一種檢測血漿中長鏈非編碼rna的方法
2023-09-17 06:45:05
一種檢測血漿中長鏈非編碼rna的方法
【專利摘要】本發明公開了一種檢測血漿中lncRNA的方法，通過對血漿TrizolLS預處理後、氯仿和異戊醇混合液提取、異丙醇沉澱、乙醇洗滌、RNA逆轉錄和PCR檢測等步驟，TrizolLS試劑可以較好去除了血中多糖、粘蛋白等雜質，RNA降解較少，氯仿和異戊醇混合液有效解決了TrizolLS強酸條件下三氯甲烷易乳化現象，實現了對血漿中RNA進行高質量、高含量提取，對lncRNA的質量進行螢光定量RT-PCR檢測，同時可以檢驗總RNA（即cDNA）質量的參考Ct值。
【專利說明】—種檢測血漿中長鏈非編碼RNA的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及血漿中RNA提取及檢測方法，具體涉及一種檢測血漿中長鏈非編碼的方法。
【背景技術】
[0002]隨著高通量全基因組測序技術的普遍應用，人們驚奇地發現哺乳動物細胞中約98%的轉錄物為非編碼RNA分子(noncoding RNA，ncRNA)。在這些非編碼RNA分子中包括目前人們所熟知的看家(houseke印ing)非編碼RNA (如tRNA和rRNA等)、小非編碼RNA (如microRNA和piRNA等),而更多的則是尚待深入研究的長鏈非編碼RNA(long noncodingRNA, IncRNA)分子。
[0003]IncRNA是指一類轉錄本長度大於200個核苷酸(nucleotide, nt)並且不具備編碼蛋白質功能的RNA分子。這類分子一般具有高度保守的序列元件、特定的空間二級結構、剪切形式和亞細胞定位，特別是它們中的許多成員被發現具有組織或細胞特異性。這種保守性和特異性決定了 IncRNA具有廣泛的生物學功能，涉及染色體結構動態變化、端粒維持、亞細胞結構組成、基因組印跡和劑量補償效應等生命過程。正因為如此，IncRNA不再被認為是基因組轉錄的「噪音」和RNA聚合酶轉錄的副產物，而是一類具有重要生物學功能的新型非編碼RNA分子。
[0004]對於IncRNA的研究，尤其是涉及IncRNA作為腫瘤標誌物的研究，離不開各類體液(如血清、血漿)中總RNA的提取、RNA質量鑑定與目標IncRNA的定量檢測。目前血漿/血清IncRNA的提取與檢測方法如中國專利申請號為CN201010220261.6，名稱為「從人血清/血漿樣本中分離RNA方法及其PCR驗證法」就公開了操作步驟，具體包括血液加熱、蛋白酶預處理，加Trizol試劑混勻靜置，氯仿抽提，異丙醇沉澱，靜置離心，75%乙醇洗滌，離心棄上清，晾乾加入焦碳酸二乙酯處理水溶解，得到純化後的血清/血漿RNA樣本。但血漿中含有粘多糖、粘蛋白等物質，在用該Trizol法提取總RNA的過程中，由於多糖的理化性質和RNA非常相似，導致多糖和RNA可以同時沉澱下來，產生富集多糖的透明膠狀沉澱，不利於後續的cDNA合成和PCR檢測。此外，血漿中總RNA含量低，提取和檢測難度大，Trizol法提取血漿中總RNA存在操作步驟複雜、產率低、RNA易降解。截至目前仍沒有提取、檢測血漿/血清中IncRNA的完善技術方法。
【發明內容】
[0005]本發明所要解決的技術問題是提供一種檢測血漿中IncRNA的方法，該方法能去除血漿中多糖和粘蛋白等雜質的幹擾，有效解決Trizol LS中三氯甲烷乳化現象，對血漿中RNA進行高質量、高含量提取，並對提取的IncRNA進行螢光定量RT-PCR檢測。
[0006]本發明解決上述技術問題所採用的技術方案為:一種檢測血漿中長鏈非編碼RNA的方法，其步驟如下:
[0007]I).取血眾300 μ I置於第一離心管中，加入Trizol LS試劑(Trizol LS與Trizol成分相同，但濃度更高，呈強酸性，適合各種體液的總RNA提取，RNA降解較少，多糖和粘蛋白等雜質去除較多)900 μ 1，漩渦振蕩10s，室溫靜置5分鐘，4°C下，12000rpm離心10鍾，將上層液體轉移到第二離心管中；離心後樣品將分為兩層，上層為粉紅色均質化液體，下層是顏色更深的粘稠狀雜質層(多糖和粘蛋白等雜質)；
[0008]2).在第二離心管中加入0.2ml三氯甲烷/異戊醇混合液(三氯甲烷:異戊醇體積比為24:2)，漩渦振蕩10秒，室溫下靜置5分鐘後，4°C下12000rpm離心15分鐘，吸取上層水相移入第三離心管中；三氯甲烷在強酸條件下極易發生乳化現象，一般操作乳化發生率約為45%，但三氯甲烷/異戊醇混合液的乳化現象約5% ；
[0009]3).在第三離心管中加入與該上層水相等體積的異丙醇，混勻後，4°C條件下靜置20分鐘，4°C下12000rpm離心10分鐘，棄上清得沉澱；
[0010]4).在上述沉澱中加入質量百分濃度為75%的乙醇lml，顛倒洗滌，4°C下12000rpm離心5分鐘，棄上清，再用質量百分濃度75%的乙醇重複顛倒洗滌一次，4°C下12000rpm離心5分鐘，棄上清，再在4°C下12000rpm離心1分鐘，用移液器緩慢吸盡離心管中的液體，得到白色RNA沉澱，室溫條件下乾燥1分鐘,加10 μ I無RNase水溶解，反覆吹打，得到RNA提取液，_80°C保存備用；
[0011]5).用GoScript逆轉錄試劑盒對上述RNA提取液進行逆轉錄反應,得到cDNA溶液，置-20°C保存備用，逆轉錄反應具體操作依該試劑盒說明書進行；
[0012]6).用GoTaq? qPCR Master Mix檢測試劑盒對上述cDNA溶液進行螢光定量PCR
檢測，得到擴增曲線和解鏈曲線，PCR擴增的上、下遊引物分別為RMRP特異性擴增引物、AAl74084特異性擴增引物、BM709340特異性擴增弓丨物、LINCOO152特異性擴增引物或GAPDH特異性擴增引物，PCR具體操作依檢測試劑盒和螢光定量PCR儀說明書進行。
[0013]由於經過大量實踐驗證，當樣本cDNA的CteAPDH值≤32，目標IncRNA能得到較好擴增，因此，用本技術方法提取RNA(即cDNA)質量合格的參考標準是:CteAPDH值≤32。
[0014]RMRP特異性擴增引物購於上海生工生物工程股份有限公司，具體序列為5』 ACTCCAAAGTCCGCCAAGA3』 和 5』 TGCGTAACTAGAGGGAGCTGAC3 』。
[0015]AA174084特異性擴增引物購於上海生工生物工程股份有限公司，具體序列為5』 CTGGTTCTTCATCCCTGCTATG3』 和 5』 CCTGCTCCTCTTTGTGTTCTCT3』。
[0016]BM709340特異性擴增引物購於上海生工生物工程股份有限公司，具體序列為5』 TGGATGCTTACAAAGGACTGG3』 和 5』 CTGCAATTACGGAAAGAGCTG3』。
[0017]LINC00152特異性擴增引物購於上海生工生物工程股份有限公司，具體序列為5』 CTCCAGCACCTCTACCTGTTG3』 和 5』 GGACAAGGGATTAAGACACACA3 』。
[0018]GAPDH特異性擴增引物購於上海生工生物工程股份有限公司，具體序列為5』 ACCCACTCCTCCACCTTTGAC3』 和 5』 TGTTGCTGTAGCCAAATTCGTT3』。
[0019]在第二離心管中再吸取乳化層置於第四離心管中，在第四離心管中加入TrizolLS補足至1ml，混勻後併入第三離心管中。
[0020]與現有技術相比，本發明的優點在於一種檢測血漿中IncRNA的方法，通過對血漿Trizol LS預處理後、氯仿和異戊醇混合液提取、異丙醇沉澱、乙醇洗滌、RNA逆轉錄和PCR檢測等步驟，Trizol LS 試劑可以較好去除了血中多糖、粘蛋白等雜質，RNA降解較少，氯仿和異戊醇混合液有效解決了 Trizol LS強酸條件下三氯甲烷易乳化現象，實現了對血漿中RNA進行高質量、高含量提取，對IncRNA的質量進行螢光定量RT-PCR檢測，同時可以檢驗總RNA(即cDNA)質量的參考Ct值。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0021 ] 圖1為實施例1的兩個血漿/血清標本中的RMRP擴增曲線圖；
[0022]圖2為實施例1的兩個血漿/血清標本中的RMRP解鏈曲線圖。
【具體實施方式】
[0023]實施例1
[0024]一種檢測血漿中IncRNA的方法，步驟如下:
[0025]1.全血EDTA抗凝後，室溫下3000rpm離心10分鐘，取上層血漿300 μ I轉移到第一無RNase離心管中，加入Trizol LS試劑900 μ 1，漩渦振蕩10s，室溫靜置5分鐘；4°C下，12000rpm離心10鍾，樣品分為兩層，上層為粉紅色均質化液體，下層是顏色更深的粘稠狀雜質層，將上層液體(約ΙΟΟΟμΙ)轉移到第二無RNase離心管中，丟棄沉澱，以去除多糖和粘蛋白等雜質；
[0026]2.第二無RNase離心管中加入0.2ml三氯甲烷，漩渦振蕩10秒，室溫下靜置5分鐘後，4°C下，12000rpm離心15分鐘，吸取上層水相(寧少勿濫原則，一般可取到400 μ I)移入第三無RNase離心管中；
[0027]3.第三無RNase離心管中加入與上層水相等體積的異丙醇，混勻，4°C條件下靜置20分鐘後，4°C下12000rpm離心10分鐘，棄上清得沉澱；
[0028]4.在沉澱中加入質量分數為75%的乙醇Iml (-20度預冷)，顛倒數次洗滌，4°C下12000rpm離心5分鐘,棄上清,再用75%乙醇重複洗漆一次,4°C下12000rpm離心5分鐘，棄上清；再次4°C下12000rpm離心I分鐘，可見管壁殘餘液體匯集於管底，用100 μ I移液器緩慢吸除殘餘液體後，見一針尖大小半透明白色RNA沉澱，室溫條件下乾燥I分鐘，加10 μ I無RNase水溶解，反覆吹打，得到RNA提取液，_80°C保存備用；
[0029]5.用 GoScript 逆轉錄(reverse transcription, RT)試劑盒(購於美國 Promega公司)對RNA提取液進行逆轉錄反應，得到cDNA溶液，置-20°C保存備用；具體操作依該試劑盒說明書進行:在0.5ml離心管中加入9.5 μ I RNA提取液、ΙμL Oligo Primers> I μ IRandom Primers>I μ I PCR Nucleotide Mix>2 μ I MgC12>I μ I Reverse Transcriptase、4 μ I Reaction Buffer 和 0.5μ1 Ribonuclease Inhibitor ;然後在 25 °C 保溫 5 分鐘，42°C I小時，再在70°C保溫15分鐘，加入80 μ I無RNase水，就得到cDNA溶液；
[0030]6.用GoTaq? qPCR Master Mix檢測試劑盒(購於美國Promega公司)對上步的cDNA溶液進行螢光定量PCR(儀器購於美國Stratagene公司)，擴增的上、下遊引物為RMRP特異性擴增引物，具體操作依檢測試劑盒和螢光定量PCR儀說明書進行:在薄壁透明螢光定量PCR反應管中分別加入上、下遊RMRP特異性擴增引物各I μ 1，12.5 μ I GoTaq?:qPCR Master Mix, 5.5 μ I 無 RNase 水和 5 μ I cDNA ；PCR 反應條件為:95°C預變性 5 分鐘；然後94°C變性15秒，55°C退火30秒，70°C延伸30秒，共45個循環；解鏈曲線分析:95°C I分鐘，55°C 30秒；然 後緩慢升溫至95°C，升溫速率為0.2°C /秒。最後得到如附圖1所示的RMRP擴增曲線和如附圖2所示的RMRP解鏈曲線，從擴增曲線可以得到所檢測的二個血漿標本的Ct值分別為27.94和31.38，從解鏈曲線中可以了解到該曲線為較窄的單一峰，可以看出每個血漿標本的RMRP均被特異性擴增，沒有引物二聚體和雜帶的幹擾。
[0031]實施例2
[0032]與實施例1方法基本相同，所不同的只是在步驟9中，擴增的上下遊引物由AA174084特異性擴增引物代替RMRP特異性擴增引物，檢測得到血漿中AA174084表達水平的擴增曲線和解鏈曲線，從擴增曲線可以得到所檢測的二個血漿標本的Ct值分別為34.21和34.91 ;從解鏈曲線中可以了解到該曲線為較窄的單一峰，可以看出每個血漿標本的AA174084均被特異性擴增，沒有引物二聚體和雜帶的幹擾。
[0033]實施例3[0034]與實施例1方法基本相同，所不同的只是在步驟9中，擴增的上下遊引物由BM709340特異性擴增引物代替RMRP特異性擴增引物，檢測得到血漿中BM709340表達水平的擴增曲線和解鏈曲線，從擴增曲線可以得到所檢測的二個血漿標本的Ct值分別為27.87和30.46 ;從解鏈曲線中可以了解到該曲線為較窄的單一峰，可以看出每個血漿標本的BM709340均被特異性擴增，沒有引物二聚體和雜帶的幹擾。
[0035]實施例4
[0036]與實施例1方法基本相同，所不同的只是在步驟9中，擴增的上下遊引物由LINC001520特異性擴增引物代替RMRP特異性擴增引物，檢測得到血漿中LINC00152表達水平的擴增曲線和解鏈曲線，從擴增曲線可以得到所檢測的二個血漿標本的Ct值分別為29.43和26.15 ;從解鏈曲線中可以了解到該曲線為較窄的單一峰，可以看出每個血漿標本的LINC00152均被特異性擴增，沒有引物二聚體和雜帶的幹擾。
[0037]實施例5
[0038]與實施例1方法基本相同，所不同的只是在步驟9中，擴增的上下遊引物由GAPDH特異性擴增引物代替RMRP特異性擴增引物，檢測得到血漿中GAPDH表達水平的擴增曲線和解鏈曲線，從擴增曲線可以得到所檢測的二個血漿標本的Ct值分別為29.93和26.15 ;從解鏈曲線中可以了解到該曲線為較窄的單一峰，可以看出每個血漿標本的GAPDH均被特異性擴增，沒有引物二聚體和雜帶的幹擾。本例樣本cDNA的CteAPDH值≤32, RNA (即cDNA)質量合格。
[0039]實施例6
[0040]利用同一個體血漿標本中IncRNA和GAPDH的Ct值，就可根據公式Λ Ct =CtincENA-CtGAPDH計算出該IncRNA的Δ Ct值,根據Δ Ct值的大小就可判斷該IncRNA的相對表達水平；Λ Ct值小者，其對應IncRNA的表達水平高；而Λ Ct值大者，其對應IncRNA的表達水平低。
[0041]實施例7
[0042]與實施例1方法基本相同，所不同的只是在第二離心管中發生乳化，採取補救操作，即:將白色乳化層轉移到一新無RNase離心管中，再加入Trizol LS補足至lml，混勻後併入第三離心管中，擴增的上下遊引物由GAPDH特異性擴增引物代替RMRP特異性擴增引物，檢測得到血漿中GAPDH表達水平的擴增曲線和解鏈曲線，從擴增曲線可以得到所檢測的二個血漿標本的Ct值分別為29.17和30.84。從GAPDH的Ct值可以看出上述乳化補救操作並不影響RNA質量和產率。從解鏈曲線中可以了解到該曲線為較窄的單一峰，可以看出每個血漿標本的GAPDH均被特異性擴增，沒有引物二聚體和雜帶的幹擾。本例樣本cDNA的CteAPDH值≤32，RNA (即cDNA)質量合格。
[0043]上述實施例中 RMRP、AA174084、BM709340 和 LINC001520 也可以用其它 IncRNA 特異性擴增引物代替，在此不一一列舉；本發明建立了檢測血漿或血清中IncRNA水平的方法，為研究IncRNA功能提 供了依據。
【權利要求】
1.一種檢測血漿中長鏈非編碼RNA的方法，其特徵在於步驟如下: 0.取血漿300 μ I置於第一離心管中，加入Trizol LS試劑900 μ 1，漩渦振蕩10s，室溫靜置5分鐘，4°C下，12000rpm離心10鍾，將上層液體轉移到第二離心管中； 2).在第二離心管中加入0.2ml三氯甲烷/異戊醇混合液，所述三氯甲烷/異戊醇混合液中三氯甲烷:異戊醇體積比為24:2，漩渦振蕩10秒，室溫下靜置5分鐘後，4°C下12000rpm離心15分鐘，吸取上層水相移入第三離心管中； 3).在第三離心管中加入與該上層水相等體積的異丙醇，混勻後，4°C條件下靜置20分鐘，4°C下12000rpm離心10分鐘，棄上清得沉澱； 4).在上述沉澱中加入質量百分濃度為75%的乙醇1ml，顛倒洗滌，4°C下12000rpm離心5分鐘，棄上清，再用質量百分濃度75%的乙醇重複顛倒洗滌一次，4°C下12000rpm離心5分鐘，棄上清，再在4°C下12000rpm離心I分鐘，用移液器緩慢吸盡離心管中的液體，得到白色RNA沉澱，室溫條件下乾燥I分鐘，加10 μ I無RNase水溶解，反覆吹打，得到RNA提取液，_80°C保存備用； 5).用GoScript逆轉錄試劑盒對上述RNA提取液進行逆轉錄反應,得到cDNA溶液，置-20°C保存備用，逆轉錄反應具體操作依該試劑盒說明書進行； 6).用GoTaq?qPCRMaster Mix檢測試劑盒對上述cDNA溶液進行螢光定量PCR檢測，得到擴增曲線和解鏈曲線，PC R擴增的上、下遊弓丨物分別為RMRP特異性擴增引物、AA174084特異性擴增引物、BM709340特異性擴增引物、LINCOO152特異性擴增引物或GAPDH特異性擴增引物，PCR具體操作依檢測試劑盒和螢光定量PCR儀說明書進行。
2.如權利要求1所述的一種檢測血漿中長鏈非編碼RNA的方法，其特徵在於所述的RMRP特異性擴增引物的核苷酸序列為ACTCCAAAGT CCGCCAAGA和TGCGTAACTA GAGGGAGCTGAC ； AA174084特異性擴增引物的核苷酸序列為CTGGTTCTTC ATCCCTGCTA TG和CCTGCTCCTCTTTGTGTTCT CT ； BM709340特異性擴增引物的核苷酸序列為TGGATGCTTA CAAAGGACTG G和CTGCAATTACGGAAAGAGCT G ； LINC00152特異性擴增引物的核苷酸序列為CTCCAGCACC TCTACCTGTT G和GGACAAGGGATTAAGACACA CA ； GAPDH特異性擴增引物的核苷酸序列為ACCCACTCCT CCACCTTTGA C和TGTTGCTGTAGCCAAATTCG TT。
3.如權利要求1所述的一種檢測血漿中長鏈非編碼RNA的方法，其特徵在於在第二離心管中再吸取乳化層置於第四離心管中，在第四離心管中加入Trizol LS補足至1ml，混勻後併入第三離心管中。
【文檔編號】C12Q1/68GK103966311SQ201410075943
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年3月4日 優先權日:2014年3月4日
【發明者】郭俊明, 邵永富, 肖丙秀 申請人:寧波大學