一種玉米赤黴烯酮毒素降解酶ZENdease‑N1及其編碼基因與應用的製作方法
2023-09-17 00:23:15
本發明涉及酶工程領域。更具體地，涉及一種玉米赤黴烯酮降解酶及其編碼基因與應用。
背景技術：
玉米赤黴烯酮(zearalenone,zen)主要是由鐮刀菌屬(fusariumspecies)產生的次生代謝物，是世界上汙染範圍最廣的一種鐮刀菌毒素，易受zen汙染的糧食作物包括玉米、大麥、小麥、高粱和黑麥等。zen的化學名稱為6-(10-羥基-6氧基-十一碳烯基)β-雷鎖酸內酯，其結構與雌性激素雌二醇(estradiol)的結構相似，zen能夠與動物細胞膜上的雌激素受體(estrogenreceptor，er)結合，引起er的構象改變，zen/er複合物被進一步轉移至細胞核內，與雌激素效應元件結合，調節靶基因的轉錄與翻譯，進而影響細胞的生長和分裂。zen被攝入到哺乳動物體內，可引起哺乳動物陰道炎、假髮情及發情周期延長、流產、不育以及畸形等的「高雌性激素症」(hyperestrogenism)。zen通過食物鏈在人體內蓄積，可導致性早熟，甚至引起乳腺癌、食管癌等發病率增加，對人類健康造成巨大威脅。
目前，國內外zen的去毒方法主要有物理去除、化學處理等。對已經汙染zen真菌毒素穀物的物理、化學處理方法主要有：衝洗和漂洗、熱處理、離子輻射、無機吸附、化學試劑的處理及臭氧氧化等。但是，物理化學脫毒效率並沒有預期的高，且改變了食品的品質，易造成營養物質的流失，且歐盟不允許在食品生產過程中應用化學方法消除真菌毒素。
微生物降解法消除zen汙染是利用微生物在代謝過程中產生的酶與zen作用，破壞zen分子的毒性基團，使其被降解或轉化為無毒產物的過程。生物降解法降解zen特異性強、zen分子被轉化效率高、不會引起環境汙染，可科學有效的消除糧食作物中的zen汙染，具有極好的應用前景
因此，提供一種可有效降解zen的酶類具有重要的意義。
技術實現要素：
本發明的第一個目的在於提供一種玉米赤黴烯酮降解酶及其編碼基因，該酶可以降解玉米赤黴烯酮(zen)。
本發明的第二個目的在於提供一種表達上述玉米赤黴烯酮降解酶的方法。
本發明的第三個目的在於提供一種上述玉米赤黴烯酮降解酶的應用。
為達到上述目的，本發明採用下述技術方案：
本發明提供了一種玉米赤黴烯酮降解酶，被命名為zendease-n1，來源於楊盤二孢菌(marssoninabrunnea)，所述玉米赤黴烯酮降解酶為如(a)或(b)所示的蛋白質：
(a)由序列表sedidno.1所示的胺基酸序列組成的蛋白質。
(b)由序列表sedidno.1所示的胺基酸序列經過一個或多個胺基酸的取代和/或缺失和/或插入而衍生得到的具有降解玉米赤黴烯酮活性的蛋白質。
其中，所述序列表sedidno.1所示的胺基酸序列由286個胺基酸殘基組成。
在本發明中上述玉米赤黴烯酮降解酶的編碼基因也屬於本發明的保護範圍，所述編碼基因如(a)或(b)所示：
(a)如序列表sedidno.2所示的核苷酸序列；
(b)編碼如序列表sedidno.1所示胺基酸序列的核苷酸序列。
其中，本發明中序列表sedidno.2所示的核苷酸序列由861個鹼基組成，其編碼序列為自5』端第1到第861位鹼基，編碼具有序列表sedidno.1所示的胺基酸序列的蛋白質。
需要注意的是，含有本發明上述編碼基因的表達載體、細胞系、工程菌及宿主菌均屬於本發明的保護範圍。
本發明還提供了一種表達玉米赤黴烯酮降解酶的方法，是將含有上述玉米赤黴烯酮降解酶編碼基因的重組表達載體導入宿主細胞，表達得到玉米赤黴烯酮降解酶。
其中，所述宿主包括但不限於大腸桿菌、酵母菌、哺乳動物細胞、昆蟲細胞、枯草桿菌、芽孢桿菌或乳桿菌等；優選為大腸桿菌，更優選的為大腸桿菌bl21。
用於構建所述重組大腸桿菌及重組酵母表達載體的出發載體可為在上述宿主中表達外源基因的表達載體，如可在大腸桿菌中表達的pet載體，以及在巴氏德畢赤酵母(pichiapastoris)中表達的ppic9k、ppic9、ppic3.5k等。
上述重組表達載體均可按常規方法構建。
本發明還提供了所述玉米赤黴烯酮降解酶在降解玉米赤黴烯酮中的應用。
本發明的有益效果如下：
本發明得到的玉米赤黴烯酮降解酶可對糧食中真菌毒素玉米赤黴烯酮進行降解，對控制糧食汙染起到有效的作用。
附圖說明
下面結合附圖對本發明的具體實施方式作進一步詳細的說明。
圖1示出重組質粒pet30a-zendease-n1的表達產物的sds-page圖；
其中，泳道1，表達產物；泳道m，蛋白分子量標準(97kd，66kd，45kd，31kd，21.5kd，14.4kd，6.5kd)。
圖2示出玉米赤黴烯酮降解酶能力測定圖。
圖3示出不同ph值條件下zendease-n1對zen分子的降解情況。
圖4示出了不同溫度條件下zendease-n1對zen分子的降解情況。
具體實施方式
為了更清楚地說明本發明，下面結合優選實施例和附圖對本發明做進一步的說明。附圖中相似的部件以相同的附圖標記進行表示。本領域技術人員應當理解，下面所具體描述的內容是說明性的而非限制性的，不應以此限制本發明的保護範圍。
實施例1玉米赤黴烯酮降解酶zendease-n1的獲得及表達
1、玉米赤黴烯酮降解酶編碼基因的獲得
通過化學合成方法得到zendease-n1全長基因，以此合成的基因為模板，在引物1和引物2的引導下進行pcr反應，擴增玉米赤黴烯酮降解酶基因的序列。
引物1：5'-gaaattcatatgccttcttcactt-3'(其核苷酸序列如序列表sedidno.3所示，劃線部分鹼基為ndei識別位點)
引物2：5'-cccgtcgacagccccatcctt-3'(其核苷酸序列如序列表sedidno.4所示，劃線部分鹼基為sali識別位點)
在pcr反應中，pcr反應條件為：94℃，保持5分鐘，接著按以下的溫度變化程序循環30次：升溫至94℃，保持1分鐘，降溫至54℃，保持1分鐘，升溫至68℃，保持2分鐘；然後於68℃，保持10分鐘，最後於4℃保溫10分鐘，結束擴增反應。通過瓊脂糖電泳分析獲得約0.8kb的單一帶，擴增之後的pcr產物檢測之後將目的帶大小的擴增產物用dna凝膠回收試劑盒進行回收，並檢測其濃度。回收pcr產物連接pet30avector，轉化大腸桿菌bl21，獲得重組質粒pet30a-zendease-n1測序鑑定。該玉米赤黴烯酮降解酶基因dna序列如序列表sedidno.2所示，其對應的胺基酸序列如序列表sedidno.1所示。
2、含有玉米赤黴烯酮降解酶編碼基因序列的重組表達載體的構建
上述所獲得的pcr產物兩端具有ndei和sali限制性內切酶位點，用(ndei)和(sali)限制性內切酶對pcr產物和質粒pet30a同時進行雙酶切反應，酶切體系50μl：目的片段或質粒20μl，10×kbuffer5μl，ndei2μl，sali2μl，ddh2o21μl，酶切條件是37℃反應3h。酶切產物經柱回收後進行連接，連接產物轉化大腸桿菌bl21，經卡那黴素抗性篩選，挑取陽性菌落培養，重組表達載體經pcr鑑定、酶切鑑定，測序驗證。經瓊脂糖電泳後載體。回收的目的片段和載體片段定量並按摩爾比為3:1的比例用t4dna連接酶進行體外連接，連接反應體系10μl：目的片段5μl，pet30a載體2μl10×t4dna連接緩衝液1μl，t4dna連接酶(350u/μl)1μl,ddh2o1μl。16℃連接過夜，連接產物轉化大腸桿菌bl21，經卡那黴素抗性篩選，挑取菌落37℃振蕩培養6-8h，分別進行pcr鑑定和重組質粒的酶切鑑定。獲得的重組表達載體命名為後pet30a-zendease-n1。
超聲波破碎，離心收集上清，取15μl上清用sds-page電泳進行檢測。對pet30a-zendease-n1進行測序，結果證明融合連接入載體pet30a的dna序列與序列表sedidno.2所示序列相同，構建含有玉米赤黴烯酮降解酶基因序列的重組表達載體pet30a-zendease-n1正確。
3、玉米赤黴烯酮降解酶在大腸桿菌中的表達純化
將重組表達載體pet30a-zendease-n1轉化大腸桿菌，塗布卡那黴素抗性lb平板。挑取平板平板上的單菌落到1llb培養基中培養，待細菌生長到od值為1左右時，加入0.5ml濃度為0.6mol/l的iptg誘導表達過夜，次日收菌純化蛋白。將過夜表達的菌體離心收集，棄上清，加入30ml重懸緩衝液，將細菌沉澱懸起後超聲破碎細菌，將破碎的細胞懸液轉入高速離心管中，高速離心後把上清加入到ni-nta親和柱中，讓其流過親和介質。用10倍柱體積的漂洗緩衝液漂洗親和介質，洗掉非特異性結合的雜蛋白，用5ml洗脫緩衝液將目的蛋白從親和柱上洗脫下來。用sds-聚丙烯醯胺凝膠電泳(sds-page)進行zendease-n1蛋白的表達純化分析。用sds-page電泳進行檢測。結果如圖1所示：泳道1為表達產物，箭頭表示目的條帶，這表明重組菌株表達的蛋白質的分子量約31.5kd，與從胺基酸推段出的理論分子量(31.5kd)大小一致。
實施例2玉米赤黴烯酮降解酶的活性檢測
取純化的zendease-n1蛋白50μl，加入到含zen濃度為10μg/ml的eppendorf管中，以不加zendease-n1蛋白的同濃度zen溶液作對照，37℃反應6h，100℃加熱10min終止反應，用旋轉蒸發儀蒸乾反應體系，加入1ml甲醇，超聲萃取，經0.22μm濾膜過濾後，用高效液相色譜檢測，根據zen濃度的變化來分析zendease-n1蛋白對zen是否具有降解活性。高效液相色譜檢測zen的色譜條件為：色譜柱：c18柱(250mm×4.6mm，5μm，xbridge)；流動相：超純水/色譜級乙腈＝50/50(v/v)；流動相流速：1.0ml/min；色譜柱溫度設定：25℃；進樣量：10μl；螢光檢測器：激發波長(ex)274nm，發射波長(em)440nm；採集時間：13min。在上述色譜條件下，對照組樣品在保留時間rt＝10.715min處有強吸收峰，而反應組樣品基本無zen目標峰檢出，經吸收峰面積計算，已有98％的zen分子被降解，如圖2所示，可以表明，zendease-n1基因克隆表達出的降解酶具有降解玉米赤黴烯酮的活性。
實施例3玉米赤黴烯酮降解酶的反應條件檢測
本發明探索zendease-n1降解zen分子的最佳反應條件，測試了不同溫度、ph值等條件下zendease-n1對zen分子降解活性的影響。
首先，測試不同ph值條件下zendease-n1對zen分子的降解率。取純化後的zendease-n1降解酶2ml，用pbs緩衝液稀釋100倍，備用；取8隻50ml離心管，每支加入稀釋後的降解酶5ml，以鹽酸和氨水調ph分別至2、3、4、5、6、7、8、9，4℃放置12h後，分別吸取500μl到8支含10μgzen的ep管中，37℃反應30min終止反應，以不加zendease-n1降解酶的同濃度zen溶液作對照，用高效液相色譜檢測不同ph值條件下zendease-n1對zen分子的降解活性影響。結果如圖3所示，結果表明，在ph＝7的中性條件下，zendease-n1對zen的降解活性最高，而在ph＝4的酸性條件下，zendease-n1對zen分子仍然有較高的降解活性，說明zendease-n1降解酶具有較好的耐酸性。
同樣方法，在ph＝7的條件下，測試4℃、20℃、37℃、45℃、60℃、70℃不同溫度條件下zendease-n1對zen分子的降解活性影響，結果如圖4所示，表明當溫度為20-37℃時，zendease-n1對zen均具有較好的降解效果，37℃時效果最佳。
顯然，本發明的上述實施例僅僅是為清楚地說明本發明所作的舉例，而並非是對本發明的實施方式的限定，對於所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動，這裡無法對所有的實施方式予以窮舉，凡是屬於本發明的技術方案所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處於本發明的保護範圍之列。
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國家糧食局科學研究院
一種玉米赤黴烯酮毒素降解酶zendease-n1及其編碼基因與應用
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