大鼠il－17re跨膜區和胞內區多肽及其編碼序列、融合蛋白與細胞系的製作方法

2023-09-17 12:17:15

專利名稱：大鼠il－17re跨膜區和胞內區多肽及其編碼序列、融合蛋白與細胞系的製作方法
技術領域：
本發明涉及由大鼠白介素17受體(IL-17RE)跨膜區和胞內區組成的多肽及其編碼序列、融合蛋白與轉基因細胞系。
背景技術：
白介素17(IL-17)及其受體(IL-17R)家族是一類獨特的免疫分子-受體家族，在正常機體免疫、炎症反應及腫瘤的發生過程中發揮重要作用(J.K.Kolls，A.Linden，Interleukin-17 family members and inflammation.Immunity 21(4)(2004)467；T.A.Moseley，D.R.Haudenschild，L.Rose，A.H.Reddi，Interleukin-17 familyand IL-17 receptors.Cytokine Growth Factor Rev 14(2)(2003)155)。目前已知IL-17配體有6個成員，每種配體作用於不同的免疫過程。比如，最早發現的IL-17A可以刺激多種組織細胞釋放趨化因子，以吸引中性粒細胞到炎症反應區域(M.Laan，Z.H.Cui，H.Hoshino，J.Lotvall，M.Sjostrand，D.C.Gruenert，B.E.Skoogh，A.Linden，Neutrophil recruitment by human IL-17 via C-X-C chemokinerelease in the airways.J.Immunol.162(4)(1999)2347；J.Witowski，K.Pawlaczyk，A.Breborowicz，A.Scheuren，M.Kuzlan-Pawlaczyk，J.Wisniewska，A.Polubinska，H.Friess，G.M.Gahl，U.Frei，A.Jorres，IL-17 stimulatesintraperitoneal neutrophil infiltration through the release of GRO alphachemokine from mesothelial cells.J.Immunol.165(10)(2000)5814.)。此外，IL-17A還可以通過誘發骨髓造血因子參與骨髓內粒細胞的生成(P.Schwarzenberger，V.La Russa，A.Miller，P.Ye，W.Huang，A.Zieske，S.Nelson，G.J.Bagby，D.Stoltz，R.L.Mynatt，M.Spriggs，J.K.Kolls，IL-17stimulatesgranulopoiesis in miceuse of an alternate，novel gene therapy-derived methodfor in vivo evaluation of cytokines.J.Immunol.161(11)(1998)6383.)。研究發現，類風溼性關節炎病人體內IL-17A表達量顯著增高是關節組織破壞的主要原因之一(M.Ziolkowska，A.Koc，G.Luszczykiewicz，K.Ksiezopolska-Pietrzak，E.Klimczak，H.Chwalinska-Sadowska，W.Maslinski，High levels of IL-17inrheumatoid arthritis patientsIL-15triggers in vitro IL-17production viacyclosporin A-sensitive mechanism.J.Immunol.164(5)(2000)2832.)。為此，利用IL-17A的特異性受體(IL-17RA)來阻斷IL-17A的促炎症反應作用是目前研製抗類風溼藥物的熱點。與IL-17配體不同，目前只系統研究了4種IL-17R，即IL-17RA、IL-17RB、IL-17RC和IL-17RD。可能是由於IL-17的配體及受體的作用方式具有多效性的特點，即某些IL-17R可以識別兩個以上的配體(T.A.Moseley，D.R.Haudenschild，L.Rose，A.H.Reddi，Interleukin-17 family and IL-17 receptors.Cytokine Growth Factor Rev 14(2)(2003)155.)。例如，IL-17RB可以同時識別IL-17B和IL-17E，並且IL-17RB與IL-17E的親和力比與IL-17B的親和力高(J.Lee，W.H.Ho，M.Maruoka，R.T.Corpuz，D.T.Baldwin，J.S.Foster，A.D.Goddard，D.G.Yansura，R.L.Vandlen，W.I.Wood，A.L.Gurney，IL-17E，a novelproinflammatory ligand for the IL-17 receptor homolog IL-17Rh1.J.Biol.Chem.276(2)(2001)1660.)。目前對IL-17配體-受體的相互作用尚處於認識的初期，許多問題還需要進一步深入研究。

發明內容
本發明的目的是提供一種由大鼠白介素17受體(IL-17RE)跨膜區和胞內區組成的多肽。
本發明所提供的大鼠IL-17RE跨膜區和胞內區的多肽，名稱為rIL-17Reid，來源於大鼠屬大鼠(Rattus norvegicus)，是具有下述胺基酸殘基序列之一的多肽1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID №1的胺基酸殘基序列經過一至十個胺基酸殘基的取代、缺失或添加且通過激活RAS/MAPK信號通路而具有促有絲分裂作用的多肽。
序列表中的SEQ ID №1由225個胺基酸殘基組成，其中自氨基端(N端)第1至25位胺基酸殘基為跨膜區序列，自N端第26至225位胺基酸殘基為胞內區序列。
編碼大鼠IL-17RE跨膜區和胞內區多肽的基因(rIL-17Reid)，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №1的DNA序列；3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴謹條件為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃條件下雜交並洗膜。
序列表中的SEQ ID №2由675個鹼基組成，其編碼序列為自5』端第1至675位鹼基，編碼具有序列表中SEQ ID №1的胺基酸殘基序列的多肽。其中，自5』端第1至75位鹼基編碼大鼠IL-17RE跨膜區，自5』端第76至675位鹼基編碼大鼠IL-17RE胞內區。
含有本發明基因rIL-17Reid的表達載體、轉基因細胞系和宿主菌均屬於本發明的保護範圍。
擴增rIL-17Reid中任一片段的引物對也在本發明的保護範圍之內。
本發明的第二個目的是提供一種包括鼠源紅細胞生成素受體(EPOR)胞外區和上述大鼠IL-17RE跨膜區和胞內區多肽的融合蛋白。
本發明所提供的融合蛋白，名稱為EPOR/rIL-17RE，是具有下述胺基酸殘基序列之一的蛋白質1)序列表中的SEQ ID №3；2)將序列表中SEQ ID №3的胺基酸殘基序列經過一至十個胺基酸殘基的取代、缺失或添加且通過激活RAS/MAPK信號通路而具有促有絲分裂作用的蛋白質。
序列表中的SEQ ID №3由503個胺基酸殘基組成，其中自氨基端(N端)第1至23位胺基酸殘基為鼠源EPOR信號肽，自N端第24至250位胺基酸殘基為鼠源EPOR的胞外區，自N端第251至475位胺基酸殘基為大鼠IL-17RE跨膜區和胞內區；自N端第483至492位胺基酸殘基為Myc標籤序列；自N端第498至503位胺基酸殘基為His標籤序列。
編碼上述融合蛋白EPOR/rIL-17RE的基因(EPOR/rIL-17RE)，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №4的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №3的DNA序列；3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №4限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴謹條件為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃條件下雜交並洗膜。
序列表中的SEQ ID №4由1512個鹼基組成，其開放閱讀框架為自5′端第1至1512位鹼基；自5′端第1至750位鹼基為鼠源EPOR胞外區的編碼序列；自5′端第751至756位鹼基為限制性內切酶EcoR I的識別位點；自5′端第757至1431位鹼基為rIL-17RE跨膜區和胞內區的編碼序列；自5′端第1432至1437位鹼基為限制性內切酶Xba I的識別位點；自5′端第1438至1446位鹼基為限制性內切酶Apa I及Stu I的識別位點；自5′端第1447至1476位鹼基編碼Myc標籤序列；自5′端第1477至1491位鹼基含有限制性內切酶Age I的識別位點；自5′端第1492至1509位鹼基編碼His標籤序列及終止密碼子。
含有本發明融合蛋白基因EPOR/rIL-17RE的表達載體、轉基因細胞系和宿主菌均屬於本發明的保護範圍。
擴增EPOR/rIL-17RE中任一片段的引物對也在本發明的保護範圍之內。
本發明所提供的其中一株轉有上述融合蛋白基因EPOR/rIL-17RE的轉基因細胞株，名稱為BaF3-EPOR/rIL-17RE，該細胞株已於2005年11月10日保藏於中國普通微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.1530。
所述轉基因細胞株BaF3-EPOR/rIL-17RE，是將融合蛋白基因EPOR/rIL-17RE導入野生型BaF3細胞獲得的。
可用常規方法將融合蛋白基因EPOR/rIL-17RE導入野生型BaF3細胞，如電轉染法、脂質體轉染法、或磷酸鈣轉染法等。
本發明提供了一種由大鼠白介素17受體(IL-17RE)跨膜區和胞內區組成的多肽，並獲得了由該多肽和鼠源紅細胞生成素受體(EPOR)胞外區組成的融合蛋白EPOR/rIL-17RE，以及轉有EPOR/rIL-17RE融合基因的轉基因細胞株BaF3-EPOR/rIL-17RE CGMCC No.1530。實驗證明，EPOR/rIL-17RE基因在BaF3細胞穩定表達可促進細胞的有絲分裂及增殖，且這種增殖作用具有血清依賴性，而與EPO配體的刺激與否無關。此外，BaF3-EPOR/rIL-17RE細胞在血清存在條件下可使ERK磷酸化水平顯著增高，從而激活細胞內的RAS/MAPK增殖信號通路。該穩定細胞系提供了一種具有商業化前景的細胞模型系統，可用於與rIL-17RE疾病相關的拮抗劑篩選，也可作為特異性藥物靶標進行大規模的抗rIL-17RE藥物的篩選。本發明在醫學和生物製藥領域具有較大的實際意義和廣闊的應用前景。
下面結合具體實施例對本發明做進一步說明。


圖1為PCR擴增的大鼠rIL-17RE跨膜區和胞內區(rIL-17Reid)編碼序列的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果圖2為質粒pGEM-T-rIL-17Reid的EcoR I和Xba I酶切產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果圖3為BaF3-EPOR/IL-17RE細胞和對照細胞BaF3-P3在有或無血清的條件下，用EPO刺激1天後的細胞形態圖4為四氮唑鹽(MTT)法定量檢測BaF3-EPOR/rIL-17RE血清依賴性增殖效應的實驗結果圖5為利用螢光酶報告系統檢測EPOR/IL-17RE是否具有激活Elk1轉錄活性的實驗結果圖6為Western Blot檢測BaF3-EPOR/rIL-17RE在血清存在條件下可激活RAS/MAPK信號通路的驗證實驗結果具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法，所用引物合成及測序工作均由上海博亞生物技術有限公司完成。
實施例1、大鼠IL-17RE跨膜區和胞內區(rIL-17Reid)編碼序列的克隆根據SEQ ID №2的DNA序列設計引物RT-PCR擴增rIL-17RE跨膜區和胞內區多肽(命名為rIL-17Reid)的編碼序列，引物序列如下P1(上遊引物)5′-tatagaattcagacacctcgggctcttgatc-3′；P2(下遊引物)5′-tatatctagacagacaactgaagccacaagg-3′用Trizol試劑盒(購自Invitrogen)抽提大鼠肝臟組織的總RNA。以2g大鼠肝臟總RNA為模板，在引物P1和引物P2的引導下，採用一步法RT-PCR擴增試劑盒(購自Takara)並參照試劑盒說明書RT-PCR擴增rIL-17RE跨膜區和胞內區多肽的編碼序列。RT-PCR擴增體系為50ng模板DNA，引物P1和P2各100pmol，1×擴增緩衝液，dNTPs各200μmol/L，40單位RNase Inhibitor，1單位高保真Taq酶，5單位AMYRTase XL。反轉錄條件為50℃45分鐘。PCR反應條件為先94℃5分鐘；然後94℃30秒，55℃30秒，72℃1分鐘，共35個循環；最後72℃10分鐘。反應結束後，對擴增產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果如圖1所示(泳道1為Marker(Marker的分子量範圍為0.1-10.0kb)，泳道2為RT-PCR擴增產物)，回收並純化約680bp的目的片段，用限制性內切酶EcoR I和Xba I對其進行酶切後，將其亞克隆到經相同酶酶切的載體pGEM-T(購自Promega公司)中，將重組產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，經藍白斑篩選得到陽性克隆，挑選陽性克隆搖菌提質粒，將含有目的片段的質粒載體命名為pGEM-T-rIL-17Reid。用限制性內切酶EcoR I和Xba I對質粒pGEM-T-rIL-17Reid進行酶切鑑定，將酶切產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果如圖2所示(泳道1為Marker(Marker的分子量範圍為0.1-10.0kb)，泳道2為酶切產物)，經酶切獲得了長度約680bp的DNA片段，與預期結果相符，表明目的片段已正確插入到載體中。用測序的方法做進一步鑑定，測序結果表明插入片段具有序列表中SEQ ID №2的多核苷酸序列，序列表中的SEQ ID №2由675個鹼基組成，其編碼序列為自5』端第1至675位鹼基，編碼具有序列表中SEQ ID №1的胺基酸殘基序列的多肽。上述酶切及測序鑑定結果表明獲得了序列正確的大鼠IL-17RE跨膜區和胞內區的編碼序列，將大鼠IL-17RE跨膜區和胞內區的編碼序列命名為rIL-17Reid。將該基因片段用限制性內切酶EcoR I和Xba I從質粒pGEM-T-rIL-17Reid上切下，亞克隆到經相同酶雙酶切的載體pcDNA3.1-Myc/his(購自Invitrogen)中，將重組產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，經藍白斑篩選得到陽性克隆，挑選陽性克隆搖菌提質粒，將含有大鼠rIL-17RE跨膜區和胞內區(rIL-17Reid)編碼序列的質粒載體，命名為pcDNA3.1(rIL-17Reid)。
實施例2、rIL-17Reid的生物信息學分析對rIL-17Reid的胺基酸殘基序列進行生物信息學分析，rIL-17Reid具有序列表中SEQ ID №1的胺基酸殘基序列，由225個胺基酸殘基組成，其中自氨基端(N端)第124至126位胺基酸殘基為蛋白激酶C的磷酸化位點，自N端第166至187位胺基酸殘基為保守的亮氨酸拉鏈，自N端第195至198位胺基酸殘基為酪蛋白激酶磷酸化位點，自N端第1至15位胺基酸殘基為Erk1激酶結合位點。
實施例3、rIL-17Reid對RAS/MAPK信號通路激活作用的驗證實驗在293細胞中過量表達EPOR/rIL-17RE，以檢測EPOR/rIL-17RE對胞內ERK磷酸化水平的影響。首先，用螢光酶(Luciferase)報告系統檢測EPOR/rIL-17RE對RAS/MAPK信號通路的激活作用，以pCDNA3.1空載體為對照。轉錄因子Elk1是RAS/MAPK信號激活的靶基因。若IL-17RE可以激活RAS/MAPK信號通路，則Elk1-Luciferase的表達水平就會上調。如果EPOR/rIL-17RE可以激活RAS/MAPK信號通路的話，Elk1-Luciferase的表達水平就會上調。具體方法為將每孔4×105個293細胞鋪於6孔板，使其密度長到80％。分兩組，用磷酸鈣轉染試劑(購自Clontech)將3.5μgpcDNA3.1空載體和pcDNA3.1(EPOR/rIL-17RE)分別轉染到不同孔中的293細胞，外加螢光酶報告系統質粒PFA-Elk-1、PFR-luciferase(參考文獻J Biol Chem.2001 Sep28；276(39)36804-8)，以及pGFP-ERK(參考文獻J Cell Biol.2000Mar20；148(6)1267-81.)。與此同時，用海腎(Renilla)螢光素酶質粒(購自Promega)為內參照來進行定量標準化，螢光素酶活性檢測結果如圖5所示，表明EPOR/rIL-17RE對螢光素酶基因的表達具有顯著的激活作用。
實施例4、BaF3-EPOR/rIL-17RE穩定細胞系的構建一、含有EPOR/rIL-17RE融合蛋白基因的載體的構建以pMX-EPOR為模板(參考文獻PNAS，Vol.93，p8324-8328，August 1996)，在引物P3(上遊引物)5′-tatagatatcatggacaaactcagggtgcc-3′和引物P4(下遊引物)5′-tatagaattcgagagggtccaggtcgcta-3′的引導下，PCR擴增小鼠紅細胞生成素受體(EPOR)胞外區的編碼序列。PCR反應體系為50ng模板DNA，引物P3和P4各100pmol，1×擴增緩衝液2.5μl，dNTPs各200μmol/L，1單位高保真Taq酶。PCR反應條件為先94℃5分鐘；然後94℃30秒，55℃30秒，72℃1分鐘，共35個循環；最後72℃10分鐘。反應結束後，對PCR擴增產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收並純化約750bp的目的片段，將該目的基因命名為EPOR，用限制性內切酶EcoR V和EcoR I對其進行酶切後，將其亞克隆到經相同酶酶切的步驟1構建的重組載體pcDNA3.1(rIL-17Reid)中，將重組產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，經藍白斑篩選得到陽性克隆，挑選陽性克隆搖菌提質粒，將含有小鼠紅細胞生成素受體(EPOR)胞外區與大鼠IL-17RE跨膜區與胞內區融合受體基因EPOR/rIL-17RE的質粒載體，命名為pcDNA3.1(EPOR/rIL-17RE)。對pcDNA3.1(EPOR/rIL-17RE)進行測序，測序結果表明EPOR/rIL-17RE具有序列表中SEQ ID №4的多核苷酸序列，序列表中的SEQ ID №4由1512個鹼基組成，其開放閱讀框架為自5′端第1至1512位鹼基；自5′端第1至750位鹼基為鼠源EPOR胞外區的編碼序列；自5′端第751至756位鹼基為限制性內切酶EcoR I的識別位點；自5′端第757至1431位鹼基為rIL-17RE跨膜區和胞內區的編碼序列；自5′端第1432至1437位鹼基為限制性內切酶Xba I的識別位點；自5′端第1438至1446位鹼基為限制性內切酶Apa I及Stu I的識別位點；自5′端第1447至1476位鹼基編碼Myc標籤序列；自5′端第1477至1491位鹼基含有限制性內切酶Age I的識別位點；自5′端第1492至1509位鹼基編碼His標籤序列及終止密碼子。EPOR/rIL-17RE編碼具有序列表中SEQ ID №3的胺基酸殘基序列的蛋白質，序列表中的SEQ ID №3由503個胺基酸殘基組成，其中自氨基端(N端)第1至23位胺基酸殘基為鼠源EPOR信號肽，自N端第24至250位胺基酸殘基為鼠源EPOR的胞外區，自N端第251至475位胺基酸殘基為大鼠IL-17RE跨膜區和胞內區；自N端第483至492位胺基酸殘基為Myc標籤序列；自N端第498至503位胺基酸殘基為Hi s標籤序列。將EPOR/rIL-17RE的編碼蛋白命名為EPOR/rIL-17RE，該融合蛋白的羧基端攜帶有Myc和His標籤，故可被鼠Myc和His抗體識別。
二、BaF3-EPOR/rIL-17RE穩定細胞系的獲得離心收取1×106野生型BaF3細胞，重懸於0.5mL無血清RPMI-1640培養液(HyClone公司)中。將3μg pcDNA3.1(EPOR/rIL-17RE)與pcDNA3.1-Myc/his空載體(對照)分別與BaF3細胞混合，冰浴10分鐘後，用ECM399(購自BTX公司)電轉儀進行電轉。電轉條件為200-230V，電流為25-35毫秒。將電轉染後的細胞置於含500μg/mL G418(質粒pcDNA3.1-Myc/his攜帶新酶素抗性基因)的RPMI-1640全培養基進行篩選，每三天換一次液，連續培養三周後，在100mm培養皿中進行擴增，最終得到外源基因穩定表達的轉基因細胞系BaF3-EPOR/rIL-17RE和對照細胞系BaF3-P3。轉基因細胞株BaF3-EPOR/rIL-17RE已於2005年11月10日保藏於中國普通微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.1530。
實施例5、BaF3-EPOR/rIL-17RE的促有絲分裂反應具有配體非依賴性及血清依賴性的驗證實驗BaF3細胞為小鼠前B細胞，需要有白細胞介素3(由WEHI-3B條件培養液提供，Braz J Med Biol Res.1996Sep；29(9)1239-42.)的刺激下才能增殖。為檢測IL-17RE是否具有促有絲分裂的作用，將BaF3-EPOR/IL-17RE細胞和對照細胞BaF3-P3在全飢餓條件下(無血清及無WEHI-3B)培養24小時。然後，在含10％小牛血清(請提供血清的添加劑量及其購買處)或無血清的條件下，用20μg/mL EPO(購自上海麒麟鯤鵬(中國)生物藥業)對細胞進行的刺激。刺激時間為0、1、2、3、4天。處理1天後觀察細胞形態，如圖3所示(Serum血清，WEHIWEHI-3B條件培養液；「+」、「-」分別表示添加和不添加)，加入血清的細胞有較好的細胞形態，而僅加入EPO的細胞或全飢餓細胞的細胞結構明顯被破壞。然後用四氮唑鹽(MTT)法進一步定量檢測BaF3-EPOR/rIL-17RE血清依賴性的增殖效應，以BaF3-P3為對照。MTT是一種四甲基偶氮唑鹽，在活細胞線粒體琥珀酸脫氫酶的作用下，被還原成藍色甲瓚顆粒，形成量與活細胞數和線粒體琥珀酸脫氫酶的活性呈正相關。將1×105個BaF3-EPOR/rIL-17RE、BaF3-P3細胞接種於96孔板，分別在全飢餓或含10％小牛血清的RPMI-1640培養基中培養0、1、2、3、4天。然後吸去培養液，將細胞用PBS洗1次，加入0.4mg/mL MTT，37℃孵育5小時，然後再加入200μl/孔助溶劑二甲基亞碸(DMSO)，使甲瓚顆粒完全溶解，用酶標儀測定570nm波長處的OD值。結果如圖4所示(「+」、「-」分別表示添加和不添加)，全飢餓條件下，BaF3-EPOR/rIL-17RE對EPO刺激不敏感，與各檢測的時間點與對照相比未見明顯增殖效應(見圖4中的A圖)，而加入血清後，細胞增殖效應明顯提高，並且這種增殖作用不受EPO刺激的影響(見圖4中的B圖)。
實施例6、BaF3-EPOR/rIL-17RE在血清存在條件下可激活RAS/MAPK信號通路的驗證實驗將BaF3-EPOR/rIL-17RE和BaF3-P3飢餓12-24小時(無血清，無WEHI-3B條件培養液)，然後用小牛血清(FBS)進行不同時間刺激(0min、10min、20min、30min)。取上述經FBS刺激不同時間的BaF3-EPOR/rIL-17RE和BaF3-P3細胞的細胞裂解液各20μg進行蛋白印記雜交(Western Blot)檢測，分別以鼠源抗Myc標籤、抗ERK、抗磷酸化ERK的單克隆抗體為一抗(購自Santa Cruz公司)進行雜交，以螢光素標記的羊源抗鼠抗體(Amersham Biosciences UK Limited)為二抗，最後用ECL化學發光的底物(Amersham Biosciences)進行雜交信號放大，結果如圖6所示(anti-ERK-p、anti-ERK、anti-Myc分別表示抗磷酸化ERK、抗ERK、鼠源抗Myc標籤單克隆抗體的實驗組，pcDNA3.1、EPOR/rIL-17RE-myc分別表示轉染有pcDNA3.1-Myc/his空載體和pcDNA3.1(EPOR/rIL-17RE)的293細胞；「+」、「-」分別表示添加和不添加)，經FBS刺激20分鐘後，BaF3-EPOR/rIL-17RE細胞內源性ERK的磷酸化水平明顯上調，表明BaF3-EPOR/rIL-17RE中rIL-17RE的胞內區可在有血清存在的條件下激活RAS/MAPK信號通路。
序列表16042101211225212PRT213大鼠屬大鼠(Rattus norvegicus)4001Arg His Leu Gly Leu Leu Ile Leu Ala Leu Leu Gly Leu Thr Thr Leu1 5 10 15Leu Gly Val Val Leu Val Leu Phe Cys Arg Arg Leu Leu Pro Gly Pro20 25 30Gly Arg Thr Arg Pro Val Leu Leu Leu His Ala Ala Asp Ser Glu Ala35 40 45Gln Arg Arg Leu Val Gly Ala Leu Ala Glu Leu Leu Arg Thr Ala Leu50 55 60Gly Gly Gly Arg Asp Val Ile Val Asp Leu Trp Glu Gly Thr His Val65 70 75 80Ala Arg Ile Gly Pro Leu Pro Trp Leu Trp Ala Ala Arg Glu Arg Val85 90 95Ala Arg Glu Gln Gly Thr Val Leu Leu Leu Trp Ser Cys Ala Gly Pro100 105 110Ser Thr Ala Cys Ser Gly Asp Pro Gln Thr Ala Pro Leu Arg Thr Leu115 120 125Ser Cys Ala Ala Pro Arg Gln Leu Leu Leu Ala Tyr Phe Ser Arg Leu130 135 140Cys Ala Lys Gly Asp Ile Pro Gly Pro Leu Arg Ala Leu Pro Arg Tyr145 150 155 160Arg Leu Leu Arg Asp Leu Pro Arg Leu Leu Arg Ala Leu Asp Ala Arg165 170 175
Pro Ala Thr Leu Ala Thr Ser Trp Ser His Leu Gly Ala Lys Glu Cys180 185 190Leu Lys Ser Arg Leu Glu Leu Cys His Leu Leu Glu Leu Glu Ala Ala195 200 205Lys Asp Asp Tyr His Gly Ser Thr Asn Ser Pro Cys Gly Phe Ser Cys210 215 220Leu2252102211675212DNA213大鼠屬大鼠(Rattus norvegicus)4002agacacctgg ggctcttgat cctggcactg ctgggtctca ccactctact gggtgtagtt 60ctggtcctct tctgccggcg cctactgcca ggccccggtc gaacaaggcc agttttactc 120ctacacgcag cggactcaga ggcacagcga cgcctggtgg gagctttggc cgaactgctg 180cggaccgcgc tgggtggtgg acgcgacgtg atcgtggatc tctgggaagg gacgcacgtg 240gctcgcattg gaccactgcc atggctctgg gcagcacggg aacgcgtggc acgggagcag 300ggcactgtgt tgctcctttg gagctgtgcg ggccccagca ctgcctgcag cggcgacccg 360cagactgcac cccttcgcac cttgtcgtgc gctgctccac gccagctgct gctcgcctac 420ttcagtcgcc tctgtgccaa aggtgacatt cccgggccgc tgcgcgctct accgcgctac 480cgcctgcttc gtgatctgcc acgcctactg agagcgctgg atgctcgacc tgccacccta 540gccactagct ggagtcacct tggagctaag gagtgtttga aaagtcgcct ggagctgtgt 600cacctgctgg aactcgaggc tgccaaagac gactaccacg gttcaaccaa tagtccttgt 660ggcttcagtt gtctg 6752103211503212PRT213人工序列
220
223
4003Met Asp Lys Leu Arg Val Pro Leu Trp Pro Arg Val Gly Pro Leu Cys1 5 10 15Leu Leu Leu Ala Gly Ala Ala Trp Ala Pro Ser Pro Ser Leu Pro Asp20 25 30Pro Lys Phe Glu Ser Lys Ala Ala Leu Leu Ala Ser Arg Gly Ser Glu35 40 45Glu Leu Leu Cys Phe Thr Gln Arg Leu Glu Asp Leu Val Cys Phe Trp50 55 60Glu Glu Ala Ala Ser Ser Gly Met Asp Phe Asn Tyr Ser Phe Ser Tyr65 70 75 80Gln Leu Glu Gly Glu Ser Arg Lys Ser Cys Ser Leu His Gln Ala Pro85 90 95Thr Val Arg Gly Ser Val Arg Phe Trp Cys Ser Leu Pro Thr Ala Asp100 105 110Thr Ser Ser Phe Val Pro Leu Glu Leu Gln Val Thr Glu Ala Ser Gly115 120 125Ser Pro Arg Tyr His Arg Ile Ile His Ile Asn Glu Val Val Leu Leu130 135 140Asp Ala Pro Ala Gly Leu Leu Ala Arg Arg Ala Glu Glu Gly Ser His145 150 155 160Val Val Leu Arg Trp Leu Pro Pro Pro Gly Ala Pro Met Thr Thr His165 170 175Ile Arg Tyr Glu Val Asp Val Ser Ala Gly Asn Arg Ala Gly Gly Thr180 185 190Gln Arg Val Glu Val Leu Glu Gly Arg Thr Glu Cys Val Leu Ser Asn195 200 205Leu Arg Gly Gly Thr Arg Tyr Thr Phe Ala Val Arg Ala Arg Met Ala
210 215 220Glu Pro Ser Phe Ser Gly Phe Trp Ser Ala Trp Ser Glu Pro Ala Ser225 230 235 240Leu Leu Thr Ala Ser Asp Leu Asp Pro Leu Glu Phe Arg His Leu Gly245 250 255Leu Leu Ile Leu Ala Leu Leu Gly Leu Thr Thr Leu Leu Gly Val Val260 265 270Leu Val Leu Phe Cys Arg Arg Leu Leu Pro Gly Pro Gly Arg Thr Arg275 280 285Pro Val Leu Leu Leu His Ala Ala Asp Ser Glu Ala Gln Arg Arg Leu290 295 300Val Gly Ala Leu Ala Glu Leu Leu Arg Thr Ala Leu Gly Gly Gly Arg305 310 315 320Asp Val Ile Val Asp Leu Trp Glu Gly Thr His Val Ala Arg Ile Gly325 330 335Pro Leu Pro Trp Leu Trp Ala Ala Arg Glu Arg Val Ala Arg Glu Gln340 345 350Gly Thr Val Leu Leu Leu Trp Ser Cys Ala Gly Pro Ser Thr Ala Cys355 360 365Ser Gly Asp Pro Gln Thr Ala Pro Leu Arg Thr Leu Ser Cys Ala Ala370 375 380Pro Arg Gln Leu Leu Leu Ala Tyr Phe Ser Arg Leu Cys Ala Lys Gly385 390 395 400Asp Ile Pro Gly Pro Leu Arg Ala Leu Pro Arg Tyr Arg Leu Leu Arg405 410 415Asp Leu Pro Arg Leu Leu Arg Ala Leu Asp Ala Arg Pro Ala Thr Leu420 425 430Ala Thr Ser Trp Ser His Leu Gly Ala Lys Glu Cys Leu Lys Ser Arg435 440 445Leu Glu Leu Cys His Leu Leu Glu Leu Glu Ala Ala Lys Asp Asp Tyr450 455 460His Gly Ser Thr Asn Ser Pro Cys Gly Phe Ser Cys Leu Ser Arg Gly
465 470 475 480Pro Phe Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Met His Thr485 490 495Gly His His His His His His50021042111512212DNA213人工序列220
223
4004atggacaaac tcagggtgcc cctctggcct cgggtaggcc ccctctgtct cctacttgct 60ggggcagcct gggcaccttc acccagcctc ccggacccca agtttgagag caaagcggcc 120ctgctggcat cccggggctc cgaagaactt ctgtgcttca cccaacgctt ggaagacttg 180gtgtgtttct gggaggaagc ggcgagctcc gggatggact tcaactacag cttctcatac 240cagctcgagg gtgagtcacg aaagtcatgt agcctgcacc aggctcccac cgtccgcggc 300tccgtgcgtt tctggtgttc actgccaaca gcggacacat cgagttttgt gccgctggag 360ctgcaggtga cggaggcgtc cggttctcct cgctatcacc gcatcatcca tatcaatgaa 420gtagtgctcc tggacgcccc cgcggggctg ctggcgcgcc gggcagaaga gggcagccac 480gtggtgctgc gctggctgcc acctcctgga gcacctatga ccacccacat ccgatatgaa 540gtggacgtgt cggcaggcaa ccgggcagga gggacacaaa gggtggaggt cctggaaggc 600cgcactgagt gtgttctgag caacctgcgg ggcgggacgc gctacacctt cgctgttcga 660gcgcgcatgg ccgagccgag cttcagcgga ttctggagtg cctggtctga gcccgcgtca 720ctactgaccg ctagcgacct ggaccctctc gaattcagac acctggggct cttgatcctg 780gcactgctgg gtctcaccac tctactgggt gtagttctgg tcctcttctg ccggcgccta 840ctgccaggcc ccggtcgaac aaggccagtt ttactcctac acgcagcgga ctcagaggca 900cagcgacgcc tggtgggagc tttggccgaa ctgctgcgga ccgcgctggg tggtggacgc 960gacgtgatcg tggatctctg ggaagggacg cacgtggctc gcattggacc actgccatgg1020
ctctgggcag cacgggaacg cgtggcacgg gagcagggca ctgtgttgct cctttggagc1080tgtgcgggcc ccagcactgc ctgcagcggc gacccgcaga ctgcacccct tcgcaccttg1140tcgtgcgctg ctccacgcca gctgctgctc gcctacttca gtcgcctctg tgccaaaggt1200gacattcccg ggccgctgcg cgctctaccg cgctaccgcc tgcttcgtga tctgccacgc1260ctactgagag cgctggatgc tcgacctgcc accctagcca ctagctggag tcaccttgga1320gctaaggagt gtttgaaaag tcgcctggag ctgtgtcacc tgctggaact cgaggctgcc1380aaagacgact accacggttc aaccaatagt ccttgtggct tcagttgtct gtctagaggg1440cccttcgaac aaaaactcat ctcagaagag gatctgaata tgcataccgg tcatcatcac1500catcaccatt ga151權利要求
1.大鼠IL-17RE跨膜區和胞內區的多肽，是具有下述胺基酸殘基序列之一的多肽1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID №1的胺基酸殘基序列經過一至十個胺基酸殘基的取代、缺失或添加且通過激活RAS/MAPK信號通路而具有促有絲分裂作用的多肽。
2.編碼權利要求1所述大鼠IL-17RE跨膜區和胞內區多肽的基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №1的DNA序列；3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
3.含有權利要求2所述基因的表達載體、轉基因細胞系和宿主菌。
4.包括鼠源紅細胞生成素受體胞外區和權利要求1所述的大鼠IL-17RE跨膜區和胞內區多肽的融合蛋白，是具有下述胺基酸殘基序列之一的蛋白質1)序列表中的SEQ ID №3；2)將序列表中SEQ ID №3的胺基酸殘基序列經過一至十個胺基酸殘基的取代、缺失或添加且通過激活RAS/MAPK信號通路而具有促有絲分裂作用的蛋白質。
5.根據權利要求4所述的融合蛋白，其特徵在於所述融合蛋白具有序列表中SEQ ID №3的胺基酸殘基序列。
6.編碼權利要求4所述的融合蛋白的基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №4的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №3的DNA序列；3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №4限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
7.根據權利要求7所述的基因，其特徵在於所述基因具有序列表中SEQ ID №4的DNA序列。
8.含有權利要求6所述基因的表達載體、轉基因細胞系和宿主菌。
9.根據權利要求8所述的轉基因細胞系，其特徵在於所述轉基因細胞系是BaF3-EPOR/rIL-17RE CGMCC No.1530。
全文摘要
本發明公開了大鼠IL－17RE跨膜區和胞內區多肽及其編碼序列、融合蛋白與細胞系。該多肽具有下述胺基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID №1的胺基酸殘基序列經過一至十個胺基酸殘基的取代、缺失或添加且通過激活RAS/MAPK信號通路而具有促有絲分裂作用的多肽。包括鼠源紅細胞生成素受體胞外區和上述多肽的融合蛋白具有下述胺基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID №3；2)將序列表中SEQ ID №3的胺基酸殘基序列經過一至十個胺基酸殘基的取代、缺失或添加且通過激活RAS/MAPK信號通路而具有促有絲分裂作用的蛋白質。本發明所提供的在醫學和生物製藥領域具有較大的實際意義和廣闊的應用前景。
文檔編號C12N5/10GK1793176SQ20051012322
公開日2006年6月28日 申請日期2005年11月15日 優先權日2005年11月15日
發明者劉力, 李鐵石, 李雪妮, 傅新元, 常智傑, 張淑平 申請人:清華大學