一種醋酸阿託西班及其製劑的含量測定和有關物質測定的方法

2023-09-17 07:15:40

專利名稱：一種醋酸阿託西班及其製劑的含量測定和有關物質測定的方法
技術領域：
本發明涉及一種活性多肽原料藥和製劑的方法檢測方法，尤其是涉及醋酸阿託西
班及其製劑的含量測定和有關物質測定的方法。
背景技術：
阿託西班(atosiban)，其化學名稱為1-酸)-4-L-蘇氨酸-8-L-鳥氨酸-催產素。
其結構式為
(3-硫醇丙醇酸)-2-(0-乙基-D酪氨 阿託西班是一種催產素類似物，為人工合成的環狀多肽，是子宮內及蛻膜、胎膜上受體的催產素競爭性拮抗劑，在臨床上使用其醋酸鹽治療早產。醋酸阿託西班注射液(AtosibanAcetate Injection)由輝凌公司(Ferring AB)研製，2000年3月23日首次在奧地利上市，商品名為Tractocile 。 醋酸阿託西班和醋酸阿託西班注射液的有關物質和含量的檢測方法尚未見報導，其測定方法的難度在於在其合成過程中可能會產生缺失(不完全)肽、斷裂肽、去醯胺多肽、非對映異構的多肽和低聚物等多種工藝雜質，通過色譜法進行純化後，無法去除的雜質與主藥的色譜行為比較相似，不易完全分離。

發明內容
本發明的目的是提供一種能測定醋酸阿託西班[1-(3-硫醇丙醇酸)-2-(0_乙基-D酪氨酸)-4-蘇氨酸-8-鳥氨酸-催產素醋酸鹽]及醋酸阿託西班製劑的含量和有關物質的檢測方法。 本發明的醋酸阿託西班含量測定方法如下 採用反相高效液相色譜法檢測1-(3-硫醇丙醇酸)-2-(0_乙基-D酪氨酸)-4-蘇
氨酸_8-鳥氨酸_催產素醋酸鹽及其製劑中醋酸阿託西班的含量，其步驟包括 1)取樣品適量，用流動相A配製成每lml中含0.75mg的溶液，作為供試品溶液； 2)另稱取對照品適量，用流動相A溶解並稀釋製成每lml中含0. 75mg的溶液，作
為對照品溶液；
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3)量取供試品溶液與對照品溶液各20 1，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按
外標法以峰面積計算，得到樣品中醋酸阿託西班的含量。 色譜條件 用十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；以0. 05mol/L的磷酸鹽緩衝液(取磷酸二氫鉀6. 8g，加水至lOOOml，用磷酸調節pH值至2. 3，再加入120 y 1三乙胺，即得)為流動相A，乙腈為流動相B，進行梯度洗脫；檢測波長為215nm ;流速為1. Oml/min。理論塔板數按阿託西班峰計算應不低於5000。梯度洗脫程序如下
時間(分鐘)流動相A (%)流動相B (%)
08020
287327
296040
356040
368020
468020 其中對照品為醋酸阿託西班純品，可從試劑商店購買。
本發明的有關物質含量測定方法，步驟如下 1)取樣品適量，加流動相配製成每1ml中約含1. 5mg的溶液，作為供試品溶液；
2)量取供試品溶液lml，置100ml量瓶中，加流動相A稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液； 3)取對照溶液20 1注入液相色譜儀，調節檢測靈敏度，使主成分色譜峰峰高約為滿量程的20%，再精密量取供試品溶液和對照溶液各20iU，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的2倍，計算有關物質含量。
色譜條件 用十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；以0. 05mol/L的磷酸鹽緩衝液(取磷酸二氫鉀6. 8g，加水1000ml，用磷酸調節pH值至2. 3，再加入120 yl三乙胺，即得)為流動相A，乙腈為流動相B，進行梯度洗脫；檢測波長為220nm ;流速為1. Oml/min。理論塔板數按阿託西班峰計算應不低於5000。梯度洗脫程序如下
時間(分鐘)流動相A (%) 流動相B (%)
08020
287327
446040
496040
508020
608020 其中所述有關物質是指醋酸阿託西班合成過程中帶有的雜質成分，如溶劑，中間
5體，原料，胺基酸片段等，雜質成分為限制成分，測定有關物質目的在於限制其含量。 本發明測定方法的特點是被分析物中各成分間分離徹底，可操作性強，分析方法
專屬性強、準確性和靈敏度高、適應性強為保證藥品安全、有效、可控提供依據。


圖1為0. 1%三氟乙酸乙腈為流動相的色譜圖 圖2為0. 05mol/L磷酸鹽緩衝液乙腈為流動相的色譜圖 圖3為專屬性實驗色譜圖。 圖4為檢測限色譜圖。 圖5為樣品有關物質測定的色譜圖。 圖6為樣品含量測定的色譜圖。
具體實施例方式
以下實施例用於說明本發明，但不作為對本發明的限制。
實施例1 醋酸阿託西班含量測定方法
實驗儀器及色譜條件 Waters 515-717-2996高效液相色譜儀，Agilent C18色譜柱(5 ii m，150X4. 6mm)，以0. 05mol/L的磷酸鹽緩衝液(取磷酸二氫鉀6. 8g，加水1000ml，用磷酸調節pH值至2. 0 3. 0，再加入120 yl三乙胺，即得)為流動相A，乙腈為流動相B，進行梯度洗脫，檢測波長為205 225nm ;流速為0. 8 1. 2ml/min ;進樣量為5 200iU。。
試劑 乙腈(HPLC級)來自美國天地公司，超純水為Millipore超純水機自製。
色譜條件的選擇
1.1流動相 我們通過實驗比較了 0. 1%三氟乙酸(TFA):乙腈(ACN)與0. 05mol/L磷酸鹽緩衝液(PBS) : ACN，以O. 1%三氟乙酸水溶液作為流動相，基線波動大，雜質峰與主峰無法完全分離，幹擾測定；而以0. 05mol/L為流動相，基線平穩，雜質峰與主峰可完全分離，且主峰的對稱性好(見圖l和圖2)。
1. 2檢測波長用紫外分光光度計在200 400nm進行連續掃描，樣品在215nm處有最大吸收，而有關物質大多在220nm處有較強的吸收。同時考慮基線噪音對檢測的幹擾併兼顧測定的靈敏度，選擇有關物質測定的檢測波長定為220nm，含量測定的檢測波長為215nm。
1.3樣品濃度 本品製劑的濃度為7.5mg/ml，為了實驗操作方便準確，分別比較了濃度為0. 75mg/ml與1. 5mg/ml供試品的色譜圖，實驗結果表明，濃度為1. 5mg/ml的樣品雜質峰的峰高及面積均較顯著，且未造成色譜柱過載，因此確定有關物質測定樣品的濃度為1. 5mg/ml，含量測定樣品的濃度為0. 75mg/ml。
檢測條件的驗證
2. 1專屬性 取樣品適量，加流動相A溶解並稀釋製成濃度為1. 5mg/ml的溶液，每lml加10%氫氧化鈉溶液約5滴，室溫放置25分鐘，取20 ii 1注入色譜儀，記錄色譜圖(見圖3)。結果表明，再次檢測條件下，破壞後的樣品中其他組分與主峰均可達到基線分離，專屬性強。
2. 2檢測限 取樣品適量，加流動相A溶解並稀釋後，取20 iU注入液相色譜儀，記錄色譜圖，直至主峰峰高為基線噪音的三倍，測得最低檢出量約為33. 4ng。
2. 3回收率取樣品適量，分別配製成O. 6mg/ml、0. 75mg/ml和0. 9mg/ml3個濃度，每個濃度各3份樣，取20iil注入色譜儀，計算回收率。該方法的平均回收率為100.0X，RSDX為0. 1%。
樣品測定
3. 1有關物質 取本品適量，加流動相配製成每lml中約含1. 5mg的溶液，作為供試品溶液；精密量取供試品溶液lml，置100ml量瓶中，加流動相A稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。取對照溶液20 iU注入液相色譜儀，調節檢測靈敏度，使主成分色譜峰峰高約為滿量程的20%，再精密量取供試品溶液和對照溶液各20ia，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的2倍(見圖5)。
3. 2含量測定 取本品適量，用流動相A配製成每lml中含0. 75mg的溶液，作為供試品溶液；另精密稱取對照品適量，用流動相A溶解並稀釋製成每lml中含0. 75mg的溶液，作為對照品溶液。精密量取供試品溶液與對照品溶液各20 1，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算，即得(見圖6)。
權利要求
一種醋酸阿託西班含量測定方法，其特徵是，其步驟包括1)取醋酸阿託西班原料或製劑樣品適量，用流動相A配製成每1ml中含0.75mg的溶液，作為供試品溶液；2)另稱取對照品適量，用流動相A溶解並稀釋製成每1ml中含0.75mg的溶液，作為對照品溶液；3)量取供試品溶液與對照品溶液各20μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算，得到樣品中醋酸阿託西班的含量；色譜條件為色譜柱以十八烷基矽烷鍵合矽膠C18為填充劑，流動相以0.05mol/L的磷酸鹽緩衝液為流動相A，乙腈為流動相B，洗脫方式梯度洗脫，流速0.8～1.2ml/min，檢測波長UV 205～225nm，配製的樣品溶液濃度每1ml中約含醋酸阿託西班0.1～15mg進樣量5～200μl。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於含量測定的的方法為照中國藥典2005年版二部附錄V D高效液相色譜法測定；色譜條件與系統適用性試驗用十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；以0. 05mol/L的磷酸 鹽緩衝液為流動相A，乙腈為流動相B，進行梯度洗脫；檢測波長為215nm ;流速為1. 0m1/ min，理論塔板數按阿託西班峰計算應不低於5000，梯度洗脫程序如下時間(分鐘)流動相A (%)流動相B (%)08020287327296040356040368020468020其中，磷酸鹽緩衝液的配製方法為取磷酸二氫鉀6. 8g，加水1000ml，用磷酸調節pH值 至2. 3，再加入120 iil三乙胺，即得；測定法取醋酸阿託西班原料或製劑樣品適量，用流動相A配製成每lml中含0. 75mg 的溶液，作為供試品溶液；另精密稱取對照品適量，用流動相A溶解並稀釋製成每lml中含 0. 75mg的溶液，作為對照品溶液，精密量取供試品溶液與對照品溶液各20iU，分別注入液 相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算，即得。
3. —種醋酸阿託西班有關物質的檢測方法，其特徵在於1)取醋酸阿託西班原料或製劑樣品適量，加流動相配製成每lml中約含1. 5mg的溶液， 作為供試品溶液；2) 量取供試品溶液lml，置100ml量瓶中，加流動相A稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液；3) 取對照溶液20 注入液相色譜儀，調節檢測靈敏度，使主成分色譜峰峰高約為滿量程的20%，再精密量取供試品溶液和對照溶液各20iU，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的2倍，計算有關物質含量；色譜條件為色譜柱以十八烷基矽烷鍵合矽膠C18為填充劑，流動相以0. 05mol/L的磷酸鹽緩衝液為流動相A，乙腈為流動相B，洗脫方式梯度洗脫，流速0. 8 1. 2ml/min，檢測波長UV 205 225nm，配製的樣品溶液濃度每lml中約含醋酸阿託西班0. 1 15mg進樣量5 200 ii 1，
4.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於有關物質檢測的的方法為照中國藥典2005年版二部附錄V D高效液相色譜法測定色譜條件與系統適用性試驗用十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；以0. 05mol/L的磷酸鹽緩衝液為流動相A，乙腈為流動相B，進行梯度洗脫；檢測波長為220nm ;流速為1. Oml/min，理論塔板數按阿託西班峰計算應不低於5000，梯度洗脫程序如下時間(分鐘)流動相A (%)流動相B (%)08020287327446040496040508020608020其中，磷酸鹽緩衝液的配製方法為取磷酸二氫鉀6. 8g，加水1000ml，用磷酸調節pH值至2. 3，再加入120 iil三乙胺，即得；測定法取醋酸阿託西班原料或製劑樣品適量，加流動相A配製成每lml中約含1. 5mg的溶液，作為供試品溶液；精密量取供試品溶液lml，置100ml量瓶中，加流動相A稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液，取對照溶液20 ii 1注入液相色譜儀，調節檢測靈敏度，使主成分色譜峰峰高約為滿量程的20%，再精密量取供試品溶液和對照溶液各20iU，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的2倍。
全文摘要
本發明涉及一種醋酸阿託西班及其製劑的含量測定和有關物質測定的方法，檢測方法為高效液相色譜法，色譜條件為色譜柱以十八烷基矽烷鍵合矽膠(C18)為填充劑；以0.05mol/L的磷酸鹽緩衝液為流動相A，乙腈為流動相B，進行梯度洗脫；檢測波長為205～225nm；流速為0.8～1.2ml/min，配製的樣品濃度為每1ml中約含多肽0.1～15mg，進樣量5-200μl，採用本發明的高效液相色譜分析法，可以同時準確測定樣品及其雜質的含量，分析過程中樣品分離徹底，分析結果重現性好，為生產進程中的質量控制分析提供了簡單可靠的方法。
文檔編號G01N30/02GK101696959SQ20091000888
公開日2010年4月21日 申請日期2009年2月11日 優先權日2009年2月11日
發明者付建興, 周宗貞, 崔學雲, 楊平, 王文, 馬中剛 申請人:海南中和藥業有限公司;海南中和多肽藥物研發有限公司;