無限制通量診斷微球定量測定系統及其在生物醫學中用途的製作方法

2023-09-17 09:59:15 2

專利名稱：：無限制通量診斷微球定量測定系統及其在生物醫學中用途的製作方法
技術領域：
：本發明屬於生物醫學技術產業開發及用途領域。具體涉及無數種不同阻抗免疫微球製作、無數種阻抗編碼無數種待測物質種類，免疫微球檢測方法及其檢測裝置以及其在生物醫學領域中的用途。
背景技術：
：目前建立在抗原抗體反應基礎上的檢測技術，包括酶聯免疫吸附試驗(ELISA)技術，放射免疫技術、發光免疫技術、膠體金免疫技術、螢光免疫技術、發光免疫技術、蛋白質晶片技術和生物蛋白質傳感技術等。建立在核酸分子鹼基配對原理技術上的檢測技術，包括Northernblot技術、Southernblot技術和原位雜交技術和聚合鏈反應技術(PCR技術)等。我們以ELISA技術為例一般存在以下不足①是一種試劑只能測定一個項目。比如測定B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的試劑只能測定HBsAg，而不能同時測定B型肝炎病毒表面抗體(HbsAb)。醫院檢驗科或科研技術人員每次實驗只能測定一項指標，要檢測某種疾病的相關物質，就要進行大量的重複性工作(如B型肝炎兩對半系列)，花費大量的人力，物力和資源，增加檢驗成本。②是質量控制比較困難。我們不可能對一批試劑盒的測定板的每個測定孔，逐一進行質量檢查。質量控制部門，只能從一批ELISA測定扳中，進行隨機抽樣檢査，這很難保證標本測定結果的準確性。這也是ELISA技術很難象液體試劑測定血糖那樣，對質量進行有效監督的原因。③是準確定量比較困難，靈敏度不高，操作複雜。ELISA技術最終以測定孔液體顏色深淺作為陽性判讀標準，由於受到顯色時間的影響，使結果很難做到準確定量。此外該技術測定步驟煩瑣，需要時間長，存在人為誤差等缺點。除了ELISA技術之外，其他技術也各有各的缺點和不足，有的技術雖然快速，但只能定性、不能定量；有的技術雖然能夠定量，但檢測成本很高，且難以進行質量控制。固體生物晶片(包括蛋白質和基金晶片)技術，同時可以測定上千種物質，但一般用於定性(判斷陰性和陽性)而難以用於定量測定。建立在不同顏色微球基礎上的液態晶片技術，該技術用不同顏色編碼不同測定項目，解決了可以同時定量測定上千種物質的難題，但也存在以下不足-一是最多只能得到ioo種比較穩定的不同顏色微球,這無法滿足日益增多的檢驗科檢測和醫學科研項目的要求，屬於有限通量測定技術。二是檢測設備對顏色種類精細判讀，可能存在誤差，不可能同時檢測無數種待測物質，三是是微球顏色對微球表面的光信號測定，會產生幹擾。四是不同顏色微球，因保存時間長，可能會出現脫色。五是測定設備要求條件高。需要高靈敏的顏色判斷和可以消除微球自身顏色的微球表面光信號定量測定設備，對該液態晶片技術，進行測定。這在技術不太發達的國家，很難開發和生產出這種測定設備，不利於國家要求的實驗診斷設備和試劑國產化發展要求。
發明內容本發明的阻抗變量液態晶片技術是在美國傳統液態晶片技術上的一次全新改良和創新，是設計上的一次飛躍。微球阻抗變量與顏色編碼不同，阻抗微球編碼可以做到無限多，決定了本發明在生物醫學領域具有更廣泛的用途。蛋白質組學和基因組學需要測定無數種待測物質。疾病診斷和療效觀察也需要越來越多的檢測指標。本發明最終目的是，阻抗變量無限制通量免疫微球定量分析系統，取代目前醫院檢驗科或醫學科研院校所有ELISA項目、放射免疫項目和基因檢測項目等建立在抗原抗體反應和核酸分子雜交技術上的所有項目。徹底改變醫院實驗室的項目分工和儀器配置，未來醫院和研究機構只需一臺阻抗變量液態生物晶片技術測定儀，即可以測任何抗原、抗體和未知基因片段，還可以進行細胞計數。液態生物晶片測定儀，是一臺多功能的實驗診斷設備。為了達到以上目的，本發明分以下幾個步驟。1)按照本發明的方法，生產阻抗變量無限制通量免疫微球定量分析系統。包括(1)製作不同阻抗微球，(2)將抗原、抗體和已知DNA片段包被在不同阻抗微球上，(3)其它配套試劑。2)按照本發明的方法和設計原理，生產阻抗變量無限制通量免疫微球定量分析系統測定設備。包括(1)國家有關部門對不同阻抗微球代表不同測定項目的認可和標準化制訂。(2)—種同時可以測定微球阻抗和微球表面光信號設備的設計，開發和生產。3)向國內外醫院和科研機構推廣使用。包括(1)基因組學中無數種未知DNA序列測定鑑定，(2)蛋白質組學無數種大量蛋白質抗原物質測定，(3)疾病診斷中無數種指標測定，(4)疾病療效觀察和判斷中無數種指標測定。本發明的技術方案為1.本發明的阻抗變量無限制通量免疫微球定量分析系統整體技術方案可行性論證。很多發明專利因技術要求過高，而難以進行開發和推廣。顏色分辨技術要求高，超過100種顏色，一般技術難以實現，研製出一種分辨無數種顏色的設備，更不可能。電阻大小可以用連續的定量數值表示，理論上可以有無限多個電阻大小微球編碼無數種不同的待測物質種類。本發明專利技術要求相對低，結果更可靠。凡是能生產出血球細胞計數儀和流式細胞儀的廠家，均能開發出本發明所設計的阻抗變量無限通量免疫微球定量分析系統。1.1微球無數種不同阻抗測定技術可行性分析血球計數儀的基本原理，就是測定血液各細胞的阻抗不同而進行分類計數的。微孔電阻測定原理能夠檢測到微球阻抗的微小變化，目前成熟的技術完全能夠滿足對微球阻抗變量的檢測。此外，不同阻抗微球(阻抗變量微球)生產工藝成熟，採用導電物質(如金屬粉末，聚苯胺等)與合成微球原料(如聚苯乙烯等)混合的方法，可生產無數種阻抗變量微球。由於導電成分可以與合成微球原料按任意比例混合，從理論上可以生產出無數種電阻大小不同的微球，合成的微球經羧基化或胺基化處理後，與抗原、抗體、DNA或RNA的共價連接，生產出無數種不同阻抗免疫微球。1.2本發明的阻抗變量無限通量免疫微球研製技術可行性分析。無數種不同阻抗微球表面通過羧基化和胺基化處理，可通過共價鍵牢固連接不同的蛋白質抗原、抗體或DNA上，製作本發明的阻抗變量無限通量免疫微球，該技術是成熟的技術。1.3本發明的阻抗變量無限通量免疫微球定量分析技術可行性分析。只要同時能檢測微球電阻大小變化和微球表面螢光或發光信號強弱的儀器，即可滿足本發明的設備要求。在原理上是血球計數儀和流式細胞儀的有機結合，也是成熟的技術。2.本
發明內容分兩部分。一是阻抗變量無限通量免疫微球定量分析系統的研製，二是阻抗變量無限通量免疫微球定量分析系統在生物醫學中的應用。2.1阻抗變量無限通量免疫微球定量分析系統的研製(l)生產無數種不同阻抗大小的體積相同的免疫微球電阻是物質的一種屬性，電阻大小在數學上屬於連續變量。不同化學成分微球，具有不同的電阻。本發明的創新之處是將導電物質(如金屬粉末和聚苯胺等)和合成微球的原料(如苯乙烯)按任意比例進行混合，可生產出無數種不同阻抗特徵的體積相同的微球如圖1所示。以苯乙烯為原料合成乳膠微球為例，首先將導電高分子材料聚苯胺與苯乙烯，按不同比例混合，控制反應條件通過成熟的乳膠生產工藝，生產出符合要求的不同阻抗聚苯乙烯乳膠微球。導電高分子材料聚苯胺含量可以任意變化，可生產出無數種阻抗大小不同的微球(表2)。tableseeoriginaldocumentpage7注本表只起示意作用。具體配方不限於本表數據和原料物質。為了保證摻入金屬成分不影響乳膠微球表面的活性，本發明第2創新之處，是製作"雙心乳膠"如圖2所示。首先生產出還有金屬成分的核心，然後外面再包裹一層不含金屬成分的乳膠外殼，形成"雙心乳膠"微球。這種"雙心乳膠"微球不影響乳膠微球的表面活性，不會影響已知抗原、抗體和DNA包被在乳膠表面的效果。(2)生產無數種不同阻抗大小的體積不相等的微球同樣電阻率(或電導率)材料微球，微球體積越大，電阻越大。為了從外觀上區分不同阻抗的微球，同樣的微球原料，根據成熟的技術嚴格控制條件，可以製作成不同體積大小的微球，微球體積越大，電阻就越大。(3)製備無數種不同阻抗免疫微球購買或自己研製的無數種不同阻抗微球，按照成熟的技術和文獻對微球表面進行化學處理，製作無數種不同阻抗系列的羧化或胺化聚苯乙烯乳膠微球，可共價牢固連接抗原、抗體和DNA化學分子，製備無數種不同阻抗系列免疫微球如圖3所示。(4)無數種不同阻抗大小微球編碼無數種待測物質或未知物質項目種類。i確定不同微球電阻與測定成分一一對應,制定不同阻抗微球編碼不同待測物質對應表。由於微球電阻變化無限性，也決定著待測項目的無限性。不同電阻微球包括不同成分的相同體積微球和相同成分的不同體積微球。al,a2,a3等代表生物醫學某個領域項目(如疾病診斷項目)，bl,b2,b3等代表生物醫學另外一個領域(如基因組學或蛋白質組學測定項目)見表3。tableseeoriginaldocumentpage7注本表只起示意作用。具體阻抗和項目對應數據不限於本表數據ii將不同阻抗編碼的不同待測物質種類信息，輸入阻抗變量無限通量免疫微球定量分析裝置軟體處理系統。軟體處理系統自動分析不同阻抗(項目)微球表面光信號。(5)生產阻抗變量無限通量免疫微球。採用成熟的化學共價標記技術，將用於測定不同項目的特異性抗體、特異性抗原或己知DNA)化學交聯在相對應的不同電阻微球表面，生產出一系列阻抗變量無限通量免疫微球。具體操作方法可在相關資料和教材中査閱，這裡不再詳細描述。(6)配製阻抗變量無限通量免疫微球定量分析所需的配套試劑。根據待測物質或未知物質的性質不同，設計出不同的配套試劑。①待測成分為蛋白質、多糖類、脂類抗原物質。這類物質包括，a)在疾病診斷和疾病療效觀察領域中的已知或未知的細菌、支原體、衣原體、病毒等表面特異抗原(屬於確診性診斷)、多種腫瘤標記物、體內蛋白質多肽物質(如C反應蛋白，激素、類風溼因子等)。b)在生物醫學科研領域(如基因組學，蛋白質組學)無數種蛋白質、多糖類、脂類抗原物質等。檢測這類物質成分，需要微球表面包被其特異性抗體，進行測定。以乳膠微球表面為反應平臺，採用雙抗夾心法加以說明，這類測定項目的配套試劑包括以下幾種成分。(1)游離相應多種特異性抗體溶液(2)螢光或發光物標記的第二抗體(抗抗體)溶液(3)抗原抗體結合反應緩衝液(4)乳膠微球洗滌緩衝液(5)螢光或發光反應緩衝液以上緩衝液均可在公開的資料文獻或教材上，找到配方，這裡不再詳述。特異單克隆抗體和標記第二抗體可以通過購買獲得或自行生產。②待測物質為蛋白質抗體。這類物質主要包括a)在疾病診斷和疾病療效觀察領域中，由於患者感染了細菌、支原體、衣原體、病毒，而產生的特異抗體。此外，某些疾病也會診斷自身物質產生的病理性抗體。b)在生物醫學科研領域(如基因組學，蛋白質組學)，需要測定的無數種蛋白質抗體物質等。這類檢測項目，需要乳膠微球表面標記相對應的特異抗原成分，進行測定。這類測定項目的配套試劑包括以下幾種成分。(1)游離相應螢光或發光物標記多種特異性抗原溶液(2)抗原抗體結合反應緩衝液(3)乳膠微球洗滌緩衝液(4)螢光或發光反應緩衝液以上緩衝液均可在公開的資料文獻或教材上，找到配方，這裡不再詳述。特異單克隆抗體和抗原(細菌特徵蛋白、病毒顆粒)，標記第二抗體可以通過購買獲得或自行生產。③待測物質為DNA或RNA。這類物質主要包括，a)在疾病診斷和疾病療效觀察領域中，體內微生物尤其是病毒的特異DNA或RNA片段(確診性診斷)，b)在生物醫學科研領域(如基因組學，蛋白質組學)，需要測定的無數種DNA或RNA等。這類項目的檢測需要乳膠微球表面包被相對應的DNA或RNA片段，進行分析。這類項目的配套試劑包括以下幾種成分。(1)游離用螢光或發光物標記的DNA片段(基因探針)溶液(2)雜交反應緩衝液(3)乳膠微球洗滌緩衝液(4)螢光或發光反應緩衝液以上試劑來源方便，製作技術成熟。這裡不再詳細說明。(7)組裝阻抗變量液態生物晶片試劑盒。將已包被無數種抗原、抗體和DNA(RNA)的無數種微球(阻抗變量無限通量免疫微球)及其配套試劑，組合包裝成為阻抗變量無限通量免疫微球定量分析試劑盒。試劑盒內有多少種不同電阻的免疫微球，就代表能同時測定多少種項目。(8)阻抗變量無限通量免疫微球檢測方法和裝置。阻抗變量無限通量免疫微球檢測方法為，首先，同時或先後測定阻抗變量無限通量免疫微球的電阻大小和微球表面光信號強度。然後，根據不同阻抗微球對應的不同項目種類，判斷標本中那些待測物質陰性，那些待測物質陽性以及含量。最後，列印結果報告。阻抗變量無限通量免疫微球檢測方法原理見圖4。本發明的阻抗變量無限制通量免疫微球測定方法，藉助配套試劑盒及裝置進行。配套試劑盒如同前述。阻抗變量無限通量免疫微球測定裝置，包括2個測定裝置和1套數據處理軟體如圖5所示。第一個測定裝置就是微孔阻抗測定裝置。該裝置能準確測定通過微孔的微球的電阻大小，其原理與細胞計數儀的工作原理基本相同。根據不同阻抗編碼的項目種類，微孔阻抗測定裝置可以準確判讀微球的測定項目類別。第二個測定裝置是對通過微孔的微球表面的螢光或發光信號，進行定量檢測裝置。其原理與流式細胞儀工作原理基本相同。本發明的微球液態生物晶片測定技術，從本質上就是全自動血細胞計數技術和流式細胞測定技術的有機結合，該裝置技術成熟，某些高檔次的血球計數儀，已經具備該項功能，在這裡不再詳細描述。第三個軟體分析系統，就是對先後或同時接收的微球電阻信號以及該微球表面光信號，按照阻抗編碼項目表，準確分析出在無數種測定項目中，那些物質陰性，那些物質陽性，並在標準參比條件下進行定量如圖6所示。軟體分析系統首先預設微球阻抗值(或範圍)代表的測定項目(表3)，然後，分析不同阻抗微球(測定項目)表面的螢光或光信號強度(物質含量)，以標準物做參比，計算待測物質含量，最後將數據傳輸給印表機，列印結果報告。表3:不同乳膠微球阻抗代表不同測定項目微球電阻(歐姆)123…102030...100200300測定物質HBVHCVHDV…AFPCEACA-153...胰島素T3T4值得說明的是，如果我們設定某阻抗為人體血液白細胞、紅細胞和血小板的電阻特徵值，本裝置可以同時具備血球計數儀的功能。阻抗變量無限制通量免疫微球定量分析系統在生物醫學領域的用途1.疾病相關抗原類測定疾病診斷和觀察療效需要測定機體內多種抗原物質。隨著對疾病發生機理的研究深入，越來越多的疾病相關抗原被發現，常規方法包括顏色編碼的免疫微球定量測定系統一次也只能完成100種左右抗原物質測定，遠遠不能滿足醫院實驗診斷未來發展的需要。發明人採用阻抗變量無限制通量免疫微球定量分析系統一次可以同時測定無數種待測抗原。發明人以同時測定n種(n大於l且小於正無窮)疾病相關抗原類為例，加以說明。l)自己生產或購買n種不同阻抗的可用來化學共價鍵標記的乳膠微球。1)將乳膠微球按阻抗從小到大進行分類並編碼n種不同疾病相關抗原。2)制定n種不同阻抗微球編碼待測抗原對應表。4)自己購買或自己生產針對n種抗原的單克隆抗體。5)按照不同阻抗微球編碼待測抗原對應表,將n種單克隆抗體，分別共價鍵結合在n種不同阻抗的微球表面，製作免疫微球，1500g離心，IO分鐘，棄去游離未標記的抗體。n種免疫微球用磷酸緩衝液洗滌後，按等比例混合，用磷酸緩衝液重懸，製成每升含105個微球濃度的n元阻抗免疫微球混合液。4)將250微升n元阻抗免疫微球混合液放入1毫升的EF離心管內，再加250微升血清或其他測定標本，充分混勻，37。C震蕩保溫l分鐘2小時，使微球表面抗體和樣品中待測抗原充分結合。5)離心管1500g離心IO分鐘，棄去上清，用PBS重懸，再離心，再去上清，對n元阻抗免疫微球進行洗滌，徹底洗去離心管中游離的待測物質。6)加入含有抗n種抗原的n種單克隆抗體磷酸緩衝液500毫升，37。C震蕩保溫30分鐘1小時，使它們分別與結合在微球上的待測物質反應，重複第5)步，對微球進行洗滌，棄去上清液。7)加入螢光標記的抗人免疫球蛋白抗體(抗抗體)500毫升，37。C震蕩保溫45分鐘，與結合在微球表面的抗體結合，重複步驟5)，徹底洗滌，留微球沉澱。8)將微球螢光測定緩衝液重懸微球沉澱，使用能同時測定微球阻抗和微球表面螢光強度的設備，進行微球阻抗(測定項目)和微球表面螢光強度(物質含量)測定。9)結果判讀如果nl阻抗微球表面螢光陽性，說明血清nl抗原陽性，螢光強度與nl抗原濃度呈正比。採用nl抗原標準濃度做參比測定，可對nl進行準確定量。如果n種阻抗微球，只有nl,n2,n3,n4,n5等五種阻抗微球表面螢光同時陽性，說明血液內同時存在nl,n2,n3,n4,n5五種抗原物質，其他n-5種抗原均陰性。如果n種阻抗微球表面螢光信號均陽性，說明血液中同時存在n種抗原物質。依次類推。本發明技術方案也適用於生物醫學蛋白質組學中無數種待測抗原的測定。如果要測n種抗原物質，需要n種不同電阻的微球，操作同上。上述技術方案只起示範作用，具體詳見有關技術資料。2.疾病相關抗體類測定測定體內某些物質的抗體，能間接說明體內感染了某些物質，疾病診斷和觀察療效需要測定機體內多種抗體物質。隨著對疾病發生機理的研究深入，越來越多的疾病相關抗體被發現，常規方法包括顏色編碼的免疫微球定量測定系統一次也只能完成100種左右抗體物質測定，遠遠不能滿足醫院實驗診斷未來發展的需要。發明人採用阻抗變量無限制通量免疫微球定量分析系統一次可以同時測定無數種待測抗體，發明人以同時測定n種(n大於l且小於正無窮)疾病相關抗體類為例，加以說明。1)自己生產或購買n種不同阻抗的可用來化學共價鍵標記的乳膠微球。2)將乳膠微球按阻抗從小到大進行分類並編碼n種不同疾病相關抗體。3)制定n種不同阻抗微球編碼待測抗體對應表。4)自己購買或自己生產針對n種抗體的抗抗體或相對應抗原。5)按照不同阻抗微球編碼待測抗體對應表,將n種可與n種待測抗體結合的n種抗抗體或相對應抗原，分別共價鍵結合在n種不同阻抗的微球表面，製作免疫微球，1500g離心，10分鐘，棄去游離未標記的抗抗體或相對應抗原。n種免疫微球用磷酸緩衝液洗滌後，按等比例混合，用磷酸緩衝液重懸，製成每升含105個微球濃度的11元阻抗免疫微球混合液。6)將250微升n元阻抗免疫微球混合液放入1毫升的EF離心管內，再加250微升血清或其他測定標本，充分混勻，37。C震蕩保溫l分鐘2小時，使微球表面和樣品中待測抗體充分結合。7)離心管1500g離心IO分鐘，棄去上清，用PBS重懸，再離心，再去上清，對n元阻抗免疫微球進行洗滌，徹底洗去離心管中游離的待測物質。8)加入含有抗n種抗體的n種抗抗體或相對應抗原磷酸緩衝液500毫升，37°C震蕩保溫30分鐘1小時，使它們分別與結合在微球上的待測物質反應，重複第5)步，對微球進行洗滌，棄去上清液。9)加入螢光標記的抗n種抗抗體或相對應抗原的抗體500毫升，37。C震蕩保溫45分鐘，與結合在微球表面的抗體結合，重複步驟5)，徹底洗滌，留微球沉澱。10)將微球螢光測定緩衝液重懸微球沉澱，使用能同時測定微球阻抗和微球表面螢光強度的設備，進行微球阻抗(測定項目)和微球表面螢光強度(物質含量)測定。11)結果判讀如果nl阻抗微球表面螢光陽性，說明血清nl抗體陽性，螢光強度與nl抗體濃度呈正比。採用nl抗體標準濃度做參比測定，可對nl進行準確定量。如果n種阻抗微球，只有nl,n2,n3，n4,n5等五種阻抗微球表面螢光同時陽性，說明血液內同時存在nl,n2,n3,n4,n5五種抗體物質，其他n-5種抗體均朋性。如果n種阻抗微球表面螢光信號均陽性，說明血液中同時存在n種抗體物質。依次類推。如果要測n種抗體物質，需要n種不同電阻的微球，操作同上。上述技術方案只起示範作用，具體詳見有關技術資料。3.疾病相關核酸類物質測定測定某微生物的特異核酸片段，能夠特異診斷該微生物的存在。常規方法包括顏色編碼的免疫微球定量測定系統一次也只能完成100種左右核酸片段測定，遠遠不能滿足醫院實驗診斷未來發展的需要。發明人採用阻抗變量無限制通量免疫微球定量分析系統一次可以同時測定無數種特異核酸片段。發明人以同時測定n種(n大於1且小於正無窮)疾病相關DNA或RNA片段為例，加以說明。l)自己生產或購買n種不同阻抗的可用來化學共價鍵標記的乳膠微球。2)將乳膠微球按阻抗從小到大進行分類並編碼n種不同疾病相關DNA或RNA片段。3)制定n種不同阻抗微球編碼待測DNA或RNA片段對應表。4)自己購買或自己生產針對n種待測DNA或RNA片段的互補DNA片段。5)按照n種不同阻抗微球編碼不同疾病相關DNA或RNA片段對應表,將n種可與n種待測DNA或RNA片段特異結合的n種不同互補DNA片段，分別共價鍵結合在n種不同阻抗的微球表面，製作免疫微球，1500g離心，IO分鐘，棄去游離未標記的互補DNA片段。n種免疫微球用磷酸緩衝液充分洗滌後，按等比例混合，用磷酸緩衝液重懸，製成每升含105個微球濃度的n元阻抗微球DNA探針混合液。6)將250微升n元阻抗微球DNA探針混合液放入1毫升的EF離心管內，再加250微升血清或其他測定標本，充分混勻，37°C震蕩保溫1分鐘~12小時，使微球表面和樣品中待測DNA或RNA充分結合。7)離心管1500g離心IO分鐘，棄去上清，用磷酸緩衝液重懸，再離心，再去上清，對n元阻抗微球DNA探針混合液進行洗滌，徹底洗去離心管中游離的待測物質。8)加入含有螢光或發光標記的可與待測DNA或RNA互補序列結合的DNA片段磷酸緩衝液500毫升，37°C震蕩保溫30分鐘12小時，使它們分別與結合在微球上的待測DNA或RNA互補DNA片段充分結合，重複第5)步，對微球進行洗滌，棄去上清液。9)將微球螢光測定緩衝液重懸微球沉澱，使用能同時測定微球阻抗和微球表面螢光強度的設備，進行微球阻抗(測定項目)和微球表面螢光強度(物質含量)測定。10)結果判讀如果nl阻抗微球表面螢光陽性，說明血清nl待測DNA或RNA片段陽性，螢光強度與nl待測DNA或RNA片段濃度呈正比。釆用nl待測DNA或RNA片段標準濃度做參比測定，可對nl待測DNA或RNA片段進行準確定量。如果n種阻抗微球，只有nl,n2,n3,n4，n5等五種阻抗微球表面螢光同時陽性，說明血液內同時存在nl,n2,n3，n4,n5五種待測DNA或RNA片段，其他n-5種待測DNA或RNA片段均陰性。如果n種阻抗微球表面螢光信號均陽性，說明血液中同時存在n種待測DNA或RNA片段。依次類推。本發明技術方案也適用於生物醫學蛋白質組學中無數種待測DNA或RNA測定。如果要測n種待測DNA或RNA片段，需要n種不同電阻的微球，操作同上。上述技術方案只起示範作用，具體詳見有關技術資料。4.生物醫學科研領域應用阻抗變量無限制通量免疫微球定量分析系統具有同時測定無數種待測物質或未知物質。在人類後基因年代，人體內大量成千上萬種的DNA，RNA片段以及無數種已知抗原或抗體需要測定。人體內DNA，RNA以及抗原物質和抗體物質複雜多樣，常規方法包括顏色編碼的免疫微球定量測定系統一次也只能完成100種左右物質測定，遠遠不能滿足科研發展的需要。阻抗變量無限制通量免疫微球定量分析系統一次操作可以同時測定無數種待測物質，藉助龐大的計算機處理系統，將大大降低科研工作人員勞動強度，提高科研工作效率。7.4.1現以測定人類某種細胞內全部已知mRNA種類為例，說明阻抗變量無限制通量免疫微球定量分析系統在基因組學中的應用。1)假設該細胞基因組共有n種(n可為任意整數)基因表達，且鹼基序列明確。2)購買或自己生產n種不同阻抗可供核酸標記的乳膠微球，並設定n種不同阻抗微球分別編碼和代表n種待測mRNA。3)制定n種不同阻抗微球編碼n種不同待測mRNA對應表。4)購買或自己合成n種待測mRNA的互補鹼基序列DNA。5)按照制定n種不同阻抗微球編碼n種不同待測mRNA對應表，將購買或自己合成的n種待測mRNA的互補鹼基序列DNA片段，分別共價結合在相應n種阻抗微球表面。1500g離心10分鐘，棄去游離未標記的DNA片段，用磷酸緩衝液重懸，1500g再離心10分鐘，棄上清，保留沉澱中的免疫微球。n種不同阻抗免疫微球分別用磷酸緩衝液洗滌，按等比例混合，用含雜交緩衝液進行重懸，製成每升含105個微球濃度的n種微球DNA探針。6)取n種不同阻抗微球等體積混合均勻，製作n種不同阻抗微球DNA探針。7)取n種不同阻抗免疫微球250微升放入1毫升的EF離心管內，再加250微升細胞總RNA提取物，充分混勻，37。C震蕩保溫1分鐘20小時，使微球表面已知DNA和樣品中待測RNA充分雜交結合。8)1500g離心10分鐘，棄去上清，用磷酸緩衝液重懸，再離心，再去上清，對n種阻抗微球進行洗滌，徹底洗去離心管中未與微球表面DNA結合的游離待測RNA片段。9)加入含有螢光或發光標記的針對待測DNA或RNA互補DNA片段的雜交緩衝液500毫升，37。C震蕩保溫30分鐘1小時，使它們分別與結合在微球上的待測RNA雜交結合，重複第7)步，對微球進行徹底洗滌，棄去上清液未雜交上的游離螢光或發光物質DNA片段，保留微球沉澱。10)將微球螢光或發光測定緩衝液，重懸微球沉澱，使用能同時測定微球阻抗和微球表面螢光或發光強度的設備，進行微球阻抗(n種測定項目)和微球表面螢光強度(待測RNA含量)測定。11)結果判讀如果nl阻抗微球表面光信號陽性，說明該細胞al基因陽性表達。n2阻抗微球表面光信號陽性，表明該細胞a2基因陽性表達，依次類推。如果，nl,n2，n3,n4,n5等阻抗微球表面光信號全部陽性，表明肝細胞內al,a2，a3,a4,a5基因同時陽性表達,而其他n-5種基因表達均陰性。依次類推。如果要測更多種mRNA物質，需要更多種不同電阻的微球，操作同上。以上操作事例只起示範作用，具體詳見有關技術資料和文獻。以上方案也用於測定生物醫學研究領域無數種特異DNA片段,抗原或抗體片段。7.4.2現以測定人類正常細胞內未知mRNA為例，說明阻抗變量無限制通量免疫微球定量分析系統在基因組學中的應用。最近研究發現，人類基因雖然數量龐大，但是有艱的，而人類蛋白質的數量幾乎是無限的。由於基因轉錄後的加工和修飾等作用，編碼蛋白的信使RNA(mRNA)數量也遠遠大於基因數量。大部分mRNA和基因序列人類並不清楚，如何發現未知基因、未知mRNA和未知蛋白質是人類後基因組時代面臨的技術難題。阻抗變量無限制通量免疫微球定量分析系統同時可以檢測無數種DNA或RNA片段，為解決直接尋找未知基因提供實驗手段。發明人以尋找人類某種細胞內未知基因(mRNA)為例，說明阻抗變量無限制通量免疫微球定量分析系統在尋找未知基因中的用途。用無數種隨機探針(巳標記的已知DNA片段)在細胞cDNA文庫中，直接篩選出未知基因，目前技術均難以做到。本發明用無數種不同電阻微球，採用計算機編碼無數種待測基因，製備無數種探針，就能從理論上篩選出所有的未知基因。本發明的技術具有無限通量的特徵，正好滿足用無數個隨機探針在細胞cDNA文庫中篩選未知基因的技術要求。阻抗變量無限制通量免疫微球定量分析系統篩選未知基因的方法如下1)分無數次進行，每次生產n種(n為任意整數)不同阻抗微球，2)計算機自動將微球從阻抗數值從小到大記錄。3)每次合成n種7個以上的隨機寡核苷酸片段。4)計算機按阻抗大小排序，並分別編碼n種人工自動合成的隨機寡核苷酸片段所對應的目的基因片段。5)按照阻抗編碼對照表，將隨機合成的n種7個以上的寡核苷酸片段分別標記在n種不同阻抗的微球表面。6)通過阻抗變量無限制通量免疫微球定量分析儀，分析微球表面陽性信號，並根據阻抗數值確定未知cDNA片段。7)重複步驟l)到步驟6)，直到篩選出未知基因片段。生產不同阻抗微球，微球表面標記寡核苷酸片段，以及微球表面陽性信號及阻抗數值判斷等操作均可以自動完成。阻抗變量無限制通量免疫微球定量分析系統可用於篩選未知基因。本發明適合目前和未來生物醫學領域包括醫院、科研機構等建立在抗原抗體反應和核酸分子雜交技術上的所有項目(如ELISA項目，放射或發光免疫項目和基因檢測項目等)的測定。應用領域涉及蛋白質組學、基因組學以及各種疾病實驗診斷和療效觀察所需要測定的機體自身產生或外來的各種蛋白質、多肽和脂類和糖類物質測定。本發明的阻抗變量無限制通量免疫微球定量分析系統(阻抗變量液態生物晶片)是建立在微球表面平臺檢測技術上的一次革命，不同阻抗微球代表不同測定項目使本發明測定項目無限多，微球光信號強度代表測定物質含量，使定量準確易於質量控制。微球阻抗測定和微球表面光信號測定原理簡單，診斷試劑盒研製和實驗診斷設備開發技術成熟，是一項值得在生物醫學領域進行推廣應用的新發明。本發明及其應用滿足了生物醫學領域不斷增長的待測物質種類要求。具有快速準確，定量，易於質量控制等優點。本發明用阻抗變量微球替代顏色變量微球，使微球特徵更穩定，由於微球電阻變化信息量從理論上是無限的，從而提高晶片檢測項目的無限性，是真正意義上的生物晶片。測定微球電阻的技術比判讀微球顏色技術，要成熟和簡單，目前國內試劑和儀器開發產業，能完全滿足本發明的液態晶片技術的測定原理，完全能夠製造出測定試劑盒和相應的檢測設備，為讓全世界能夠生產出液態晶片高科技技術，打破發達國家技術壟斷，面向全世界醫療衛生行業推廣，創造條件。本發明是一種實用性的巨大創新，最大特點是1)無限通量。採用不同阻抗表示(編碼)不同測定項目，阻抗變量無限多，決定同時測定的項目無限多，保證科研和臨床需要的無限通量測定技術要求。無數種待測物質或未知物質一次操作完成。2)穩定性好。微球電阻測定技術成熟，實驗誤差小，結果精密度高。3)易於保存。生產的不同阻抗微球比不同顏色微球保存更穩定，製作工藝更簡單，來源更方便。4)靈敏度高。微球本身不帶顏色，不會干擾微球表面光信號的定量測定，極微量螢光信號就能檢測到陽性信號。5)易於生產和推廣。微球電阻及表面螢光信號測定技術成熟。見表l。表1:本發明的阻抗變量液態晶片是與美國發明的顏色變量液態晶片技術比較tableseeoriginaldocumentpage17本發明優點和用途如下:本發明的液態生物晶片與國內成熟的固態生物晶片技術、ELISA技術和放射免疫(RIA)技術比較，具有無一替代的優良品質(見表3)。主要表現在以下幾個方面l不同阻抗乳膠微球，穩定，保存時間長。2乳膠阻抗大小判讀簡單。用微孔阻抗法血球計數儀即可進行測定。在微孔兩端加一個電壓，當微球進入微孔的時候，就會產生一個電流脈衝，不同阻抗的微球產生的電流脈衝不同。3合成乳膠原料與導電物質比例不同，微球電阻從理論上可以有無數種變化，決定著本發明的電阻變量微球液態生物晶片從理論上也可以同時測定無數種待測物質。4微球表面光信號檢測技術成熟。普通流式細胞儀就可以完成對微球表面光信號的定量測定。5本發明的微球阻抗變量液態生物晶片測定所需要的設備，在機械設計和工作原理上，是細胞計數儀和流式細胞儀的結合，該設備在國內能夠完成開發和生產。表3:本發明的技術與國內成熟的技術比較tableseeoriginaldocumentpage18本發明方法操作簡單，所需技術均成熟可靠。專利轉讓對象為1.國內外診斷試劑研究和開發人員。2.國內外實驗診斷設備研究和開發人員。3.血球計數儀生產廠家。4.流式細胞分析儀生產廠家。5.乳膠合成與生產廠家。6.乳膠診斷試劑生產廠家。7.醫院檢驗科。8.醫學院校科研單位。9.計算機軟體研究與開發人員。10.綜合具備上面所有專業的單位和個人實體。圖1是含有不同導電物質濃度的微球示意圖。導電物質含量越高，電阻越小，反之亦然。圖2是雙心微球示意圖。同樣體積微球中導電核心體積越大，阻抗越小，反之亦然。圖3是不同阻抗系列免疫微球。不同電阻微球表面攜帶不同特異性抗體、抗原、DNA或RNA物質,代表不同的抗體、抗原、DNA或RNA物質。圖4是阻抗變量無限制通量免疫微球檢測方法原理示意圖。圖5是阻抗變量無限制通量免疫微球檢測裝置工作原理示意圖。圖6是阻抗變量無限制通量免疫微球軟體分析系統工作原理示意圖。Q表示微球阻抗大小，不同阻抗編碼不同待測物質。坎德拉(cd,candda)表示微球表面光信號強度，光信號強度代表待測物質含量。具體實施例實施伊J1、疾病相關抗原類測定疾病診斷和觀察療效需要測定機體內多種抗原物質。隨著對疾病發生機理的研究深入，越來越多的疾病相關抗原被發現，常規方法包括顏色編碼的免疫微球定量測定系統一次也只能完成100種左右抗原物質測定，遠遠不能滿足醫院實驗診斷未來發展的需要。發明人採用阻抗變量無限制通量免疫微球定量分析系統一次可以同時測定無數種待測抗原。發明人以同時測定B型肝炎病毒三項抗原物質(HBsAg,HBeAg,HbcAg)為例，加一說明。1)自己生產或購買不同阻抗的可用來化學共價鍵標記的乳膠微球。2)將乳膠微球分為低阻抗，中阻抗和高阻抗三種。3)自己購買或自己生產抗HBsAg,HBeAg和HbcAg三種單克隆抗體。4)將抗HBsAg,HBeAg和HbcAg三種單克隆抗體，分別共價鍵結合在低、中、高三種不同阻抗的微球表面，製作免疫微球，1500g離心，10分鐘，棄去游離未標記的抗體。三種免疫微球用磷酸緩衝液(PBS)洗滌，按等比例混合，用含抗原抗體反應PBS緩衝液進行重懸，製成每升含105個微球濃度的三元微球液態晶片。4)將250微升三元微球晶片放入1毫升的EF離心管內，再加250微升血清或其他測定標本，充分混勻，37。C震蕩保溫l分鐘2小時，使微球表面抗體和樣品中待測抗原充分5口口o5)離心管1500g離心IO分鐘，棄去上清，用PBS重懸，再離心，再去上清，對三元阻抗微球晶片進行洗滌，徹底洗去離心管中游離的待測物質。6)加入含有抗HBsAg,HBeAg和HbcAg三種單克隆抗體PBS溶液500毫升，37°C震蕩保溫30分鐘1小時，使它們分別與結合在微球上的待測物質反應，重複第5)步，對微球進行洗滌，棄去上清液。7)加入螢光標記的抗人免疫球蛋白抗體(抗抗體)500毫升，37。C震蕩保溫45分鐘，與結合在微球表面的抗體結合，重複步驟5)，徹底洗滌，留微球沉澱。8)將微球螢光測定緩衝液重懸微球沉澱，使用能同時測定微球阻抗和微球表面螢光強度的設備，進行微球阻抗(測定項目)和微球表面螢光強度(物質含量)測定。9)結果判讀:如果低阻抗微球表面螢光陽性,說明血清HBsAg陽性，螢光強度與HBsAg，濃度呈正比。採用標準HBsAg濃度做參比測定，可對HBsAg,進行準確定量。如果低阻抗和高阻抗表面螢光同時陽性，說明血液內同時存在HBsAg和HbcAg，依次類推。以上操作事例只起示範作用，具體詳見有關技術資料。如果要測n種抗原物質，需要n種不同電阻的微球，操作同上。實施伊J2、疾病相關抗體類測定測定體內某些物質的抗體，能間接說明體內感染了某些物質，疾病診斷和觀察療效需要測定機體內多種抗體物質。隨著對疾病發生機理的研究深入，越來越多的疾病相關抗體被發現，常規方法包括顏色編碼的免疫微球定量測定系統一次也只能完成100種左右抗體物質測定，遠遠不能滿足醫院實驗診斷未來發展的需要。發明人採用阻抗變量無限制通量免疫微球定量分析系統一次可以同時測定無數種待測抗體，我們以同時測定A型肝炎病毒(HAV)抗體、B型肝炎病毒(HBV)抗體和C型肝炎病毒(HCV)抗體和愛滋病病毒(HIV)抗體為例，進行說明。1)購買或自己生產4種不同阻抗(nl,n2,n3,n4)特徵的可供共價交聯抗原蛋白質的乳膠微球。2)購買或自己生產基因工程產品HAV、HBV、HCV、HIV特異抗原片段或滅活病毒蛋白顆粒。3)預設nl,n2,n3,n4阻抗乳膠微球分別代表測定HAV、HBV、HCV、HIV四種抗體。4)分別將HAV、HBV、HCV、HIV抗原片段化學共價標記在nl,n2,n3,n4四種阻抗乳膠微球表面。製作四元免疫微球，1500g離心，10分鐘，棄去游離未標記的抗原。四種免疫微球用磷酸緩衝液(PBS)洗滌，按等比例混合，用含抗原抗體反應PBS緩衝液進行重懸，製成每升含105個微球濃度的四元微球液態晶片。4)將250微升四元微球晶片放入1毫升的EF離心管內，再加250微升血清或其他測定標本，充分混勻，37°0震蕩保溫1分鐘~2小時，使微球表面抗原和樣品中待測抗體充分妙a￡口口o5)1500g離心10分鐘，棄去上清，用PBS重懸，再離心，再去上清，對四元阻抗微球晶片進行洗滌，徹底洗去離心管中游離的待測抗體。6)加入含有螢光或發光物質特異標記的HAV、HBV、HCV、HIV四種特異抗原的PBS溶液500毫升，37。C震蕩保溫30分鐘1小時，使它們分別與結合在微球上的待測抗體反應，重複第5)步，對微球進行徹底洗滌，棄去上清液，保留微球沉澱。7)將微球螢光或發光測定緩衝液，重懸微球沉澱，使用能同時測定微球阻抗和微球表面螢光或發光強度的設備，進行微球阻抗(測定項目)和微球表面螢光強度(物質含量)9)結果判讀如果nl阻抗微球表面螢光陽性，說明血清HAV抗體陽性，螢光強度與HAV抗體濃度呈正比。採用HAV抗體標準濃度做參比測定，可對HAV抗體進行準確定量。如果n2、n3和n3阻抗微球表面螢光同時陽性，說明血液內同時存在HAV抗體、HBV抗體、HCV抗體和HIV抗體，依次類推。以上操作事例只起示範作用，具體詳見有關技術資料和文獻。如果要測n種抗體物質，需要n種不同電阻的微球，操作同上。實施伊J3、疾病相關核酸類物質測定測定某微生物的特異核酸片段，能夠特異診斷該微生物的存在。常規方法包括顏色編碼的免疫微球定量測定系統一次也只能完成100種左右核酸片段測定，遠遠不能滿足醫院實驗診斷未來發展的需要。發明人採用阻抗變量無限制通量免疫微球定量分析系統一次可以同時測定無數種特異核酸片段。發明人以同時測定乳頭瘤狀病毒、衣原體、支原體特異DNA片段為例，進行說明。4)購買或自己生產不同阻抗可供核酸(DNA)標記的乳膠微球。5)設定不同阻抗(nl，n2，n3和n4)分別代表乳頭瘤狀病毒、衣原體、支原體和B肝病毒特異DNA片段測定項目。6)購買或自己合成乳頭瘤狀病毒、衣原體、支原體和B肝病毒特異DNA片段互補鹼基序列DNA。7)將乳頭瘤狀病毒、衣原體、支原體和B肝病毒特異DNA片段互補鹼基序列DNA片段，共價結合在相應阻抗微球表面，製作基因診斷微球。5)1500g離心，IO分鐘，棄去游離未標記的抗原。四種免疫微球用磷酸緩衝液(PBS)洗滌，按等比例混合，用含抗原抗體反應PBS緩衝液進行重懸，製成每升含105個微球濃度的四元微球液態晶片。4)將250微升四元微球基因晶片放入1毫升的EF離心管內，再加250微升血清或其他測定標本(如陰道分泌物與生理鹽水l:l混合)，充分混勻，37°C震蕩保溫1分鐘2小時，使微球表面已知DNA和樣品中待測DNA充分雜交結合。5)1500g離心10分鐘，棄去上清，用PBS重懸，再離心，再去上清，對四元阻抗微球基因晶片進行洗滌，徹底洗去離心管中未與乳膠表面DNA雜交上的游離待測DNA片段。6)加入含有螢光或發光物質特異標記的乳頭瘤狀病毒、衣原體、支原體和B肝病毒特異DNA片段(多元探針)的雜交緩衝液500毫升，37。C震蕩保溫30分鐘1小時，使它們分別與結合在微球上的待測DNA雜交，重複第5)步，對微球進行徹底洗滌，棄去上清液未雜交上的游離探針，保留微球沉澱。7)將微球螢光或發光測定緩衝液，重懸微球沉澱，使用能同時測定微球阻抗和微球表面螢光或發光強度的設備，進行微球阻抗(測定項目)和微球表面螢光強度(DNA含量)測定。9)結果判讀如果nl阻抗微球表面螢光陽性，說明血清人類乳頭瘤狀病毒DNA陽性，螢光強度與DNA濃度呈正比。採用人類乳頭瘤狀病毒DNA片段標準濃度做參比測定，可對人類乳頭瘤狀病毒DNA進行準確定量。如果nl、n2、n3和n4阻抗微球表面螢光同時陽性，說明血液內同時存在人類乳頭瘤狀病毒、衣原體、支原體和B肝病毒特異DNA片段，依次類推。以上操作事例只起示範作用，具體詳見有關技術資料和文獻。如果要測n種基因物質，需要n種不同電阻的微球，操作同上。以上方案也可測定特異RNA片段。實施伊j4、生物醫學科研領域應用阻抗變量無限制通量免疫微球定量分析系統具有同時測定無數種待測物質或未知物質。在人類後基因年代，人體內大量成千上萬種的DNA，RNA片段以及無數種已知抗原或抗體需要測定。人體內DNA，RNA以及抗原物質和抗體物質複雜多樣，常規方法包括顏色編碼的免疫微球定量測定系統一次也只能完成100種左右物質測定，遠遠不能滿足科研發展的需要。阻抗變量無限制通量免疫微球定量分析系統一次操作可以同時測定無數種待測物質，藉助龐大的計算機處理系統，將大大降低科研工作人員勞動強度，提高科研工作效率。現以測定人類正常肝細胞內全部已知mRNA種類為例，說明阻抗變量無限制通量免疫微球定量分析系統在肝臟基因組學中的應用。1)假設肝細胞基因組共有IOO萬個基因表達，且鹼基序列明確。2)購買或自己生產IOO萬種不同阻抗可供核酸標記的乳膠微球，並設定IOO萬種不同阻抗(nl,n2，n3….)微球分別代表100萬種待測mRNA(al，a2,a3......)。3)購買或自己合成100萬種待測mRNA的互補鹼基序列DNA。4)將購買或自己合成100萬種待測mRNA的互補鹼基序列DNA片段，共價結合在相應IOO萬種阻抗微球表面。1500g離心10分鐘，棄去游離未標記的DNA片段，用磷酸緩衝液重懸，1500g再離心10分鐘，棄上清，保留沉澱中的免疫微球。IOO萬種不同阻抗免疫微球分別用磷酸緩衝液(PBS)洗滌，按等比例混合，用含抗原抗體反應PBS緩衝液進行重懸，製成每升含105個微球濃度的IOO萬種微球診斷試劑。5)取100萬種每升含105個微球濃度不同阻抗微球等體積混合均勻，製作阻抗變量100萬通量免疫微球。6)取阻抗變量100萬通量免疫微球(每升含105個微球濃度)250微升放入1毫升的EF離心管內，再加250微升肝細胞總RNA提取物，充分混勻，37°C震蕩保溫1分鐘~2小時，使微球表面已知DNA和樣品中待測RNA充分雜交結合。7)1500g離心10分鐘，棄去上清，用磷酸緩衝液重懸，再離心，再去上清，對阻抗變量100萬通量免疫微球進行洗滌，徹底洗去離心管中未與乳膠表面DNA雜交上的游離待測RNA片段。8)加入含有100萬種螢光或發光物質特異標記的待測mRNA的互補鹼基序列DNA片段的雜交緩衝液500毫升，37。C震蕩保溫30分鐘1小時，使它們分別與結合在微球上的待測RNA雜交，重複第7)步，對微球進行徹底洗滌，棄去上清液未雜交上的游離螢光或發光物質特異標記的待測mRNA的互補鹼基序列DNA片段，保留微球沉澱。9)將微球螢光或發光測定緩衝液，重懸微球沉澱，使用能同時測定微球阻抗和微球表面螢光或發光強度的設備，進行微球阻抗(100萬種測定項目)和微球表面螢光強度(RNA含量)測定。10)結果判讀如果nl阻抗微球表面光信號陽性，說明肝細胞al基因陽性表達。n2阻抗微球表面光信號陽性，表明肝細胞a2基因陽性表達，依次類推。如果，nl，n2阻抗微球表面光信號全部陽性，表明肝細胞內al，a2基因同時陽性表達。如果，111，112,113....100萬種微球表面光信號均陽性，表明肝細胞內al,a2，a3,......等100萬種基因均陽性表達。以上操作事例只起示範作用，具體詳見有關技術資料和文獻。如果要測更多種mRNA物質，需要更多種不同電阻的微球，操作同上。以上方案也用於測定無數種特異DNA片段,抗原或抗體片段。實施伊J5、現以測定人類正常肝細胞內未知mRNA為例，說明阻抗變量無限制通量免疫微球定量分析系統在肝臟基因組學中的應用。最近研究發現，人類基因雖然數量龐大，但是有限的，而人類蛋白質的數量幾乎是無限的。由於基因轉錄後的加工和修飾等作用，編碼蛋白的信使RNA(mRNA)數量也遠遠大於基因數量。大部分mRNA和基因序列人類並不清楚，如何發現未知基因、未知mRNA和未知蛋白質是人類後基因組時代面臨的技術難題。阻抗變量無限制通量免疫微球定量分析系統同時可以檢測無數種DNA或RNA片段，為解決直接尋找未知基因提供實驗手段。發明人以尋找肝細胞內未知基因(mRNA)為例，說明阻抗變量無限制通量免疫微球定量分析系統在尋找未知基因中的用途。一般技術難以做到，用無數個隨機探針(已標記的已知DNA片段)在細胞cDNA文庫中，篩選出未知基因。對於一種隨機探針篩選出未知基因的概率無疑是"大海撈針"，但用無數種隨機探針，就能從理論上篩選出所有的未知基因。本發明的技術具有無限通量的特徵，正好滿足用無數個隨機探針在細胞cDNA文庫中篩選未知基因的技術要求。阻抗變量無限制通量免疫微球定量分析系統篩選未知基因的方法如下1)每次生產100萬不同阻抗的微球，分無數次進行。2)計算機自動將微球從阻抗數值從小到大記錄。3)每次隨機合成100萬種7個以上的寡核苷酸片段。4)計算機按阻抗大小排序並分別編碼100萬種人工自動合成的不同寡核苷酸片段所代表的目的基因片段。5)按阻抗編碼，將隨機合成的100萬種7個以上的寡核苷酸片段分別標記在100萬不同阻抗的微球表面。6)通過阻抗變量無限制通量免疫微球定量分析儀，分析微球表面陽性信號，並根據阻抗數值確定未知cDNA片段。7)重複步驟1)到步驟6)，直到篩選出未知基因片段。生產不同阻抗微球，微球表面標記寡核苷酸片段，以及微球表面陽性信號及阻抗數值判斷等操作均可以自動完成。阻抗變量無限制通量免疫微球定量分析系統可用於篩選未知基因。權利要求1、一種阻抗變量無限制通量免疫微球，包括乳膠微球，其特徵在於免疫微球含不同濃度的導電物質，包括金屬和碳粉末，導電物質和乳膠原料是按任意比例進行混合。2、如權利要求1所述阻抗變量無限制通量免疫微球，其特徵在於1)不同阻抗系列免疫微球表面共價結合不同特異性抗原、抗體或特異DNA片段，2)相同阻抗系列免疫微球表面共價結合相同特異性抗原、抗體或特異DNA片段，3)不同阻抗系列免疫微球表面共價結合的特異性抗原、抗丄本或特異DNA或RNA片段，是針對正常人或患者機體內具有診斷、判斷療效和科研價值的待測相應抗體，抗原、DNA或RNA片段。3、如權利要求1或2所述的阻抗變量無限制通量免疫微球的製備方法，其特徵在於1)將導電物質和乳膠原料按任意比例進行混合，生產出不同電阻特徵的乳膠微球，2)按不同阻抗數值或範圍的微球代表不同待測物質，制訂不同阻抗微球編碼不同待測物質對應表，3)按照不同阻抗微球代表不同待測物質對應表，將不同阻抗微球表面，標記不同的特異性抗原、抗體、特異DNA或RNA片段。4、如權利要求書3所述的不同阻抗數值或範圍的微球代表不同待測物質，其特徵在於l)待測物質為生物醫學領域，包括診斷疾病，觀察藥物療效以及科研需要的待測物質或未知物質;2)製備無數種不同阻抗微球可代表或編碼無數種不同待測物質；3)微球阻抗不同範圍系列可代表不同系列待測物質種類。5、一種如權利要求1或2所述的阻抗變量無限制通量免疫微球的檢測方法，其特徵在於l)將不同阻抗系列免疫微球與待測樣品混合，進行抗原抗體特異結合和核酸分子雜交，然後用磷酸緩衝液洗滌微球；2)將洗滌後微球與螢光或其它發光物標記的特異抗體、抗原或DNA片段，進行特異結合，使不同阻抗免疫微球表面出現螢光或發光，螢光或發光微球經離心後，再用磷酸緩衝液洗滌重新懸浮；3)洗滌後不同阻抗系列免疫螢光或發光微球，通過微球阻抗分析，以判斷檢測物質種類；4)洗滌後不同阻抗系列免疫螢光或發光微球，通過微球表面光信號強度分析，根據已知標準品濃度，計算待測物質含量。6、如權利要求5所述的檢測方法，其特徵在於將10%濃度的無數種不同阻抗系列免疫微球，放入離心管中，加入足量待測樣品或標準品，35--390C溫育，2000g離心5-8分鐘，用磷酸緩衝液洗滌2次，棄去上清液，用磷酸緩衝液重懸；再加入螢光或發光素標記的抗體、抗原或DNA片段，35—390C溫育30-60分鐘，2000g離心5-8分鐘，棄去上清液，留取離心管底部微球，用磷酸緩衝液進行重懸，再離心，再用磷酸緩衝液重懸。7、如權利要求5所述的檢測方法，其特徵在於對結合螢光或發光物質的不同阻抗系列免疫微球，經磷酸緩衝液洗滌重懸後，加入螢光或發光測定試劑，通過微球阻抗測定裝置測定其阻抗，隨後進入微球表面螢光或發光強度檢測裝置檢測螢光或發光強度；微球阻抗測定判斷待測物質種類，螢光或發光信號強度測定判斷待測物質含量。8、阻抗變量無限制通量免疫微球在生物醫學中的用途，其特徵在於利用一種同時檢測無數種不同阻抗系列免疫微球阻抗大小和微球表面螢光或發光信號強度的裝置，該裝置包括三個部分，第一部分是微球阻抗定量測定裝置，能測定通過微孔的單個微球電阻大小；第二部分是微球表面螢光或發光信號定量檢測裝置，能測定無數種不同阻抗系列單個微球表面光信號強度；第三部分是軟體分析系統，能先後接收微球阻抗信號以及該微球表面螢光或發光信號，根據不同阻抗微球編碼不同待測物質對應關係，判斷待測物質種類，根據己知標準品含量微球光信號強度，計算待測物質含量。9、如權利要求書8所述的一種同時檢測無數種不同阻抗系列免疫微球阻抗大小和微球表面螢光或發光信號強度的裝置，其特徵在於l)微球阻抗定量測定裝置，微球表面螢光或發光信號定量檢測裝置，以及軟體分析系統，是統一而不是分離的系統裝置；2)所述軟體分析系統是首先預設不同系列微球阻抗範圍編碼不同系列測定項目，不同微球阻抗數值編碼不同待測物質種類，然後根據微球阻抗值判斷待測物質，根據微球表面螢光或發光信號，以標準物做參比，計算待測物質含量，並將數據傳輸給印表機，自動列印無數種待測物質含量結果報告。10、如權利要求7所述的阻抗變量無限制通量免疫微球在生物醫學中的用途，其特徵在於可同時定量測定同一份標本中無數種用於診斷疾病,觀察藥物療效和科研的抗原類，抗體類或核酸類等待測物質或未知物質。全文摘要本發明涉及阻抗變量無限制通量免疫微球及其製備方法和檢測方法以及在生物醫學中的用途。項目採用無數種阻抗微球編碼無數種待測物質種類，即無限制通量，微球表面光信號強度代表待測物質含量，利用同時檢測微球阻抗和微球表面光信號裝置，藉助軟體分析系統，同時檢測一份樣本中無數種待測物質，滿足日益發展的臨床診斷和生物醫學科研的無限要求。項目屬於建立在免疫學反應和核酸分子雜交反應基礎上的一種新的技術平臺，是世界範圍內的生物醫學領域一次技術革命，廣泛用於診斷疾病、判斷藥物療效以及基因組學、蛋白質組學等生物醫學研究等領域。文檔編號G01N27/04GK101382539SQ20071000952公開日2009年3月11日申請日期2007年9月5日優先權日2007年9月5日發明者馮青青,皓朱,柴長春,潘小清,熊曉平,志王,王佔科,祝仲珍,群肖,瑩鍾,雷萬生申請人:王佔科