使用菌根菌與腐生菌共同培養黃鱗鵝膏菌絲體的方法
2023-09-17 01:45:55
使用菌根菌與腐生菌共同培養黃鱗鵝膏菌絲體的方法
【專利摘要】本發明涉及一種使用菌根菌與腐生菌共同培養黃鱗鵝膏菌絲體的方法，屬於大型真菌培養【技術領域】。其特徵為：直接在增殖培養基中加入菌根真菌石灰菌及人工培養的腐生菌香菇，即可使黃鱗鵝膏菌絲體的生長速度提高9～12倍，生長明顯加快。本發明不需繁瑣複雜的流程，只在培養基中加入兩種菌體混合物，即加快了菌絲體繁殖速度，其效果明顯、培養簡單易實現、生產成本不高。鵝膏屬毒素在開發新特效藥如抗腫瘤、抗菌抗病毒、鎮靜或麻醉藥等領域具有潛在地應用，但至今因其資源珍稀、難以人工馴化等瓶頸問題尚難以開發應用。本發明徵對黃鱗鵝膏菌絲生長比較緩慢等制約純培養的問題進行了創新研究，為菌絲的規模化培養及今後人工馴化栽培等提供了依據。
【專利說明】使用菌根菌與腐生菌共同培養黃鱗鵝膏菌絲體的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種使用菌根菌與腐生菌共同培養黃鱗鵝膏菌絲體的方法，屬於生物【技術領域】，具體地說是屬於有毒大型真菌室內培養範疇。
【背景技術】
[0002]鵝膏菌屬—)隸屬於擔子菌亞門、層菌綱、傘菌目、鵝膏菌科 iaceae)，是有毒的大型真菌中較特殊、較有價值的一個世界性廣布大屬,其物種多
樣性是非常豐富的。全球已報導近400種，中國已記錄的近100種(含亞種、變種及變型)。據考證，目前中國仍有不少種尚未研究和命名。但是如今隨著全球生態危機的出現，我國的許多大型真菌資源已告危，處於嚴重衰退及瀕危狀態，而部份種面臨著可能還沒有被人類認識或發現其價值時，就已滅絕的風險。
[0003]鵝膏菌屬中的大部份種屬於著名劇毒菌，據知，因誤食野生蕈菌中毒死亡者95%是因鵝膏菌所致。科學家們對鵝膏菌真正感興趣的是其毒性，因此，大約在140年前，人們就開始了鵝膏菌毒素的研究。鵝膏毒素的應用研究主要體現在以下幾方面:①可用於研究真核生物基因的表達、調控及細胞定位；②可開發抗菌、抗病毒特效新藥可篩選抗腫瘤藥物；④可開發鎮靜、麻醉及其它特效藥可用於生物防冶等。
[0004]目前導致鵝膏難以開發及可持續性利用的主要瓶頸問題有:①鵝膏資源珍稀，其種群小，個體少，產量低，分布數量極其有限，加之對生境敏感，一旦生境受到破壞，極易消失或滅絕，屬於特殊的致危生物類群，這增加了其進一步被研究、利用的難度；②鵝膏菌屬，大多屬於外生菌根真菌，目前尚不能人工栽培。因此，至今國內外還沒有一種能規模化開發的毒素產品，現作為生化試劑的肽類毒素依然價格昂貴(10多年前每克在10萬美元左右—陳作紅等，1999)，難以滿足科研和應用所需。
[0005]鵝膏的純培養是保證鵝膏資源可持續性利用的前提或關鍵，但此目前仍然屬於難以攻克的問題，存在許多盲點，其中菌絲難以誘導、菌絲生長非常緩慢是制約及影響純培養的重要環節或因素。
[0006]黃鱗鵝膏Cl,屬於鵝膏亞屬(Amanita subgen.Amanita)鵝膏組(sect.Amanita),其種群分布較少，目前已成功分離到了該種的菌絲,但菌絲的生長前期仍然很慢，難以擴繁，本發明徵對這個問題，在培養基中加入菌根菌與腐生菌，大大提高了菌絲的生長速度，為鵝膏毒素的可持續性開發利用等奠定了重要基礎。
【發明內容】
[0007]本發明的目的在於，提供一種簡單、易實現、生產成本不高，能使鵝膏菌絲快速生長的培養方法。
[0008]本發明的技術任務是，直接在增殖培養基中同時加入鵝膏屬以外的菌根真菌及人工培養的腐生菌，即可使黃鱗鵝膏菌絲體的生長速度提高9~12倍；
所述的增殖培養基成分為:馬鈴薯200g/L、果糖9~llg/L、蛋白凍1.00~1.25g/L、ZnSO40.40 ~0.60g/L、MgS040.40 ~0.60g/L、玉米素 ZT 0.80 ~1.00mg/L、粉碎的過 80 目分樣篩的生境腐葉土 25~35g/L、瓊脂10.00g/L，控制培養基PH值為5.6~6.0 ;
所述的菌根真菌為採自鵝膏生境中大量生長的石灰菌(JMCtarius piperatus),腐生菌為可室內規模化生產的香燕eiZoofes);石灰菌及香燕的製備及使用方法如下:分別將石灰菌、香菇烘乾，粉碎，二者按1:4比例混合，將混合乾粉，按1:7~1:8的重量體積比加入水，攪勻，用超聲波處理30~40 min，再加入15~20倍水，調節PH值為5.4~
5.6，於45~50°C水浴中，按2.5~3.0%的重量體積比加入纖維素酶，酶解70~100 min後，將水浴溫度升至90~93°C，至水分基本蒸乾時移入65~70°C烘箱中，乾燥25~30hr ；將酶解的乾粉按25~35g/L加入到增殖培養基中；
所述的黃鱗鵝膏菌絲體為本發明前期誘導及培養，誘導及培養方法如下:野外採摘生長良好、未開傘的健康子實體；取菌蓋與菌柄交接處的內部無菌組織塊約0.35cm2大小，輕輕嵌入誘導培養基，所述培養基成分為:馬鈴薯200g/L、果糖9~llg/L、蛋白凍1.00~1.25g/L,MgSO4L 00g/L,CaCl2 1.00g /UKH2PO4 0.50g/L、16.0 波美的麥芽汁 100 ~125ml、瓊脂10.00g/L,控制培養基PH值為5.6~6.0，在22~23°C下暗培養50~60天，組織塊表面長出白色絨毛狀菌絲；將菌絲在上述誘導培養基中繼代培養，即得本發明用菌絲。 [0009]本發明的有益效果是:直接在增殖培養基中加入特殊物質，即可使菌絲體的生長速度大大提高，其特點如下:
(1)效果明顯:加入菌根菌與腐生菌的混合物後，生長速度為未加入以前的9~12倍，生長明顯加快；
(2)培養簡單易實現:不需繁瑣複雜的流程，只要在培養基中加入經過酶解處理的菌體複合物即可；
(3)生產成本不高:本發明採用的兩種菌體物質，一種採自野外，生長量大，易得；另一種市場上隨處可買，價格便宜，二者皆不會造成培養成本的增高。
【具體實施方式】
[0010]以下的實施例子是對本發明的進一步說明，不是對本發明的限制。
[0011]實例一:
野外採摘生長良好、未開傘的健康子實體；取菌蓋與菌柄交接處的內部無菌組織塊約
0.35cm2大小，輕輕嵌入誘導培養基，所述培養基成分為:馬鈴薯200g/L、果糖9g/L、蛋白凍
1.00g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 1.00g /L、KH2PO4 0.50g/L、16.0 波美的麥芽汁 100ml、瓊脂10.00g/L,控制培養基PH值為5.6，在22~23°C下暗培養50天，組織塊表面長出白色絨毛狀菌絲；將菌絲在上述誘導培養基中繼代培養，即得本發明用菌絲；
將菌絲轉入增殖培養基，所述的增殖培養基成分為:馬鈴薯200g/L、果糖9g/L、蛋白凍
1.00g/L、ZnSO40.40g/L、MgSO40.40g/L、玉米素 ZT 0.80mg/L、粉碎的過 80 目分樣篩的生境腐葉土 25g/L、石灰菌及香菇的酶解乾粉25g/L、瓊脂10.00g/L，控制培養基PH值為5.6 ;
所述石灰菌及香菇的製備方法如下:分別將石灰菌、香菇烘乾，粉碎，二者按1:4比例混合，將混合乾粉，按1:7的重量體積比加入水，攪勻，用超聲波處理30min，再加入15倍水，調節PH值為5.4，於45°C水浴中，按2.5%的重量體積比加入纖維素酶，酶解70min後，將水浴溫度升至90°C，至水分基本蒸乾時移入65°C烘箱中，乾燥25hr即可。[0012]實例二:
野外採摘生長良好、未開傘的健康子實體；取菌蓋與菌柄交接處的內部無菌組織塊約0.35cm2大小，輕輕嵌入誘導培養基，所述培養基成分為:馬鈴薯200g/L、果糖llg/L、蛋白凍 1.25g/L,MgSO4L 00g/L,CaCl2 1.00g/L,KH2PO4 0.50g/L、16.0 波美的麥芽汁 125ml、瓊脂10.00g/L,控制培養基PH值為6.0，在22~23°C下暗培養60天，組織塊表面長出白色絨毛狀菌絲；將菌絲在上述誘導培養基中繼代培養，即得本發明用菌絲；
將菌絲轉入增殖培養基，所述的增殖培養基成分為:馬鈴薯200g/L、果糖llg/L、蛋白凍 1.25g/L、ZnSO40.60g/L,MgSO40.60g/L、玉米素 ZT 1.00mg/L、粉碎的過 80 目分樣篩的生境腐葉土 35g/L、石灰菌及香菇的酶解乾粉35g/L、瓊脂10.00g/L，控制培養基PH值為6.0 ；所述石灰菌及香菇的製備方法如下:分別將石灰菌、香菇烘乾，粉碎，二者按1:4比例混合，將混合乾粉，按1:8的重量體積比加入水，攪勻，用超聲波處理40 min，再加入20倍水，調節PH值為5.6，於50°C水浴中，按3.0%的重量體積比加入纖維素酶，酶解100 min後，將水浴溫度升至93°C，至水分基本蒸乾時移入70°C烘箱中，乾燥30hr即可。
[0013]實例三:
野外採摘生長良好、未開傘的健康子實體；取菌蓋與菌柄交接處的內部無菌組織塊約
0.35cm2大小，輕輕嵌入誘導培養基，所述培養基成分為:馬鈴薯200g/L、果糖10g/L、蛋白凍 1.10g/L, MgSO4L 00g/L、CaCl2 1.00g /UKH2PO4 0.50g/L、16.0 波美的麥芽汁 110ml、瓊脂10.00g/L，控制培養基PH值為5.6，在22~23°C下暗培養55天，組織塊表面長出白色絨毛狀菌絲；將菌絲在上述誘導培養基中繼代培養，即得本發明用菌絲；
將菌絲轉入增殖培養基，所述的增殖培養基成分為:馬鈴薯200g/L、果糖10g/L、蛋白凍 1.10g/L、ZnSO40.50g/L,MgSO40.50g/L、玉米素 ZT 0.90mg/L、粉碎的過 80 目分樣篩的生境腐葉土 30g/L、石灰菌及香菇的酶解乾粉30g/L、瓊脂10.00g/L，控制培養基PH值為5.6 ；所述石灰菌及香菇的製備方法如下`:分別將石灰菌、香菇烘乾，粉碎，二者按1:4比例混合，將混合乾粉，按1:7的重量體積比加入水，攪勻，用超聲波處理35 min，再加入18倍水，調節PH值為5.4，於48°C水浴中，按2.8%的重量體積比加入纖維素酶，酶解90 min後，將水浴溫度升至91°C，至水分基本蒸乾時移入68°C烘箱中，乾燥28hr即可。
[0014]實例四:
野外採摘生長良好、未開傘的健康子實體；取菌蓋與菌柄交接處的內部無菌組織塊約
0.35cm2大小，輕輕嵌入誘導培養基，所述培養基成分為:馬鈴薯200g/L、果糖10g/L、蛋白凍 1.20g/L, MgSO4L 00g/L、CaCl2 1.00g /UKH2PO4 0.50g/L、16.0 波美的麥芽汁 120ml、瓊脂10.00g/L，控制培養基PH值為6.0，在22~23°C下暗培養58天，組織塊表面長出白色絨毛狀菌絲；將菌絲在上述誘導培養基中繼代培養，即得本發明用菌絲；
將菌絲轉入增殖培養基，所述的增殖培養基成分為:馬鈴薯200g/L、果糖10g/L、蛋白凍 1.20g/L、ZnSO40.55g/L,MgSO40.55g/L、玉米素 ZT 0.85mg/L、粉碎的過 80 目分樣篩的生境腐葉土 28g/L、石灰菌及香菇的酶解乾粉28g/L、瓊脂10.00g/L，控制培養基PH值為6.0 ；所述石灰菌及香菇的製備方法如下:分別將石灰菌、香菇烘乾，粉碎，二者按1:4比例混合，將混合乾粉，按1:8的重量體積比加入水，攪勻，用超聲波處理38 min，再加入17倍水，調節PH值為5.6，於47°C水浴中，按2.6%的重量體積比加入纖維素酶，酶解80 min後，將水浴溫度升至92°C，至水分基本蒸乾時移入67°C烘箱中，乾燥26hr即可。
【權利要求】
1.一種使用菌根菌與腐生菌共同培養黃鱗鵝膏菌絲體的方法，其特徵為，在增殖培養基中同時加入鵝膏屬以外的菌根真菌及人工培養的腐生菌，能使黃鱗鵝膏菌絲體的生長速度提高9~12倍。
2.根據權利要求1所述的使用菌根菌與腐生菌共同培養黃鱗鵝膏菌絲體的方法，其特徵為，所述的增殖培養基成分為:馬鈴薯200g/L、果糖9~llg/L、蛋白凍1.0O~1.25g/L、ZnSO40.40 ~0.60g/L、MgS040.40 ~0.60g/L、玉米素 ZT 0.80 ~1.00mg/L、粉碎的過 80 目分樣篩的生境腐葉土 25~35g/L、瓊脂10.00g/L，控制培養基PH值為5.6~6.0。
3.根據權利要求1所述的使用菌根菌與腐生菌共同培養黃鱗鵝膏菌絲體的方法，其特徵為，菌根真菌為採自鵝膏生境中大量生長的石灰菌腐生菌為可室內規模化生產的香eiZoofes);石灰菌及香燕的製備及使用方法如下:分別將石灰菌、香菇烘乾，粉碎，二者按1:4比例混合，將混合乾粉，按1:7~1:8的重量體積比加入水，攪勻，用超聲波處理30~40 min,再加入15~20倍水，調節PH值為5.4~5.6，於45~50°C水浴中，按2.5~3.0%的重量體積比加入纖維素酶，酶解70~100 min後，將水浴溫度升至90~93°C，至水分基本蒸乾時移入65~70°C烘箱中，乾燥25~30hr ;將酶解的乾粉按25~35g/L加入到增殖培養基中。
4.根據權利要求1所述的使用菌根菌與腐生菌共同培養黃鱗鵝膏菌絲體的方法，其特徵為，黃鱗鵝膏菌絲體為本發明前期誘導及培養，誘導及培養方法如下:野外採摘生長良好、未開傘的健康子實體；取菌蓋與菌柄交接處的內部無菌組織塊約0.35cm2大小，輕輕嵌入誘導培養基，所述培養基成分為:馬鈴薯200g/L、果糖9~llg/L、蛋白凍1.00~1.25g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 1.00g /L、KH2PO4 0.50g/L、16.0 波美的麥芽汁 100 ~125ml、瓊脂.10.00g/L，控制培養基PH值為5.6~6.0，在22~23°C下暗培養50~60天，組織塊表面長出白色絨毛狀菌絲；將菌絲在上述誘導培養基中繼代培養，即得本發明用菌絲。
【文檔編號】C12N1/14GK103667084SQ201310701996
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月19日 優先權日:2013年12月19日
【發明者】李宗菊, 張曦予, 程霞, 唐萍, 曹玉, 馮遼遼, 趙昱, 左奎 申請人:雲南大學