使植物具有除草劑抗性的水稻ALS突變型蛋白及其應用的製作方法
2023-09-17 00:15:15 2
本發明屬於植物蛋白和植物抗除草劑領域，涉及使植物具有除草劑抗性的水稻als突變型蛋白、基因及其應用；具體而言，本發明涉及水稻的乙醯乳酸合成酶(als)突變蛋白，該蛋白能賦予植物尤其水稻抗乙醯乳酸合成酶抑制劑類除草劑的特性。本發明公開了該蛋白的序列，以及它們在植物抗除草劑領域中的應用。
背景技術：
雜草是制約農業生產穩產高產的不利因素。與傳統依靠栽培措施、人工除草和機械除草等方法相比，化學除草劑的使用是一種高效的、簡便的和經濟的治理雜草方法。
植物和微生物支鏈胺基酸(纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸)的生物合成需要4種酶共同催化作用，乙醯乳酸合成酶(acetolactatesynthase，als)、酮醇還原異構酶(ketol-acidreductoisomerase)、二羥基酸脫水酶(dihydroxyaviddehydratase)、支鏈胺基酸轉氨酶(branched-chainaminoacidtransaminase)。乙醯乳酸合成酶是生物合成過程中第一階段的關鍵酶，在纈氨酸和亮氨酸的合成中催化2分子丙酮酸生成乙醯乳酸和二氧化碳，在異亮氨酸的合成中催化1分子丙酮酸與1分子α丁酮酸生成2-乙醛基-2-羥基丁酸和二氧化碳。als抑制劑類除草劑通過抑制植物體內的als酶活性，從而阻止支鏈胺基酸的合成，導致蛋白質的合成受到破壞，阻礙細胞分裂期的dna合成，從而使植物細胞的有絲分裂停止在gl階段的s期(dna合成期)和g2階段的m期，幹擾了dna的合成，細胞因此不能完成有絲分裂，進而使植物停止生長，最終導致植物個體死亡。
乙醯乳酸合成酶(als)(也稱乙醯羥酸合成酶，ahas；ec4.1.3.18)抑制劑類除草劑以als作為靶標而導致雜草死亡，主要包括磺醯脲類(sulfonylureas,su)、咪唑啉酮類(imidazolinones,imi)、三唑嘧啶類(triazolopyrimidines,tp)、嘧啶氧(硫)苯甲酸類[pyrimidinylthio(oroxy)–benzoates,ptb；pyrimidinyl-carboxyherbicides；pcs]和磺醯胺基羰基三唑啉酮類(sulfonylamino-carbonyltriazolinones,sct)等13類化合物。乙醯乳酸合成酶，存在於植物生長過程中，它能以高度專一性和極高的催化效率催化丙酮酸為乙醯乳酸，從而導致支鏈胺基酸的生物合成。
als抑制劑類除草劑具有選擇性強、殺草譜廣、低毒高效等特點，目前已大面積推廣使用。但這些除草劑對一般不具有抗(耐)除草劑特性的農作物本身也產生藥害，極大限制了其使用時間和使用空間，如需要在農作物播種前一段時間使用除草劑才能避免農作物遭受藥害。培育抗(耐)除草劑作物品種可減少作物藥害、拓寬除草劑的使用範圍。
目前，水稻已知的抗als抑制劑突變位點包括gly95、ala96、ala122、trp548、ser627、ser653和gly654。als突變體抗除草劑水平與als胺基酸突變的位置有關，還與突變後的胺基酸種類及突變胺基酸的數目有關。
目前，als抑制劑類除草劑的作用機理尚未確定，很難提前預測als蛋白其它胺基酸位點的突變是否會產生除草劑抗性，只能依賴於科研人員長期、艱苦的實踐探索，並憑藉一些運氣才可能發現als蛋白新的除草劑抗性位點。
技術實現要素：
發明目的：本發明所要解決的第一個技術問題是提供使植物具有除草劑抗性的蛋白。
本發明還要解決的技術問題是提供了編碼該蛋白的核酸以及表達盒、載體和細胞等。
本發明還要解決的技術問題是提供了獲得具有除草劑抗性的植物的方法和應用。
本發明還要解決的技術問題是提供了判斷植物是否採用本發明方法獲得的鑑定方法。
本發明人通過長期、艱苦的研究，對野生型水稻為秈型常規水稻種子合肥不育系的ems突變植株進行長期、不斷地篩選，發現了一系列als突變蛋白，包括前文所述的某些已知als突變蛋白和新als突變蛋白，其對als抑制劑類除草劑不敏感，從而使得植物具有als抑制劑類除草劑抗性。本發明在植物育種中的應用，可用於培育具有除草劑抗性的植物，尤其是農作物，還開發了這些蛋白及其編碼基因在轉基因或者非轉基因如水稻等作物中的應用。
技術方案：為解決上述技術問題，本發明採用的技術方案如下：本發明提供了使得植物具有除草劑抗性的als蛋白，其在胺基酸序列的第171位胺基酸由脯氨酸變為組氨酸，第350位胺基酸由天冬氨酸突變為穀氨酸。目前還沒有報導表明，在來自水稻品種合肥不育系als蛋白的pro171和asp350位點同時突變的突變株。
優選本發明的第一方面的蛋白帶有pro171和asp350位點同時突變的突變株，除了本發明具有的實施方式所述的突變植株篩選或擴增方法之外，在蛋白質序列已知的情形下，本領域技術人員有能力通過改變已知蛋白質的編碼基因序列並將其導入載體，就可以製備出取代、添加或缺失了胺基酸殘基的蛋白質，這些方法均為常規手段。在本發明的具體實施方式中，本發明的具有除草劑抗性的als蛋白的胺基酸序列如seqidno:2所示。該蛋白經過證實對咪唑啉酮類除草劑不敏感的乙醯乳酸合成酶。
本發明的第二方面提供了核酸，其編碼本發明第一方面的蛋白質。在本發明中，核酸可以是dna、rna，其中優選為dna。在知曉所編碼蛋白序列或核酸序列的前提下，通過常規的密碼子對應關係和宿主表達頻率，運用pcr方法、dna重組法或人工合成的方法，本領域技術人員有能力獲得並優化編碼本發明第一方面的蛋白質的核酸。一旦獲得該核酸，就可以將其克隆入載體，再轉化或轉染入相應的細胞，然後通過常規的宿主細胞進行增殖，從中分離得到大量的核酸。優選本發明第二方面的核酸的核苷酸序列如seqidno：1所示。具體的，本發明的dna序列，是在野生型水稻為秈型常規水稻種子合肥不育系的als基因序列的第512位核苷酸由c變成核苷酸a、第1050位核苷酸由t變成核苷酸a。
此外，本發明突變前的野生型水稻為秈型常規水稻種子合肥不育系，該als抑制劑類除草劑敏感的野生型合肥不育系水稻als的核苷酸序列如seqidno.3所示，胺基酸如seqidno.4所示。
本發明的第三方面的內容包括表達盒、重組載體或細胞，其含有上述的第二方面的核酸。
本發明第四方面內容還包括上述的具有除草劑抗性的als蛋白、核酸、表達盒、重組載體或細胞在綠色植物抗除草劑方面的應用。
其中，上述綠色植物為水稻、菸草、擬南芥、棉花等。
本發明第五方面的內容還包括獲得具有除草劑抗性的植物的方法，包括如下步驟：
1)使植物包含本發明所述的核酸；或
2)使植物表達所述的蛋白。
其中，上述的方法，包括轉基因、雜交、回交或無性繁殖步驟。
本發明第六方面的內容包括鑑定植物的方法，其中植物是包含所述的核酸的植物、表達所述的蛋白的植物或所述的方法獲得的植物，具體包括以下步驟：
1)測定所述植物是否包含所述的核酸；或，
2)測定所述植物是否表達所述的蛋白。
有益效果：與現有技術相比，本發明具有以下優點：
1)本發明通過田間噴施als抑制劑類除草劑「百壟通」的實驗結果表明，含有本發明的具有除草劑抗性的als蛋白的水稻3-4葉幼苗在施用3.3ml百壟通/l水(10倍推薦使用濃度)後，植株仍然正常生長發育和結實，而野生型水稻3-4葉幼苗在施用1ml百壟通/3l水(1倍推薦使用濃度)30天後表現為整株死亡。
2)本發明的含有合肥不育系抗除草劑突變體的als基因的轉基因水稻als酶活性比野生型的als酶活高4.7倍，本發明的含有合肥不育系抗除草劑突變體的als基因的轉基因菸草後代植株的als酶活性比野生型的als酶活高5.2倍。
3)本發明的合肥不育系突變體與專利號201610226003.6中cgmccno.12265的抗除草劑突變體植株進行als酶活進行測定，發現本專利申請中的合肥不育系突變體als酶活性比cgmccno.12265高18％。
附圖說明
圖1百壟通除草劑篩選獲得的抗性水稻突變體；
圖2pcr擴增als基因結果圖；第1泳道為marker；marker分子量從上到下依次為5kb、3kb、2kb、1kb、750bp、500bp、250bp、100bp，第2泳道為合肥不育系野生型水稻dna，第3泳道為抗除草劑突變體的dna，目的片段長度2091bp；
圖3百壟通除草劑對野生型和抗除草劑突變體的als酶活性抑制的吸光值測定；
圖4抗除草劑突變體的als基因的過量表達載體bamhi/saci雙酶切驗證圖；第1泳道為marker；marker分子量從上到下依次為5kb、3kb、2kb、1kb、750bp、500bp、250bp、100bp；第2泳道為未經酶切的重組載體，第3泳道為重組載體經bamhi/saci雙酶切後產生的基因片段和質粒片段dna，基因片段大小符合預期，證明載體構建成功；
圖5突變型als基因水稻pcr檢測圖；總共有8個泳道，第1泳道為marker；marker分子量從上到下依次為3kb、2kb、1kb、750bp、500bp、250bp；第2泳道為非轉基因野生型dna，作為陰性對照，第3泳道為含有als突變序列的質粒dna為模板，作為陽性對照，第4～6泳道為轉化抗除草劑突變體als基因的轉基因植株dna。
圖6百壟通除草劑對野生型水稻和含有抗除草劑突變體als基因的轉基因水稻的als酶活性抑制的吸光值測定；
圖7百壟通除草劑對野生型菸草和含有抗除草劑突變體als基因的轉基因菸草的als酶活性抑制的吸光值測定。
圖8百壟通除草劑對雜交後代中的雜合植株、抗除草劑突變體和cgmccno.12265的als酶活性抑制的吸光值測定。
具體實施方式
下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用於說明本發明，而不應視為限定本發明的範圍。實施例中未註明具體條件者，按照常規條件或製造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未註明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。
實施例1：水稻抗咪唑啉酮類除草劑突變體獲取過程(百壟通)
將秈型常規水稻種子合肥不育系(購自江蘇省農業種質資源保護與利用平臺)(此為m0，用清水浸泡2小時)150kg分6次用0.5-1.0％(w/w)甲磺酸乙酯(ems)室溫下浸泡6-9小時，期間每1小時搖動一次種子；棄去ems溶液，自來水翻動浸泡種子5次，每次5分鐘，然後用自來水衝洗種子過夜，次日進行田間播種，並進行常規肥水管理(此為m1)。植株成熟後，種子混收、晾乾，過冬保存。次年播種田間。待水稻(此為m2)幼苗長至3-4葉期時，噴施為3.3ml百壟通/l水(「百壟通」是德國巴斯夫公司生產一種水劑型咪唑啉酮類除草劑，推薦最低使用濃度為1ml百壟通/1.5～3l水)，30天後還呈正常綠色植株即為抗咪唑啉酮類除草劑的水稻突變體(圖1)。共計獲得抗除草劑的m2單株128株，這些抗性單株進行常規肥水管理，有101個m2單株可正常結實，種子成熟後，單株收種、晾乾，過冬保存。
實施例2：抗咪唑啉酮類除草劑水稻突變體突變位點分析
取上述實施例1獲得的抗除草劑水稻突變植株選取突變體植株葉片，提取基因組dna，送南京一道生物科技有限公司進行基因組測序。測序結果與合肥不育系野生型als基因比較，發現抗除草劑水稻突變體在als基因上發生了2個位點的突變，第512、1050位點鹼基發生突變，分別由c變成a、t變成a，導致其相應編碼的胺基酸序列的第171、350位點由脯氨酸變為組氨酸、天冬醯胺變為穀氨酸，即抗除草劑突變體的als基因的核苷酸序列如seqidno.1所示，其編碼的als蛋白的胺基酸序列如seqidno.2所示。
本發明的抗除草劑水稻突變體其分類命名為水稻種子hf-407(oryzasativaindicagrouphf-407)，該菌株已於2017年6月2日保藏於中國典型培養物保藏中心(cctcc)，地址：湖北省武漢市武昌區武漢大學保藏中心(武漢大學第一附屬小學對面)，郵編：430072，保藏編號為cctccno：p201714。
實施例3：抗咪唑啉酮類除草劑水稻突變體als基因克隆
取上述抗除草劑水稻突變體提取基因組dna。根據合肥不育系野生型als基因序列設計擴增als基因全長的特異引物為：正向引物
f5』-tcgcccaaacccagaaaccc-3』、反向引物r5』-
ctctttatgggtcattcaggtc-3』。
採用takaraprimerstarmaxdnapolymerase聚合酶(購自takara公司)擴增als基因，其反應體系如下：
pcr擴增反應程序採用兩步法，退火和延伸合為一起，採用68度。程序如下：預變性：98℃3min；35個循環：變性98℃10sec；延伸68℃1min；保溫：72℃10min。
取2μlpcr產物經1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，發現有預期大小的片段後(圖2)，剩餘的pcr產物經pcr清潔試劑盒(購自axygen公司)清潔回收後，克隆至pmd19-t載體(購自takara公司)，然後轉化大腸桿菌。每個轉化隨機挑取12個大腸桿菌單克隆進行pcr檢測，取pcr結果呈陽性的6個單克隆，送南京一道生物科技有限公司測序，獲得突變als基因序列，該基因片段長度為2091bp，抗除草劑水稻突變體1als基因片段的測序結果如下：
ctgcatcgcgtgtcgccctttcgcccaaacccagaaaccctcgccgccgccgccgccgccatcacccaccatggctacgaccgccgcggccgcggccgccaccttgtccgccgccgcgacggccaagaccggccgtaagaaccaccagcgacaccacgtccttcccgctcgaggccgggtgggggcggcggcggtcaggtgctcggcggtgtccccggtcaccccgccgtccccggcgccgccggccacgccgctccggccgtgggggacggccgagccccgcaagggcgcggacatcctcgtggaggcgctggagcggtgcggcgtcagcgacgtgttcgcctacccgggcggcgcgtccatggagatccaccaggcgctgacgcgctccccggtcatcaccaaccacctcttccgccacgagcagggcgaggcgttcgcggcgtccgggtacgcgcgcgcgtccggccgcgtcggggtctgcgtcgccacctccggccccggggcaaccaacctcgtgtccgcgctcgccgacgcgctgctcgactccgtcccgatggtcgccatcacgggccaggtcacccgccgcatgatcggcaccgacgccttccaggagacgcccatagtcgaggtcacccgctccatcaccaagcacaattaccttgtccttgatgtggaggacatcccccgcgtcatacaggaagccttcttcctcgcgtcctcgggccgtcctggcccggtgctggtcgacatccccaaggacatccagcagcagatggctgtgccagtctgggacacctcgatgaatctaccggggtacattgcacgcctgcccaagccacccgcgacagaattgcttgagcaggtcttgcgtctggttggcgagtcacggcgcccgattctctatgtcggtggtggctgctctgcatctggtgatgaattgcgccggtttgttgagctgaccggcatcccagttacaaccactctgatgggcctcggcaatttccccagtgatgatccgttgtccctgcgcatgcttgggatgcatggcacggtgtacgcaaattatgcggtggataaggctgacctgttgcttgcatttggcgtgcggtttgatgaacgtgtgacagggaaaattgaggcttttgcaagcagggccaagattgtgcacattgacattgatccagcggagattggaaagaacaagcaaccacatgtgtcaatttgcgcagatgttaagcttgctttacagggcttgaatgctctgctagaccagagcacaacaaagacaagttctgattttagtgcatggcacaatgagttggaccagcagaagagggagtttcctctggggtacaagacttttggtgaagagatcccaccgcaatatgctattcaggtgctggatgagctgacgaaaggggaggcaatcatcgctactggtgttggacagcaccagatgtgggcggcacaatattacacctacaagcggccacggcagtggctgtcttcggctggtctgggcgcaatgggatttgggctgcctgctgcagctggtgcttctgtggctaacccaggtgtcacagttgttgatattgatggggatggtagcttcctcatgaacattcaggagttggcattgatccgcattgagaacctcccggtgaaggtgatggtgttgaacaaccaacatttgggtatggttgtgcaatgggaggataggttttacaaggcaaatagggcgcatacatacttgggcaacccagaatgtgagagcgagatatatccagattttgtgactattgctaaagggttcaatattcctgcagtccgtgtaacaaagaagagtgaagtccgtgccgccatcaagaagatgctcgagaccccagggccatacttgttggatatcatcgtcccacaccaggagcatgtgctgcctatgatcccaagtgggggcgcattcaaggacatgatcctggatggtgatggcaggactatgtattaatctataatctgtatgttggcaaagcaccagcccggcctatgtttgacctgaatgacccataaagagaagggcgacacgcgatgcag
實施例4：水稻m3突變體抗咪唑啉酮類除草劑(百壟通)
將合肥不育系抗除草劑突變體收穫的種子播種出苗(此為m3)，待m3水稻幼苗長至3-4葉期時，噴施3.3ml百壟通/l水(推薦最低使用濃度為1ml百壟通/3l水，相當於10倍濃度)。噴施除草劑15天後，抗性苗m3呈正常綠色、能繼續長高至20-30cm，而非抗性苗葉片失去綠色甚至部分枯黃，植株不長高，只有5-9cm。30天後，m3抗性株均呈正常綠色植株，而噴施同樣濃度除草劑的野生型水稻都已全部枯死，表明水稻突變體至少抗10倍濃度的百壟通除草劑。
實施例5：水稻m3抗除草劑突變體的als酶活測定
為了驗證水稻突變體的除草劑抗性是否由als突變所致，本發明人進行了als酶活性測定。測定方法參照singh等的方法(singhb.k.,stidhamm.a.,shanerd.l.assayofacetohydroxyacidsynthase.analyticalbiochemistry,1988,171:173-179.)。具體的，分別取野生型、合肥不育系抗除草劑突變體的m3植株葉片0.2g，在研缽中用液氮研磨粉碎，加入2ml提取液(100mmk2hpo4，ph7.5、10mm丙酮酸鈉、5mmedta、1mm纈氨酸、1mm亮氨酸、10mm半胱氨酸、0.1mm黃素腺嘌呤二核苷酸、5mm氯化鎂、10％(v/v)甘油、1％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮)，待提取液解凍後繼續研磨1min左右。12000rpm、4℃離心30min，吸取上清液，加入硫酸銨使之達到50％飽和度，於冰上放置半小時，12000rpm、4℃離心30min，棄上清，將沉澱溶解於0.2ml反應緩衝液(100mmk2hpo4,ph7.0、1mmedta、10mm氯化鎂、100mm丙酮酸鈉、1mm焦磷酸硫胺素、0.1mm黃素腺嘌呤二核苷酸)，分別得各植株的als提取液。
在獲得als提取液中分別加入10μl除草劑「百壟通」(水劑，有效成分240g/l)，混勻，37℃孵育1h，加0.1ml3m硫酸終止反應，反應混合物在60℃反應孵育30分鐘便於脫羧。然後加0.4ml顯色液(0.09g/l1-萘酚和0.009g/l肌酸，用2.5mnaoh溶解)。混合液在37℃孵育30分鐘進行顯色(als催化2個丙酮酸形成乙醯乳酸，乙醯乳酸脫羧形成3-羥基丁酮，再與肌酸和1-萘酚形成粉紅色複合物，該複合物在530nm處有最大吸收值)，隨後測定其530nm的吸光度，als活性用a530吸光值表示，a530吸光值的高低反映als活性的高低。實驗以水為對照，野生型、合肥不育系抗除草劑突變體各測5個單株。
a530吸光值測定結果發現，當野生型、合肥不育系抗除草劑突變體的als提取液中沒有als抑制劑百壟通時，它們的a530吸光值均在1.2-1.4間，表明野生型和突變體的als酶活性無顯著性差異(圖3)；而加入als抑制劑百壟通後，野生型的a530吸光值僅為0.25，合肥不育系抗除草劑突變體的a530吸光值為1.21，即野生型的als酶活性僅為對照的18.9％，而合肥不育系抗除草劑突變體的als酶活性仍有89％以上(圖3)，表明合肥不育系抗除草劑突變體的als對百壟通不敏感，從而賦予了抗性。
實施例6：轉基因als水稻抗百壟通
設計特異引物5』-cgcggatccatccgagccacacatcgcctc-3』和5』-tccccgcggcctacggaaaacaacacac-3』，其5』分別加入bamhi和saci酶切修飾位點。參考實施例3的方法，通過pcr從上述水稻突變體合肥不育系抗除草劑突變體的基因組dna中擴增出突變als基因，測序正確後，用bamhi和saci分別雙酶切突變als基因片段和植物表達載體pcambia1301質粒(購自pcambia公司)，酶切產物用t4-dna酶(購自takara公司)連接，連接產物轉化大腸桿菌。重組質粒提取dna，用bamhi和saci雙酶切驗證，可以產生大的質粒片段和小的基因片段(圖4)，證明已將核苷酸序列如seqidno.1所示的als基因克隆至植物表達載體pcambia1301質粒(購自pcambia公司)中。將構建好的質粒載體轉化農桿菌eha105，培養菌體。採用常規的農桿菌介導法轉化粳型水稻日本晴(購自江蘇省農業種質資源保護與利用平臺)，獲得轉基因植株收種後，後代植株長至3-4葉期時，pcr檢測轉基因植株(圖5)。pcr檢測引物為正向引物35sf5』-atggttagagaggcttacgc-3』，反向引物5r5』-agcaacaggtcagccttatccac-3』，擴增片段涵括camv35s啟動子和als基因的5』端序列，大小約2kb。pcr擴增反應體系參考實施例3，pcr擴增反應程序採用兩步法，退火和延伸合為一起，採用68度。擴增程序如下：預變性：98℃3min；30個循環：變性98℃10sec；延伸68℃2min；保溫：72℃10min。經pcr鑑定呈陽性後，噴施3.3ml百壟通/l水(10倍推薦使用濃度)，7天後，參照實施例6所述方法測定als酶活性，發現轉基因水稻的als酶活性顯著高於非轉基因水稻；30天後發現轉基因水稻生長狀態良好，而非轉基因日本晴水稻則全部枯死。比較轉化合肥不育系抗除草劑突變體的als基因的轉基因水稻後代植株的als酶活性，發現含有合肥不育系抗除草劑突變體的als基因的轉基因植株als酶活性比野生型的als酶活高4.7倍(圖6)。
實施例7：轉基因als菸草抗百壟通
設計特異引物5』-cgcggatccatccgagccacacatcgcctc-3』和5』-tccccgcggcctacggaaaacaacacac-3』，其5』分別加入bamhi和saci酶切修飾位點。通過pcr從合肥不育系抗除草劑突變體的基因組dna中擴增出突變als基因，測序正確後，參照實施例7方法將核苷酸序列如seqidno.1所示的als基因克隆至植物表達載體pcambia2301質粒(購自pcambia公司)中。挑選陽性克隆轉化農桿菌eha105，採用常規的農桿菌介導法轉化本氏菸葉盤，獲得轉基因植株收種後，後代植株長至3-4葉期時，經pcr鑑定呈陽性後，噴施3.3ml百壟通/l水(10倍推薦使用濃度)，7天後，參照實施例6所述方法測定als酶活性，發現轉基因菸草的als酶活性顯著高於非轉基因菸草；30天後發現轉基因菸草生長狀態良好，而非轉基因菸草則全部枯死。比較轉化合肥不育系抗除草劑突變體的als基因的轉基因菸草後代植株的als酶活性，發現含有合肥不育系抗除草劑突變體的als基因的轉基因植株als酶活性比野生型的als酶活高5.2倍(圖7)。
實施例8：抗性材料的比較和鑑定
為了檢測是否具有本專利中提到的2個突變位點的抗性植株比之前專利申請(201610226003.6)中提到的抗性植株的除草耐受能力更強，我們將實施例2中的合肥不育系突變體與專利號201610226003.6中cgmccno.12265的抗除草劑突變體植株進行als酶活進行測定，發現本發明中的合肥不育系突變體als酶活性比cgmccno.12265高18％(圖8)。
儘管本發明的具體實施方式已經得到詳細描述，本領域技術人員將會理解。根據已經公開的所有教導，可以對那些細節進行各種修改和替換，這些均在本發明的保護範圍內。本發明的全部範圍由所附權利要求及其任何等同物給出。
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江蘇省農業科學院
使植物具有除草劑抗性的水稻als突變型蛋白及其應用
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