核苷酸靶向選自表13中所列序列的CD28序列。
35.根據權利要求6的方法，其中尋靶多核苷酸靶向選自表14中所列序列的CTLA-4序列。
36.根據權利要求6的方法，其中尋靶多核苷酸靶向選自表15中所列序列的PV-B19序列。
37.根據權利要求4的方法，其中組合物進一步包含灌注液體。
38.根據權利要求4的方法，其中組合物進一步包含Polytran聚合物溶液。
39.根據權利要求4的方法，其中組合物進一步包含TargeTran納米顆粒溶液。
40.根據權利要求37的方法，其中灌注液體是高滲枸櫞酸鹽溶液或威斯康星大學溶液。
41.根據權利要求4的方法，其中所述尋靶多核苷酸包含針對一個或多個基因序列的一個或多個siRNA雙鏈體。
42.根據權利要求4的方法，其中尋靶多核苷酸與小分子藥物、單克隆抗體藥物或其他免疫調節劑聯合使用。
43.根據權利要求4的方法，其中組合物包含多個尋靶多核苷酸，並且其中多核苷酸靶向多個基因序列。
44.根據權利要求43的方法，其中尋靶多核苷酸是靶向C3、TNF-α和IL-8基因序列的混合物。
45.根據權利要求4的方法，其中組合物被進一步給予器官受體。
全文摘要
本發明描述了組合物和方法，它們使用siRNA靶向在所移植器官或組織的細胞中表達的各種基因和/或在宿主中表達的基因，以提高移植成功率。
文檔編號A61K31/713GK101426913SQ200680052091
公開日2009年5月6日 申請日期2006年11月30日 優先權日2005年11月30日
發明者M·D·帕克, J·R·普拉特, 劉伊佳, 陽 陸, M·伍德, 謝嶽峰 申請人:因特拉迪格姆公司, 利茲大學