無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒及無機磷(磷酸根)的濃度測定方法

2023-09-17 06:21:00

專利名稱：無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒及無機磷(磷酸根)的濃度測定方法
技術領域：
本發明涉及一種無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，同時本發明還涉及 測定無機磷(磷酸根)濃度的方法，屬於醫學/食品/環境檢驗測定技術領域。
背景技術：
人體內磷的87%都存在於骨骼中，血液中的磷和骨骼中的磷保持動態平 衡，血中鈣、磷濃度之間有一定關係，正常人血鈣升高則血磷降低，反之亦 然。血漿中[鈣]、[磷]濃度的乘積保持在一定範圍；大約每100毫升血漿鈣磷 濃度的乘積為35——40。當二者乘積大於40時，鈣和磷以骨鹽形式沉積在骨 組織，〉70時，可發生轉移性鈣化。當乘積<35時，則將妨礙骨組織的鈣化， 甚至使骨鹽再溶解，影響成骨作用，引起佝僂病或軟骨病。血漿[Ca]、 [Pi]的 恆定，主要受維生素D，甲狀旁腺激素及降鈣素的調節。
由於人體的磷目前還不能直接測定，所以無機磷的檢測實際上是分析磷酸 鹽陰離子(H2P04"， HPO,)。常用的方法有磷鉬酸還原法，非還原法，染料 結合法，酶法，同位素稀釋質譜法、原子吸收分光光度法和流動注射分析法 等。決定性方法是同位素稀釋質譜法，WHO推薦的中等實驗室測定無機磷的 常規方法是比色法。
磷鉬酸還原法又有無蛋白學濾液法和不去蛋白法，後者需在試劑中加入非 離子型表面活性劑以避免混濁。所用還原劑和表面活性劑種類很多，性能比 較穩定的還原劑有硫酸亞鐵，硫酸亞鐵銨，硫酸肼，米吐爾等。表面活性劑 則以聚乙二醇基苯基醚(TritonX-lOO)最理想。磷鉬酸非還原法(直接紫外法)在340nm或325nm直接測定磷鉬酸雜聚化合 物，方法簡便，便於自動化。但黃疸，溶血，脂濁血清在340nm有光吸收， 必須做標本空白，否則結果偏高。
酶法測定無機磷是發展趨勢，其優點是無機磷酸鹽化合物在酶作用下的中 性範圍內是穩定的，可用於常規樣品的自動化分析。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯法(Couple Reaction)技術，計量還原型 煙醯胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定無機磷 (磷酸根)濃度的方法，同時，本發明還將給出用以實現該方法的無機磷(磷 酸根)診斷/測定試劑盒，採用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全 自動生化分析儀上進行無機磷(磷酸根)濃度測定，而且測定速度快、準確 度高，因而可以得到切實的推廣應用。
本發明無機磷(磷酸根)濃度測定方法原理如下
磷酸根+穀氨醯胺+腺苷二磷酸穀氨醯胺合成酶氨+
穀氨酸+腺苷三磷酸 乙醛酸+穀氨酸甘氨酸轉氨酶甘氨酸+ 2-酮戊二酸 甘氨酸+水+輔酶甘氨酸脫氫酶乙醛酸+氨+還原型輔酶
+ H"
這種方法應用穀氨醯胺合成酶(glutamine synthetase; EC 6.3丄2)酶(偶) 聯甘氨酸轉氨酶(glycine transaminase; EC 2.6丄4)、甘氨酸脫氫酶(glycine dehydrogenase; EC 1.4.1.10)酶促反應終點法。穀氨醯胺合成酶酶解無機磷(磷 酸根)反應產生穀氨酸，再通過(偶)聯合甘氨酸轉氨酶、甘氨酸脫氫酶的 作用，最終將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的程度，通過 測量340nm處吸光度上升的程度，可以測算無機磷(磷酸根)的濃度大小。
實驗表明，從測定結果的準確性和配製成本的經濟性兩方面綜合考慮，無 論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關係的本發明無機磷(磷酸根)診斷/測
定試劑盒較為理想
緩衝液 10Ommol/L
穩定劑 500 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
穀氨醯胺合成酶 10000U/L
甘氨酸轉氨酶 12000U/L
甘氨酸脫氫酶 12000 U/L
穀氨醯胺 12 mmol/L
腺苷二磷酸 10mol/L
乙醛酸 6mmol/L
本發明的無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括
緩衝液、穩定劑、輔酶、穀氨醯胺合成酶、甘氨酸轉氨酶、甘氨酸脫 氫酶、穀氨醯胺、腺苷二磷酸、乙醛酸。 試劑盒可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用；也可以配製成液體試 劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1
緩衝液、穩定劑、輔酶、穀氨醯胺、腺苷二磷酸、乙醛酸。 試劑2
緩衝液、穩定劑、穀氨醯胺合成酶、甘氨酸轉氨酶、甘氨酸脫氫酶。輔酶、穀氨醯胺合成酶、甘氨酸轉氨酶、甘氨酸脫氫酶、穀氨醯胺、腺苷 二磷酸、乙醛酸在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是乾粉狀 態，在使用前加水溶解後使用；也可以配製成液體試劑，直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1
緩衝液、穩定劑、輔酶、穀氨醯胺、腺苷二磷酸、乙醛酸。
試劑2
緩衝液、穩定劑、甘氨酸轉氨酶、甘氨酸脫氫酶。
試劑3
緩衝液、穩定劑、穀氨醯胺合成酶。 輔酶、穀氨醯胺合成酶、甘氨酸轉氨酶、甘氨酸脫氫酶、穀氨醯胺、腺苷
二磷酸、乙醛酸在試劑l、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是 乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用；也可以配製成液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發明測定無機磷(磷酸根)濃度的方法， 其輔酶可以是NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一種。
具體實施例方式
下面結合實施例子對本發明作進一步的說明。 實施例一
本實施例的無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑為單試劑，包括 三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩衝液 10Ommol/L 穩定劑 500 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
穀氨醯胺合成酶 10000 U/L
甘氨酸轉氨酶 12000 U/L甘氨酸脫氫酶 穀氨醯胺 腺苷二磷酸 乙醛酸
12000U/L 12 mmol/L 10 mmol/L 6 mmol/L
試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，進行冷凍乾燥，製成乾粉試劑；使用前， 加入純淨水，復溶後使用。
在全自動生化分析儀上設定溫度37"C，反應時間10分鐘，起始吸光度 《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測無機磷(磷酸根)樣品 與試劑的體積比例為1/25，反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間火約0 分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於生化分析儀 下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度，從而測算出無機磷(磷酸根)的 濃度大小。 實施例二
本實施例的無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑為雙試劑，包括
試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩衝液 穩定劑
輔酶
穀氨醯胺 腺苷二磷酸 乙醛酸
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩衝液 100mmol/L
100 mmol/L 50 mmol/L
3 mmol/L 12 mmol/L 10mol/L
6 mmol/L穩定劑
穀氨醯胺合成酶
50 mmol/L 10000U/L 12000U/L
甘氨酸脫氫酶 12000 U/L
試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，製成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37'C，反應時間10分鐘，起始吸光度
《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測無機磷(磷酸根)樣品
與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應方向為正反應(上升反應)，延
遲時間大約O分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於生化分析儀
下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度，從而測算出無機磷(磷酸根)的
濃度大小。
實施例三
本實施例的無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑為三試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩衝液 穩定劑 輔酶
穀氨醯胺 腺苷二磷酸 乙醛酸 試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩衝液 穩定劑
100 mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L 12 mmol/L 10 mmol/L 6 mmol/L
100mmol/L 500 mmol/L甘氨酸轉氨酶
12000 U/L
甘氨酸脫氫酶
12000 U/L
試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩衝液
100 mmol/L
穩定劑
500 mmol/L
穀氨醯胺合成酶
10000U/L
試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，製成液體三試劑，可以直接使用。 測定無機磷(磷酸根)濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37'C，
反應時間10分鐘，起始吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm， 被測無機磷(磷酸根)樣品與試劑l、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5， 反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間大約O分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於生化分析儀 下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度，從而測算出無機磷(磷酸根)的 濃度大小。
申請人經過實驗驗證，採用以上發明內容中記載的其他測定方法均能達 到本發明的目的，鑑於測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。
總之，實驗證明採用本發明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀 器得出所需的測定結果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.0012吸光度 時間反應曲線應呈上升曲線直至終點；試劑可測有效(R》0.99)線形範圍可 達16mmol/L;試劑測試的不準確度，其相對偏差不超過土5 %;試劑測試的 精密度(重複性)的變異係數(CV)《2%;試劑的靈敏度可達0.012± 0.006A/ mmol/L;試劑在2—8"C下保存，活性可以穩定一年；——本發明靈敏度高、 精確度好，線形範圍寬廣，穩定期長，足以便於推廣應用。
權利要求
1.一種酶比色法及酶聯法的無機磷(磷酸根)的濃度測定方法，其方法原理如下磷酸根+穀氨醯胺+腺苷二磷酸 穀氨醯胺合成酶 氨+ 穀氨酸+腺苷三磷酸乙醛酸+穀氨酸 甘氨酸轉氨酶 甘氨酸+2-酮戊二酸甘氨酸+水+輔酶 甘氨酸脫氫酶 乙醛酸+氨+還原型輔酶 +H+將最終反應物置於紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度，測算出無機磷(磷酸根)的濃度大小測定結果。
2. —種無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，主要成分包括緩衝液20-——500 mmol/L穩定劑l一—4000 mmol/L輔酶1—6 mmol/L穀氨醯胺合成酶1000——-80000 U/L甘氨酸轉氨酶1000——-80000 U/L甘氨酸脫氫酶1000———80000 U/L穀氨醯胺1—50 mmol/L腺苷二磷酸1—50 mmol/L乙醛酸1—50 mmol/L試劑成分的濃度不一定只限於上述範圍；在此範圍內效果較好，在此範 圍外，試劑仍會反應作用。其特徵在於試劑盒可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用；也可以配製成液體試劑，直接使用。
3. 根據權利要求2所述無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，其特徵在於 由緩衝液、穩定劑、輔酶、穀氨醯胺合成酶、甘氨酸轉氨酶、甘氨酸脫氫 酶、穀氨醯胺、腺苷二磷酸、乙醛酸組成單劑試劑。
4. 根據權利要求2所述無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，其特徵在於由緩衝液、穩定劑、輔酶、穀氨醯胺合成酶、甘氨酸轉氨酶、甘氨酸脫氫 酶、穀氨醯胺、腺苷二磷酸、乙醛酸組成雙劑試劑；試劑1，由緩衝液、 穩定劑、輔酶、穀氨醯胺、腺苷二磷酸、乙醛酸組成；試劑2，由緩衝液、 穩定劑、穀氨醯胺合成酶、甘氨酸轉氨酶、甘氨酸脫氫酶組成。輔酶、谷 氨醯胺合成酶、甘氨酸轉氨酶、甘氨酸脫氫酶、穀氨醯胺、腺苷二磷酸、 乙醛酸在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據權利要求2所述無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，其特徵在於-由緩衝液、穩定劑、輔酶、穀氨醯胺合成酶、甘氨酸轉氨酶、甘氨酸脫氫 酶、穀氨醯胺、腺苷二磷酸、乙醛酸組成多劑試劑；試劑1，由緩衝液、 穩定劑、輔酶、穀氨醯胺、腺苷二磷酸、乙醛酸組成；試劑2，由緩衝液、 穩定劑、甘氨酸轉氨酶、甘氨酸脫氫酶組成；試劑3，由緩衝液、穩定劑、 穀氨醯胺合成酶組成。輔酶、穀氨醯胺合成酶、甘氨酸轉氨酶、甘氨酸脫 氫酶、穀氨醯胺、腺苷二磷酸、乙醛酸在試劑l、試劑2或試劑3中的位 置可以不限。
6. 根據權利要求2所述無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，其特徵在於還包括穩定劑l一4000mmol/L或0.in/D-100。/。體積比。所述穩定劑為硫酸 銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol),丙二醇(Propylene Glycol)、乙 二醇(Ethyleneglycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發明涉及一種利用酶比色法及酶聯法技術的無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，同時本發明還涉及測定無機磷(磷酸根)濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬於醫學/食品/環境檢驗測定技術領域。本發明的試劑盒主要成分包括緩衝液、輔酶、穀氨醯胺、腺苷二磷酸、乙醛酸、穀氨醯胺合成酶、甘氨酸轉氨酶、甘氨酸脫氫酶及穩定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發生一系列的酶促反應，再將反應物置於紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度上升的程度，從而測算出無機磷(磷酸根)的濃度大小。
文檔編號C12Q1/00GK101609029SQ20081012285
公開日2009年12月23日 申請日期2008年6月19日 優先權日2008年6月19日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾傑生物科技有限公司