溶解血小板栓塊的基因工程製劑的製備方法及其應用的製作方法
2023-09-17 00:13:10 2
專利名稱：溶解血小板栓塊的基因工程製劑的製備方法及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及用基因工程方法生產一種能夠快速溶解動脈血栓團塊中血小板成分的基因工程抗體及重組蛋白以及其在疾病治療中的應用。
背景技術：
抗血小板整合素β 3亞基第49-66表位(GPIIIa49-66)抗體是從「愛滋病感染相關性血小板減少症病人」的血液免疫循環複合物中分離獲得的一種特殊的自身抗體(命名為GP49)。這種抗體非常獨特，它與血小板整合素GPIIIa49-66表位結合後，可誘導血小板內產生反應性氧自由基(R0S)，從而啟動補體-非依賴性「血小板氧化破碎」這一全新的血小板死亡途徑。因此利用GPIIIa49-66抗體及其天然配體溶解血栓團塊中的血小板成分將代表一種全新而有巨大治療價值的溶栓策略。儘管如此，以血小板整合素 GPIIIa49-66為靶點的新型溶栓體系還有待進一步建立及完善。首先，由於人和小鼠的血小板GPIIIa49-66胺基酸序列具有高度同源性(83%)，因此鼠源性抗GPIIIa49-66單克隆抗體至今無法獲得。目前的Anti-GPIIIa49-66抗體多為兔源性多克隆抗體。雖然體外實驗證實它們與從病人體內親和純化的抗GPIIIa49-66抗體具有類似的誘導血小板栓塊氧化破碎的效應，但多克隆抗體分子間存在異質性，特異性較差，溶栓效果不穩定。更為重要的是， 兔源性多抗無法直接用於臨床動脈血栓疾病的治療。因此，製備人源性的抗GPIIIa49-66 抗體單克隆抗體及GPIIIa49-66的天然配體對於上述疾病的治療具有重要意義。本發明首次公開了一種抗血小板整合素GPIIIa49-66表位人源性單克隆抗體(All)及其天然配體 (AD18C)製備方法及應用。
發明內容
本發明的目的是通過基因工程技術製備抗血小板整合素GPIIIa49-66表位的基因工程抗體及重組蛋白。新型抗體及重組蛋白是完全人源化的，可靶向性溶解動脈血栓團塊中血小板成分，適用於腦卒中、急性心肌梗死等動脈血栓相關性疾病的治療。本發明的具體技術方案是
一種溶解血小板栓塊的基因工程製劑的製備方法，該方法包括
a)人源性抗體All工程菌的構建
將從噬菌體抗體文庫中獲得的能特異性識別血小板整合素β 3亞基第49-66表位的噬菌體-All基因用限制性內切酶Noc I和Not I雙酶切後插入到表達質粒pET29a中，構建成重組質粒pET29a-All ；將重組後的表達質粒pET29a_All轉化宿主菌BL21 (DE3) pLysS獲得能穩定分泌人源性抗體All工程菌；
b)解整合素金屬蛋白酶-18羧基端重組蛋白AD18C工程菌的構建
通過多聚酶鏈式反應法，擴增人源性解整合素金屬蛋白酶18蛋白羧基端基因；通過限制性內切酶Nde I和Not I雙酶切後插入到表達質粒PGEX-4T2中，構建成重組質粒 pGEX-4T2-AD18C84Q_1221 ；將重組後的表達質粒 pGEX-4T2_AD18C84(1_1221 轉化宿主菌 BL21 (DE3)PLysS獲得能穩定分泌人源性重組蛋白AD18C工程菌； c)製備溶解血小板栓塊的基因工程製劑
i )將步驟a)或步驟b)中的人源性抗體All或人源性重組蛋白AD18C工程菌於LB 培養基中37°C培養過夜，按1:50比例轉接後繼續培養至光密度值OD6tltlnm ^ 0. 6，加ImM異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導4個小時進行誘導表達，獲得含目的蛋白的菌體；將已知重量的菌體，按10ml/g溼重比例加入裂解液，攪拌均勻，於4°C進行超聲破菌， 12000 r/min離心30min獲得包涵體；其中裂解液為100mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)、2讓ol/L 乙二胺四乙酸(EDTA)、100 mM/L 氯化鈉(NaCl), pH 7.0;
ii)將步驟i)的包涵體進行復性處理，取包涵體懸浮在9倍體積的洗滌緩衝液中，洗滌3次；取洗滌後的溼包涵體按10mL/g比例加入變性緩衝液，37°C變性池，4°C，8000r/min 離心30min，取上清，按1/40比例逐步稀釋到含有不同濃度的鹽酸胍、氯化鈉、尿素、氧化型穀胱甘肽、還原型穀胱甘肽的復性緩衝液中，4°C攪拌30 min後，靜置18 h獲得包涵體復性產物上清液；其中洗滌緩衝液為100 mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)，2 mmol/L 乙二胺四乙酸鹽(EDTA)，0. 005/L Triton, 2 mol/L 尿素⑶rea)，pH7. 0 ；變性緩衝液為50 mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(1Tris-HCl )，6 mmol/L鹽酸胍，5 mmol/L乙二胺四乙酸鹽(EDTA)，100 mmol/L巰基乙醇，pH8. 0 ；
iii)將步驟ii)的包涵體復性產物上清液通過Ni-NTA親和柱(Al1)或穀胱甘肽-S-轉移酶(GST)親和柱(AD18C)進行純化，獲得溶解血小板栓塊的基因工程製劑，該製劑為基因工程抗體或重組蛋白。所述重組蛋白免疫紐西蘭大白兔，獲得兔源性抗AD18C多克隆抗體。所述溶解血小板栓塊的基因工程製劑的應用，在於用於腦血管栓塞或心血管栓塞的治療。所述兔源性抗AD18C多克隆抗體的應用，在於用於動脈血管出血的治療及動脈血栓的監測。所述人源性抗體All的脫氧核苷酸序列。本發明中抗體及重組蛋白的生產具有快速、人源化等優點，且適合工業化生產。抗體及其重組蛋白可用於治療腦卒中、急性心梗等心腦血管相關性疾病。
圖1為重組表達質粒pET49a(+)/All的構建、誘導表達及純化圖； 圖2為重組表達質粒pGEX-4T2/ADAMTS18-C__1221的誘導表達圖3為基因工程抗體A11、AD18C體外解聚血小板栓塊圖； 圖4為基因工程抗體All體內與頸動脈血栓的結合效應圖； 圖5為基因工程抗體All，AD18C對腦細胞的保護效應GFAP染色圖； 圖6為重組蛋白ADAMTS-18 C84ch1221治療腦卒中TCC染色圖。
具體實施例方式實施例1
重組表達質粒pET49a(+)-All的構建克隆-11是從人源性噬菌體抗體庫中獲得的可與血小板整合素GPIIIa49-66表位反應的噬菌體抗體。製備方法為獲得可溶性表達的單鏈抗體片段(scFv)，將噬菌粒 (PIT2-A11)和pET29a質粒用Nco I和Not I分別進行雙酶切.經1%瓊脂糖電泳後，回收目的基因片段和pET29a的酶切大片段。用T4 DNA Ligase將目的基因片段與載體片段於 16°C連接過夜。將連接產物pET29a ( + )_A11轉化DH5 a感受態細胞，在含卡那黴素的LB 平板上培養.挑取單菌落，用Nco I/Not I雙酶切鑑定篩選陽性克隆.抽提陽性克隆的質粒 DNA,目的基因經測序確證。用正確基因序列的pET29a ( + )_A11質粒轉化BL21 (DE3)pLysS 表達菌。實施例2
重組表達質粒pGEX-4T2-ADAMTS-18 C84ch1221的構建
人源性ADAMTS-18蛋白是血小板整合素GPIIIa49-66的天然配體，它可通過其C末端與血小板結合。製備方法以ADAMTS-18 cDNA序列為模板，通過PCR法，擴增人源性 ADAMTS-18蛋白C端(840-1221)基因；通過Nde I和Not I雙酶切後將其插入到pGEX_4T2 質粒，構建成重組質粒 pGEX-4T2-ADAMTS-18 C84ch1221。實施例3
基因工程抗體All及AD18C重組蛋白的製備
從培養平板上挑取單菌落於LB培養基(All為卡那黴素抗性，AD18C蛋白為氨苄抗性) 中，37°C，200rpm振蕩培養過夜，按1 50比例轉接後繼續培養至OD6tltlnm 0. 8，加0. 5mM IPTG 誘導3個小時。離心(6，000rpm，20minutes)收集菌體。將已知重量的菌體，按10ml/g溼重比例加入裂解液lOOmmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris_HCl)，2mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，100 mM/L氯化鈉(NaCl)，pH 7. O攪拌均勻，於4°C進行超聲破菌，12000 r/ min離心30min獲得包涵體。將上述包涵體進行復性處理。復性方法為取包涵體懸浮在9 倍體積的洗滌緩衝液100 mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)，2 mmol/L乙二胺四乙酸鹽(EDTA)，0. 5% Triton, 2 mol/L尿素⑶rea)，pH7. 0中，洗滌3次。取洗滌後的溼包涵體按10mL/g比例加入變性緩衝液50 mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)， 6 mmol/L 鹽酸胍，5 mmol/L 乙二胺四乙酸鹽(EDTA)，100 mmol/L 巰基乙醇，pH8. 0，37°C 變性:3h，4°C，8000r/min離心30min，取上清，按1/40比例逐步稀釋到含有不同濃度的鹽酸胍、氯化鈉(NaCl)、尿素(toea)、氧化型穀胱甘肽(GSSG)、還原型穀胱甘肽(GSH)等的復產物上清通過Ni-NTA親和柱(All)或穀胱甘肽-S-轉移酶(GST)親和柱(AD18C)進行純化， 獲得高純度基因工程抗體All或AD18C重組蛋白。實施例4
基因工程抗體All及AD18C端蛋白的體外活性測定
利用高倍顯微鏡檢測All及AD18C蛋白對血小板栓塊解聚的解聚效應。方法是將All 抗體及AD18C蛋白分別加入到膠原蛋白(collagen)激活的血小板栓塊中，37°C反應1小時， 在高倍顯微鏡下計數血小板栓塊的解聚數目(血小板栓塊數目/1000血小板)。實施例6
All抗體及AD18C蛋白的體內溶栓效應測定
6-8周Swiss Webster大鼠按照動物體重，以10%烏拉坦(1 g / kg)腹腔注射進行全身麻醉，麻醉完畢後，尾靜脈注射羅丹明ahodamine 6G)標記的血小板。將麻醉後的動物仰位固定，切開頸部皮膚，分離皮下結締組織，暴露一側頸總動脈。將吸有10%三氯化鐵溶液10 μ 的1 cmXl cm的濾紙小片包裹在此段頸總動脈上，計時20分鐘取下，於雷射共聚焦顯微鏡下觀察血栓大小。造模成功後，靜脈注射All抗體或AD18C蛋白，觀察溶栓療效。取成年雄性Swiss Webster大鼠，採用腔內線栓法製作大鼠短暫性大腦中動脈阻塞模型。造模成功後，靜脈注射Al 1抗體或AD18C蛋白，觀察溶栓療效。將大鼠斷頭取腦並速凍後自視交叉向後作厚約2mm的連續切片，置於2%氯代三苯基四氮唑(TTC)緩衝液中，37°C避光孵育 30min。觀察結果並用掃描儀將照片掃入LraEX-F型圖像分析儀內分析，根據面積和切片間隔計算出腦片上梗塞灶體積佔全腦體積的百分比。膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acid protein, GFAP)染色，將2mm厚腦切片放入3% H202溶液中室溫浸泡15 min後，5%牛血清白蛋白封閉30 min後依次入①抗GFAP(兔源，1 200，Santa Cruz公司)染色， 4°C過夜；②生物素標記的羊抗兔IgG(l 500，Sigma)，室溫孵育2 4 h;③生物素-卵白素-HRP複合物(北京中杉金橋生物技術有限公司)，室溫孵育1 h。DAB-H202顯色。以上每一步驟之後均用0.01 mol/L PBS液充分漂洗3次，每次5 min，顯微鏡下觀察星型膠質纖維酸性蛋白染色。
權利要求
1.一種溶解血小板栓塊的基因工程製劑的製備方法，其特徵在於該方法包括a)人源性抗體All工程菌的構建將從噬菌體抗體文庫中獲得的能特異性識別血小板整合素β 3亞基第49-66表位的噬菌體-All基因用限制性內切酶Noc I和Not I雙酶切後插入到表達質粒pET29a中，構建成重組質粒pET29a-All ；將重組後的表達質粒pET29a_All轉化宿主菌BL21 (DE3) pLysS獲得能穩定分泌人源性抗體All工程菌；b)解整合素金屬蛋白酶-18羧基端重組蛋白AD18C工程菌的構建通過多聚酶鏈式反應法，擴增人源性解整合素金屬蛋白酶18蛋白羧基端基因；通過限制性內切酶Nde I和Not I雙酶切後插入到表達質粒PGEX-4T2中，構建成重組質粒 pGEX-4T2-AD18C84Q_1221 ；將重組後的表達質粒 pGEX-4T2_AD18C84(1_1221 轉化宿主菌 BL21 (DE3) PLysS獲得能穩定分泌人源性重組蛋白AD18C工程菌；c)製備溶解血小板栓塊的基因工程製劑i )將步驟a)或步驟b)中的人源性抗體All或人源性重組蛋白AD18C工程菌於LB培養基中37°C培養過夜，按1:50比例轉接後繼續培養至光密度值OD6tltlnm ^ 0. 6，加ImM異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷誘導4個小時進行誘導表達，獲得含目的蛋白的菌體；將已知重量的菌體，按10ml/g溼重比例加入裂解液，攪拌均勻，於4°C進行超聲破菌，12000 r/min 離心30min獲得包涵體；其中裂解液為100mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、2mmol/L乙二胺四乙酸、100 mM/L氯化鈉，pH 7.0;ii)將步驟i)的包涵體進行復性處理，取包涵體懸浮在9倍體積的洗滌緩衝液中，洗滌3次；取洗滌後的溼包涵體按10mL/g比例加入變性緩衝液，37°C變性池，4°C，8000r/min 離心30min，取上清，按1/40比例逐步稀釋到含有不同濃度的鹽酸胍、氯化鈉、尿素、氧化型穀胱甘肽、還原型穀胱甘肽的復性緩衝液中，4°C攪拌30 min後，靜置18 h獲得包涵體復性產物上清液；其中洗滌緩衝液為100 mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，2 mmol/L乙二胺四乙酸鹽，0.005/L Triton, 2 mol/L尿素，pH7. 0 ；變性緩衝液為50 mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，6 mmol/L鹽酸胍，5 mmol/L乙二胺四乙酸鹽，100 mmol/L巰基乙醇，pH8. 0 ；iii)將步驟ii)的包涵體復性產物上清液通過Ni-NTA親和柱(All)或穀胱甘肽-S-轉移酶(GST)親和柱(AD18C)進行純化，獲得溶解血小板栓塊的基因工程製劑，該製劑為基因工程抗體或重組蛋白。
2.根據權利要求1所述的溶解血小板栓塊的基因工程製劑，其特徵在於所述重組蛋白免疫紐西蘭大白兔，獲得兔源性抗AD18C多克隆抗體。
3.—種權利要求1製備的溶解血小板栓塊的基因工程製劑的應用，其特徵在於用於腦血管栓塞或心血管栓塞的治療。
4.一種權利要求2所述兔源性抗AD18C多克隆抗體的應用，其特徵在於用於動脈血管出血的治療及動脈血栓的監測。
5.根據權利要求1所述的溶解血小板栓塊的基因工程製劑，其特徵在於所述人源性抗體All的脫氧核苷酸序列。
全文摘要
本發明涉及生物製藥中應用基因工程技術生產蛋白質藥物領域，特別是一種新的具有快速溶解動脈血栓團塊中血小板成分的人源化單克隆抗體(A11)和解整合素金屬蛋白酶-18羧基端重組蛋白(AD18C)的製備方法和應用。其製備方法是應用基因工程技術構建了表達A11及ADAMTS-18C的重組質粒，並實現了其在大腸桿菌中的高效表達。經分離純化後獲得高純度的具有快速溶解動脈血栓團塊中血小板成分的人源化基因工程抗體及重組蛋白，可用於腦卒中、急性心肌梗塞等動脈血栓相關性疾病的治療。
文檔編號A61K38/48GK102154259SQ20101061697
公開日2011年8月17日 申請日期2010年12月31日 優先權日2010年12月31日
發明者黨素英, 張巍, 張鑫 申請人:張巍