納米殼聚糖衍生物及製備方法和它的應用的製作方法

2023-09-17 05:59:35 1

專利名稱：：納米殼聚糖衍生物及製備方法和它的應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及生物醫學納米材料
技術領域：
。具體而言，涉及納米殼聚糖衍生物及製備方法和利用該納米殼聚糖衍生物高選擇性和特異性富集和純化糖基化多肽/蛋白的方法。技術背景翻譯後蛋白質的修飾是蛋白質組學中研究的熱點課題。蛋白質的糖基化是最常見的、最重要的一種蛋白質翻譯後修飾方式，蛋白質的糖基化幾乎調節著生命活動的整個過程，包括細胞的增殖，發育和分化，新陳代謝，免疫應答，腫瘤發生等，一些糖基化蛋白質作為治療疾病的相關耙或生物標識物用於癌症的早期檢測和鑑定，如癌胚抗原用於檢測直腸癌，乳腺癌，前列腺癌和肺癌；CA—125用於檢測卵巣癌；專一性前列腺癌胚抗原用於檢測前列腺癌；Her2/neu用於檢測乳腺癌；等等，因此對糖基化蛋白質的分析和鑑定具有十分重要的作用。蛋白質糖基化的一個重要特點是不均一性，即不同的糖鏈可連於同一位點以及在同一蛋白質上也可有不同的位點連接不同的糖鏈。糖基化的不均一性給糖蛋白質的分離分析帶來了很大的困難不同糖型的同一蛋白質會在電泳上呈現彌散的條帶，導致信號分散，較低豐度的蛋白質得不到鑑定；造成糖蛋白質在色譜中不能良好的分離；目前，質譜技術已經發展成為鑑定糖基化蛋白的重要工具之一，質譜在鑑定糖基化蛋白時，仍面臨巨大的挑戰，其具體體現是第一，糖基化蛋白在細胞內所有蛋白中為低豐度；第二，糖基化蛋白在質譜上表現為一簇解析度很差的峰，得不到準確的分子量。鑑於此，當前國際上的主要研究策略是利用現有技術體系，分離富集糖蛋白質/糖肽，消除糖基化的不均一性及其對質譜的影響，質量標記糖基化位點，從而揚長避短，實現大規模高通量糖蛋白質及糖基化位點的鑑定。目前，常用的糖蛋白質分離富集技術有凝集素親和技術、肼化學富集法、親水相互作用色譜法等。其中凝集素親和技術對含甘露糖基和yv—混多糖的糖蛋白具有較好的親和作用，但是對二觸角的W—多糖糖蛋白的親和作用較弱，對三，四觸角的iV—多糖糖蛋白沒有親和作用；而肼化學富集法需一步氧化反應，從而增加了樣品製備時間和樣品的複雜性。最近開發的帶有苯硼酸的矽材料，對含有糖基化和l糖基化的糖蛋白都具有較好的富集作用，適用所有的含不同結構，不同大小和親水性的糖蛋白，但是其專一性和靈敏性有待提高。殼聚糖(ChitosaiO又稱可溶性甲殼質、甲殼胺、幾丁聚糖等，化學名為2-氨基|3-1，4-葡聚糖，它是甲殼素經脫乙醯基而得到的一種天然陽離子多糖，具有可降解性、良好的成膜性、良好的生物相容性及一定的抗菌和抗腫瘤等優異性能，廣泛應用於醫藥、食品、化工、環保等行業，素有萬能多糖的美譽(R.Jayakumaretal.CarbohydratePolymers62(2005)142-158)。甲殼素在自然界分布非常廣，是一種廉價易得的原料。未見帶有活性硼酸基官能團的殼聚糖衍生物作為固載基質來富集和純化糖基化多肽/蛋白的報導。
發明內容本發明的目的是提供納米殼聚糖衍生物。本發明還提供上述納米殼聚糖衍生物的製備方法。本發明也提供上述納米殼聚糖衍生物在富集和純化糖基化多肽/蛋白方面的應用。納米殼聚糖衍生物，所述殼聚糖衍生物是殼聚糖與烯酸環氧丙酯發生自聚接枝反應的產物，再與氨基取代苯硼酸進行開環加成反應得到的，所述衍生物帶有活性硼酸基官能團，顆粒大小為l-300nm，優選顆粒大小為20-100nm。所述氨基取代苯硼酸為3-氨基苯硼酸、2—氨基苯硼酸或4一氨基苯硼酸。所述烯酸環氧丙酯為<:3-C8直鏈或支鏈烯酸環氧丙酯，優選甲基丙烯酸環氧丙酯(GMA)或丙烯酸環氧丙酯。所述的納米殼聚糖衍生物的製備方法，其特徵在於，按照如下操作步驟進行(O將殼聚糖溶於含有0.卜20wty。酸的水溶液，再與甲基丙烯酸環氧丙酯或丙烯酸環氧丙酯混合，加入引發劑後進行自聚接枝反應，其中，殼聚糖的含量為1.5-2.5wt%，甲基丙烯酸環氧丙酯或丙烯酸環氧丙酯的含量為2-10wt^，反應溫度為40-100°C，反應時間為0.5-4小時，得到中間體；(2)將步驟1得到的中間體與氨基取代苯硼酸置於氯化鈉和碳酸鈉的水溶液中進行開環加成反應，其中，氨基取代苯硼酸的用量是中間體的l-5倍，且佔反應體系的2-10wt^，反應溫度為50-80。C，pH值為8-12，反應時間4-6小時，降至室溫後，過濾，用水洗滌至中性，得到目標產物。所述引發劑為偶氮二異丁腈，正丁基鋰，過硫酸鉀，硝酸鈰銨，硫代碳酸-溴酸鉀，二高碘酸銅酸鉀，過硫酸氨或硫代硫酸鈉中的一種或多種，其中，加入量為反應體系的l-5wt%。所述酸為甲酸或乙酸。以反應原料是殼聚糖、甲基丙烯酸環氧丙酯和3-氨基苯硼酸為例說明本發明的原理，其合成反應式為formulaseeoriginaldocumentpage61中間體2其中，l代表殼聚糖，GMA可以同殼聚糖上的C2氨基發生反應，也可以和C3或Q上的羥基發生反應，也可能與自身的活性官能團反應，GMA和殼聚糖經自聚接枝反應得到上述反應式中的中間體，該中間體帶有活性環氧基團，然後該中間體再與3-氨基苯硼酸發生開環加成反應，從而得到帶有硼酸基活性官能團的納米殼聚糖衍生物2。上述納米殼聚糖衍生物在富集和純化糖基化多肽/蛋白方面的應用，是將酶解後的待分析物或分析物溶於上樣液中，將其加入到上述殼聚糖衍生物納米材料中進行富集，用上樣液將富集糖基化多肽的殼聚糖衍生物洗滌2-5次後再用水快速洗滌1-2次，得到的納米殼聚糖衍生物，可直接用於MALDI-TOF-MS質譜分析或以洗脫溶液洗脫負載的糖基化多肽/蛋白。所述上樣液為含有50mM羥乙基哌嗪乙硫磺酸的0.5M氯化鈉水溶液或50mM碳酸氫氨水溶液。所述洗脫溶液為含有50%乙腈和2%三氟乙酸的水溶液。本發明利用殼聚糖苯硼酸衍生物納米材料富集和分離糖基化多肽/蛋白的方法可按本領域常規操作步驟進行，但是優化了富集糖基化多肽/蛋白的過程，包括吸附、洗滌和洗脫來選擇性地富集糖基化多肽/蛋白。該方法具有較高的特異性，可用於生物樣品中低豐度糖基化多肽/蛋白的純化和富集。此外，本發明將所述納米材料作為色譜填料，用於糖基化多肽/蛋白的富集和純化，從而實現大規模的糖基化多肽/蛋白的分離提純。本發明的有益效果本發明的殼聚糖苯硼酸衍生物納米材料相對於現有材料而言，所選擇材料廉價，易得，具有良好的生物相容性，性質穩定，顆粒大小為l-300nm，外比表面積大，具有很強的吸附能力，可制膜和填充於色譜柱中，富集糖基化多肽後可直接用於質譜分析，無需洗脫。另外，由於殼聚糖是天然陽離子多糖，糖基化蛋白含有糖基，根據相似相容原理和硼酸能與糖基形成酯鍵，以及所用材料的物理化學性能，因此該納米殼聚糖苯硼酸衍生物能高選擇性、特異性的富集和純化糖基化多肽。再用質譜技術鑑定生物標識物或疾病相關靶。圖1為納米材料的紅外吸收光譜圖；圖2為殼聚糖衍生物納米材料的掃描電鏡圖，由圖可以看出，此納米材料為球型，顆粒大小為40-60脆；圖3為辣根過氧化物酶酶解產物(濃度為2xlO—8M)的MALDI-TOF質譜亂其中*為糖基化多肽；圖4為殼聚糖苯硼酸衍生物納米材料對辣根過氧化物酶酶解產物中糖基化多肽的富集和純化的MALDI-TOF質譜圖，其中*為糖基化多肽；圖5為辣根過氧化物酶酶解產物(濃度為2xl(T8M)與牛血清白蛋白的酶解產物以1:8比例混合的MALDI-TOF質譜亂其中*為糖基化多肽；圖6為殼聚糖苯硼酸衍生物納米材料對辣根過氧化物酶酶解產物(濃度為2xl(^M)與牛血清白蛋白的酶解產物以1:8比例混合的混合物中糖基化多肽的富集和純化的MALDI-TOF質譜圖，其中*為糖基化多肽；圖7為殼聚糖衍生物苯硼酸納米材料對人血清中糖基化多肽和糖基化蛋白的富集的質譜圖。具體實施方式下面通過實施例結合附圖對本發明給予進一步的說明。實施例1-6為殼聚糖-GMA-苯硼酸的製備方法，實施例7-9為利用本發明的衍生物富集和純化糖基化多肽/蛋白的方法。實施例l:殼聚糖-GMA-苯硼酸的製備1)殼聚糖-GMA環氧中間體的製備(chitosan-GMA)在裝有攪拌器，溫度計和冷凝管的100mL三口燒瓶中，將0.5克的殼聚糖(青島海匯生物有限公司，脫乙醯度91%)溶於30mL含有乙酸2wt。/。的水溶液中，加入0.5mL的甲基丙烯酸環氧丙酯，攪拌，再加入0.035克過硫酸銨和0.035克硫代硫酸鈉，升溫至50。C，反應2小時，停止反應，降至室溫後，離心去上清液，再用水洗滌，得到固體物。2)殼聚糖-GMA-苯硼酸的製備(chitosan-GMA-APB)在裝有攪拌器，溫度計和冷凝管的100mL三口燒瓶中，裝入步驟l製備的固體物，加入0.5克的3—氨基苯硼酸，0.25克氯化鈉和20mL濃度為2N的碳酸鈉溶液，升溫到60。C，反應5小時，停止反應，降至室溫後，過濾，用水洗漆至中性，得到固體物。由圖2殼聚糖-GMA-苯硼酸介質的掃描電鏡圖可以看出，此材料為球型，大小為40-60nm;圖1的紅外波譜特徵峰為3421.9,2934.1，1730.7,1641.3,1603.7,1572.2，1436.2，1370.2,1339.0，1261.3，1158.3,1065.2，900.8，788.5，749.1，708.5;其中1339.0，1261.3，708.5的特徵吸收峰歸屬於硼酸的吸收峰。元素分析結果為C50.425%，H6.618%，N3.704%。實施例2:與實施例l的方法相同，其中原料丙烯酸環氧丙酯替代甲基丙烯酸環氧丙酯。實施例3-4:與實施例l的方法相同，除了其中的引發劑分別為偶氮二異丁腈和正丁基鋰之外。實施例5—6:與實施例l的方法相同，除了其中的氨基取代苯硼酸分別為2—氨基苯硼酸和4一氨基苯硼酸之外。實施例7:糖基化多肽的富集1).樣品溶液的製備25pg辣根過氧化物酶(Sigma)加入10nL含8M尿素，乙二胺四乙酸(EDTA)和10mM磷酸三(2-氯乙基)酯(TCEP)，在室溫振動1小時，再加入40pL50mM的碳酸氫氨溶液中(pH8.2)，按照與胰蛋白酶的質量比為(40:1)的比例加入胰蛋白酶進行酶解反應，酶解溫度控制在37。C，過夜反應，加入2%三氟乙酸(TFA)終止反應。獲得的蛋白酶解溶液儲存在-80。C冰箱中備用。牛血清白蛋白酶解方法同上，反應時間為14小時。2).糖基化多肽的富集和MALDI-TOF質譜分析將2pLl><10—6mM的辣根過氧化物酶酶解溶液溶於100pL上樣液中，其中，上樣液為含50mM碳酸氫氨水溶液，加入到裝有約0.5mg按實施例1製備的殼聚糖苯硼酸衍生物納米材料的EP管中。在25。C，振速為1000rpm下，振動30分鐘，離心去上清液，用50mM碳酸氫氨水溶液洗滌三次，再用去離子水快速洗滌一次即可用於質譜分析。吸取0.8pL上述富集有糖基化多肽材料的混濁液點在耙板上，再與含1XTFA和50X乙腈的CHCA(10mg/mL)基質溶液混合，用槍頭抽吸幾次，放幹，用MALDI-TOF-MS測定得質譜圖，同時進行未經本發明的納米材料富集的糖基化多肽的對照實驗，所有的MALDI-TOF質譜分析是在島津的AXIMA-CFPplus(KRATOSAnalytical,ShimadzuGroupCompany)飛行時間質譜儀上完成，N2脈衝雷射的波長為337.1nm，實驗中所得數據都在線性正離子模式中進行，質譜分子量的校正採用外標法，所用標準物為IIBradykinin(fragment1-7)(M/z757.3997)，血管緊張素肽(AngiotensinII，M/z1046.5423),[Glul]-FibrinopeptideB(M/z1570.6852)和ACTH(fragment18-39)(M/z2465.1989)。所得譜圖再用內標法進行校正，所用內標為m/z2533.30和4986.20。圖3是0.5nL2xlO—8mM的辣根過氧化物酶酶解所得多肽的質譜圖，以CHCA作基質，由圖可知，譜圖中主要為非糖基化多肽，只能觀察到3個糖基化多肽。圖4是用所述納米材料對其進行富集後所得質譜圖，譜圖中主要為糖基化多肽，說明此納米材料能特異的和高效的富集和純化低豐度的糖基化多肽，分析結果見下表1。實施例8:除上樣液為含有50mM羥乙基哌嗪乙硫磺酸(hepes)的0.5M氯化鈉水溶液之外，其他部分同實施例7。實施例9:特異性富集和純化糖基化多肽樣品的製備和分析將2pL2pmo1的糖基化蛋白辣根過氧化物酶酶解產物與非糖基化蛋白牛血清白蛋白的酶解產物以1:8比例混合，混合液溶於50mM碳酸氫氨溶液中，使總體積為200pL，加入到裝有約0.5mg按實施例1製備的殼聚糖苯硼酸衍生物納米材料的EP管中。在25。C，振速為1000rpm下，振動30分鐘，離心去上清液，用50mM碳酸氫氨水溶液洗滌三次，再用去離子水快速洗滌一次即可用於質譜分析，同時進行未經本發明納米材料處理的對照實驗，吸取0.8nL上述富集有糖基化多肽材料的混濁液點在靶板上，再與含1%TFA和50X乙腈的CHCA(10mg/mL)基質溶液或20mg/mLDHB基質(溶於1XTFA和50%乙腈)混合，用槍頭抽吸幾次，放幹，用MALDI-TOF-MS測定得質譜圖。圖5是0.5pL2xlO—8mM的辣根過氧化物酶酶解產物與牛血清白蛋白酶解產物所得多肽以l:8的比例混合所得質譜圖，由圖可見，只檢測到三個很弱的糖基化多肽峰，大部分是非糖基化多肽峰；圖6是用納米殼聚糖衍生物富集和純化後所得的質譜圖，三個糖基化多肽被所用納米材料捕獲，而大部分非糖基化多肽被洗脫，分析結果見下表1，說明此納米材料能特異的和高效的富集和純化低豐度的磷酸化多肽。實施例10:除上樣液為含有50mM羥乙基哌嗪乙硫磺酸(hepes)的0.5M氯化鈉水溶液之外，其他部分同實施例9。實施例11:血清中的糖基化多肽/蛋白特異的富集和MALDI-TOF-MS分析(1).血清的處理在100pL血清中加入900nL的50mM碳酸氫氨水溶液；(2).將200按上述處理的血清液加入到裝有0.5mg按實施例1製備的殼聚糖苯硼酸衍生物納米材料的EP管中，在室溫下，轉動混旋l小時，轉速為1200rpm，離心去上清液，用50mM碳酸氫氨水溶液洗滌兩次，再用水洗滌一次，離心，去上清液；(3).將0.8的a-氰基-4-羥基肉桂酸(a-Cyano-4-hydroxycinnamicacid，CHCA)基質(濃度為10mg/mL的50%乙腈和1%三氟乙酸的水溶液)點在靶板上，再與上述結合有糖基化多肽/蛋白的親和介質納米材料的懸浮液0.8pL混合，用槍頭抽吸幾次，自然晾乾，用MALDI-TOF-MS測定得質譜圖。由圖7可見，此親和介質納米材料能大量選擇性富集血清中分子量在1kDa-10kDa的糖基化多肽和蛋白質，這是傳統的二維凝膠電泳無法檢出的範圍。實施例12:除上樣液為含有50mM羥乙基哌嗪乙硫磺酸(h印es)的0.5M氯化鈉水溶液之外，其他部分同實施例11。表l檢測到的糖基化多肽序號、胺基酸序列、糖基化數位點數及理論分子量tableseeoriginaldocumentpage10其中，糖基化位置以下劃線表示。權利要求1、納米殼聚糖衍生物，其特徵在於，所述殼聚糖衍生物是殼聚糖與烯酸環氧丙酯發生自聚接枝反應的產物，再與氨基取代苯硼酸進行開環加成反應得到的，所述殼聚糖衍生物帶有活性硼酸基官能團，顆粒大小為1-300nm。2、根據權利要求1所述的納米殼聚糖衍生物，其特徵在於，所述氨基取代苯硼酸為3-氨基苯硼酸、2—氨基苯硼酸或4一氨基苯硼酸。3、根據權利要求1所述的納米殼聚糖衍生物，其特徵在於，所述烯酸環氧丙酯為<:3-Cs直鏈或支鏈烯酸環氧丙酯。4、根據權利要求1或3所述的納米殼聚糖衍生物，其特徵在於，所述烯酸環氧丙酯為甲基丙烯酸環氧丙酯或丙烯酸環氧丙酯。5、權利要求1所述的納米殼聚糖衍生物的製備方法，其特徵在於，包括下列步驟(1)將殼聚糖溶於含有0.1-20wtn/。酸的水溶液，再與甲基丙烯酸環氧丙酯或丙烯酸環氧丙酯混合，加入引發劑後進行自聚接枝反應，在反應體系中，殼聚糖的含量為1.5-2.5wt%，甲基丙烯酸環氧丙酯或丙烯酸環氧丙酯的含量為2-10wt%，反應溫度為40-100°C，反應時間為0.5-4小時，得到中間體；(2)將步驟1得到的中間體與氨基取代苯硼酸置於氯化鈉和碳酸鈉的水溶液中進行開環加成反應，其中，氨基取代苯硼酸的用量是中間體的l-5倍，且佔反應體系的2-10wt^，反應溫度為50-80。C，pH值為8-12，反應時間4-6小時，降至室溫後，過濾，用水洗滌至中性，得到目標產物。6、根據權利要求5所述的製備方法，其特徵在於，所述引發劑為偶氮二異丁腈，正丁基鋰，過硫酸鉀，硝酸鈰銨，硫代碳酸-溴酸鉀，二高碘酸銅酸鉀，過硫酸氨或硫代硫酸鈉中的一種或多種，其中，加入量為反應體系的l-5wt%。7、根據權利要求5所述的納米殼聚糖衍生物的製備方法，其特徵在於，所述酸為甲酸或乙酸。8、納米殼聚糖衍生物在富集和純化糖基化多肽/蛋白方面的應用，其特徵在於，將酶解後的待分析物溶於上樣液中，將其加入到上述殼聚糖衍生物納米材料中進行富集，用上樣液將富集糖基化多肽的殼聚糖衍生物洗滌2-5次後再用水快速洗滌1-2次，得到的納米殼聚糖衍生物，可直接用於MALDI-TOF-MS質譜分析或以洗脫溶液洗脫負載的糖基化多肽/蛋白。9、根據權利要求8所述的應用，其特徵在於，所述上樣液為含有50mM羥乙基哌嗪乙硫磺酸的0.5M氯化鈉水溶液或50mM碳酸氫氨水溶液。10.根據權利要求8所述的應用，其特徵在於，所述洗脫溶液為含有50%乙腈和2%三氟乙酸的水溶液。全文摘要本發明公開了一種屬於生物醫學納米材料
技術領域：
的納米殼聚糖衍生物及其製備方法，該衍生物的製備方法為將殼聚糖溶於稀酸後，與甲基丙烯酸環氧丙酯或丙烯酸環氧丙酯混合，進行自聚接枝反應，得到帶有活性環氧基團的中間體，該中間體與氨基取代苯硼酸進行開環加成反應製得最終的帶有硼酸基活性官能團的納米殼聚糖衍生物，顆粒大小為1-300nm。本發明還公開了該殼聚糖衍生物在富集和純化糖基化多肽/蛋白方面的應用。所述殼聚糖衍生物具有很高的特異性，可用於生物樣品中低豐度的糖基化多肽/蛋白的富集和純化，可用於生物和醫學領域，包括臨床診斷。文檔編號C08B37/08GK101575384SQ200910086838公開日2009年11月11日申請日期2009年6月8日優先權日2009年6月8日發明者丹劉,婁雅欣,彭嘉柔,彬楊,鄒霞娟,鍾麗君申請人:北京大學