基因分型晶片及其製備方法與應用的製作方法

2023-09-17 12:22:20 1

專利名稱：基因分型晶片及其製備方法與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物晶片及其製備方法與應用，特別是涉及一種基因分型晶片及其製備方法與其在對基因多態性位點進行基因型檢測中的應用。
背景技術：
生物晶片(也叫微陣列)技術最近幾年得到飛速發展(Fodor et al.，Science251767-773(1991)；Marshall et al.，Nat.Biotechnol.1627-31(1998))。應用生物晶片檢測基因表達信息的最主要優勢之一就是高通量。例如，廣泛使用的cDNA晶片，能夠同時檢測一個樣品多個基因的表達情況。當多個探針被固定在晶片表面，用於檢測某一樣品中某些特定的靶分子時，這種晶片稱為反向雜交晶片。另一方面，晶片也能用於同時檢測不同樣品中相同的靶分子。當被檢測的多個樣品被固定在晶片表面，用一個或多個探針檢測多個樣品中某些特定的靶分子時，這種晶片稱為正向雜交晶片。
陽性對照和陰性對照的正確選擇對於正向雜交的成功非常關鍵。通常情況下，為了獲得想要的信息，一個典型的正向雜交反應需要多種檢測探針。這就給晶片的設計及其實驗結果的正確分析帶來了困難。此外，由於用於正向雜交的靶分子通常是核酸樣品通過傳統PCR方法擴增獲得的產物，所以正向雜交的敏感性有時會受到傳統PCR方法擴增效率的限制。
「多態性位點」或「多形性位點」，是指基因座位上特定的核酸位點，這些位點的核酸在不同群體當中可以不同。核酸序列的多態性也有多種形式。例如，單個或多個鹼基的置換或多形性，鹼基的缺失或插入。「基因分型」或「基因型檢測」，是指鑑定或檢測在多態性位點上的明確變化(如核酸序列的改變)。
「擴增」是指能夠優先增加樣品中含多態性位點的那一段核酸序列的任意一種方式。核酸「擴增」指的是能導致核酸片段一個或多個拷貝形成的方法，這種方法最好是能使核酸片段呈指數倍增加。已知的此類方法有DNA特定序列的酶催化擴增反應，其中之一就是普遍應用的聚合酶鏈式反應(PCR)(Saiki et al.，1986，Science2301350-1354.)。
不對稱PCR是一種快速擴增單鏈核酸的方法。不對稱PCR與普通PCR不同，普通PCR反應中所用的一對引物濃度相同，而不對稱PCR中一條引物濃度被升高到另一引物濃度的幾倍乃至幾十倍。這樣低濃度引物首先被耗盡，後續的PCR反應依靠剩餘的高濃度引物進行，繼而產生大量的對應於高濃度引物的DNA鏈。與此類似，在通過溫度控制的不對稱PCR(其代表另一種特定類型的不對稱PCR)中，一對Tm值差異至少10℃的引物被使用。其最初的PCR反應在Tm值低的引物也能進行退火的條件下進行，後面的PCR反應在僅Tm值高的引物才能進行退火的條件下進行。不對稱PCR導致僅互補鏈中的一條鏈被大量擴增。
PCR反應中用到的引物可以是10-50bp不同長度的核酸片段，通常為至少15個核苷酸，從而保證擴增的特異性。一般情況下，雜交引物與特定核酸序列互補的部分(或引物結合位點)需要佔到引物核酸序列的90％，最好是95％或100％。通常寡核苷酸引物雜交部分的核酸序列至少為10個核苷酸，理想的最少是15個核苷酸，或20-50個核苷酸，從而儘可能的減少隨機、非特異性雜交反應的發生。此外，引物5』末端的核酸序列可以含有不與樣品或參考樣品發生互補雜交的序列，其長度可以是1-60、5-30，或8-30個核苷酸。因為這些序列對所有PCR擴增產物來說是相同的，它們可以作為對雜交信號進行歸一化處理的靶點。
位於人6號染色體短臂的HLA(人白細胞抗原)基因複合體是主要組織相容性複合物(MHC)的一部分。這些基因編碼調節細胞間免疫應答的細胞表面蛋白。多種多樣的I類HLA座位編碼HLA抗原，即44000道爾頓的多肽，其與細胞表面β2微球蛋白相連接。這些I類HLA分子參與細胞毒素T淋巴細胞介導的靶細胞識別過程。II類HLA座位編碼細胞表面異源二聚體，分別由29000及34000道爾頓的蛋白組成。這些II類HLA分子參與輔助T淋巴細胞介導的靶細胞識別過程。
I類HLA基因中的HLA-A，HLA-B，HLA-C座位以及II類HLA基因中的HLA-DRB，HLA-DQB，HLA-DQA，HLA-DPB及HLA-DPA座位具有高度多態性。世界衛生組織HLA體系命名委員會認定了25個HLA-A等位基因(HLA-A-0101，A-0201等)、32個HLA-B等位基因、11個HLA-C等位基因、43個HLA-DRB等位基因、13個HLA-DQB等位基因、8個HLA-DQA等位基因、4個HLA-DPA等位基因及19個HLA-DPB等位基因(Marsh andBodmer，Immun.Genetics，31131(1990))。這種高度多態性被認為與HLA分子的功能有關。HLA基因分型在人組織器官移植、疾病診斷治療、司法鑑定、免疫學和遺傳性研究方面具有重要作用。

發明內容
本發明的目的是提供一種對多個核酸樣品的基因多態性位點的基因型進行檢測的生物晶片。
本發明所提供的基因分型晶片，包括一套來自待測樣品的核酸片段及另一套來自多個參考樣品的核酸片段；所述核酸片段均是在完全相同的條件下，分別擴增待測樣品與參考樣品中含有多態性位點的基因片段得到的；核酸片段固定於晶片表面，且每個參考樣品都含有一個已知基因型的多態性位點。
上述基因分型晶片每個參考樣品都含有一個已知基因型的多態性位點，以其作為陽性對照來檢測樣品的基因型。並且每個參考樣品所含有的已知基因型的多態性位點各不相同，因而該晶片能為多種不同的探針提供陽性對照。本發明的晶片尤其適用於使用多個不同探針對具有不同基因型、不同多態性位點的多個樣品的檢測。
所述樣品是指預測含有目的核酸序列的材料。待測樣品可以是多種多樣的，包括生物流體，如血、血清、血漿、唾液、淋巴液、精液、陰道液、糞便、尿液、脊髓等；生物組織，如頭髮、皮膚等；以及細胞培養類、植物、食品和法醫樣品等其它樣品。必要時，可對樣品用常規方法進行預處理，即用試劑溶解樣品及/或將其中的核酸釋放出來。此外，所用樣品也可未經處理直接從目的材料中獲得，這些材料包括細菌、病毒、植物、哺乳動物(如人、靈長類動物、牛、馬、犬、貓、豬、綿羊等)等。
核酸可以是複雜混合物(如生物樣品)的一小部分，也可以是從生物樣品中分離或通過純化獲得的。「分離」或「純化」核酸分子，是指將自然條件下存在於生物體內的核酸分子游離出來，使其呈完全自由的狀態存在。所述完全自由狀態指分子中至少有50％，優選為70％、80％或90％呈游離狀態存在。
所述「核酸」等同於「多聚核苷酸」，是指任意核酸，無論是由脫氧核苷還是由核苷組成，無論這些核酸之間是通過磷酸二酯連接還是通過修飾過的分子(如磷酸三酯、氨基磷酸酯、矽氧烷、碳酸鹽、羧甲基、乙醯酸鹽、氨基甲酸鹽、硫醚、橋氨基磷酸酯、橋甲基磷酸酯、磷酸硫酸鹽、甲基磷酸鹽、二硫代磷酸鹽、橋磷酸硫酸鹽或磺基等)連接都可；此外，還可為經至少一個糖基修飾過的，所述糖基可以是阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木酮糖或己糖等。所述核酸可以是DNA、RNA、cDNA、DNA-RNA、肽核酸(PNA)、雜合子或混合物，並可以以雙鏈、單鏈或部分雙鏈的形式存在。
所述晶片能夠檢測多個樣品基因多態性位點的基因型，如至少可用於檢測2、3、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500或1000份樣品中任意一份樣品的基因型。
所述來自樣品的核酸片段只要包括能用於基因分型的多態性位點即可，其長度是任意的，如10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000bp等。所述核酸片段還可包括有多個多態性位點，如2個、3個、4個、5個或6個等。
所述晶片包含來自樣品的至少10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000個核酸片段。這些核酸片段大部分各不相同，如來自不同樣品或同一樣品不同區域的核酸片段。其中一些核酸片段可能是相同的，如來自同一樣品的同一區域的擴增產物被固定在晶片上不同的(如2、3、4或5個等)位點上，從而增加檢測的精確度。
所述固定在晶片表面的核酸片段可通過傳統PCR(即對稱PCR)、套式PCR或不對稱PCR的方法擴增得到，優選為不對稱PCR的方法。通過傳統或套式PCR擴增得到的核酸片段為典型的雙鏈核酸片段，這些核酸片段在被固定到晶片表面前，需通過變性步驟(如熱變性)使其形成部分單鏈。而採用不對稱PCR的方法，能夠獲得較高濃度的單鏈核酸產物，而高濃度的單鏈核酸產物在晶片雜交時能產生更強的雜交信號和更高的雜交效率，特別適用於基因多態性位點的基因型檢測。
本發明的晶片可用於I類或II類HLA(人白細胞抗原)基因多態性位點基因型的檢測。所述HLA基因包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB、HLA-DQB、HLA-DQA、HLA-DPB及HLA-DPA。包含上述HLA基因中任一基因的核酸片段可用上述方法製備。
為檢測樣品中目標核酸的基因型，可將目標核酸與對照核酸相比較。「對照」指已知其多態性位點基因型的已知樣品。對照(參考樣品)可以是自然存在的樣品，也可以是自然存在樣品的人工修飾產物。例如，對照可以是以本發明描述的方法或其它目前已知的方法已經作過基因分型的樣品。
作為本發明的一個方面，所述生物晶片包括來源於多個參考樣品的第二套核酸片段。其典型特徵是，第二套核酸片段與部分或全部來源於多個樣品的第一套核酸片段相關。如果核酸片段是同樣的，或不能確定兩序列間(如多態性位點)的差異，則核酸片段間可以是相關的。
第二套核酸片段用參考樣品製備得到，並採用與製備待測樣品核酸片段相同的擴增方法及條件。例如，相同的引物可用於待測樣品和參考樣品的擴增反應中。擴增反應也可以採用相同的熱循環。由於第二套核酸片段的製備方法與第一套核酸片段製備方法相同，由整個環境導致的不同樣品間的變化可以降到最低。因而參考樣品，特別是來源於參考樣品的核酸片段，能夠作為待測樣品的很好的陽性對照。此外，對於每一個用於檢測特定基因型的探針，除了特定基因型的參考樣品(特別是來源於參考樣品的核酸片段)，包含已知基因型的參考樣品(特別是來源於參考樣品的核酸片段)也能夠很好地作為檢測的陰性對照。這樣，所有參考樣品能夠整體地作為一個很好的指示器來監測生物晶片體系是否以預期的方式在起作用。
來源於參考樣品的核酸片段只要包括已知基因型所在的多態性位點即可，其長度是任意的，如10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000bp等。通常情況下，參考樣品的核酸片段僅包含一個多態性位點，但也可包括有多個多態性位點，如2個、3個、4個、5個或6個等。
所述晶片可包含來源於參考樣品的至少10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000種核酸片段。這些核酸片段大部分各不相同，如來自不同參考樣品或同一參考樣品不同區域的核酸片段。其中一些核酸片段可能是相同的，如來自同一參考樣品的同一區域的擴增產物被固定在晶片上不同的(如2、3、4或5個等)位點上，從而增加檢測的精確度。這些核酸片段可以是雙鏈或單鏈的。
所述晶片還可包含來源於多個參考樣品的核酸片段，參考樣品的最少數目可為10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100。
當本發明的晶片用於I類或II類HLA(人白細胞抗原)基因多態性位點基因型的檢測時，參考樣品為不同的HLA標準樣品。多種多樣的HLA標準樣品為目前所知的標準樣品。例如，國際HLA資料庫(http//www.ebi.ac.uk/imgt/hla)提供了多種HLA標準樣品的信息。
本發明的第二個目的是提供一種上述基因分型晶片的製備方法。
本發明所提供的製備方法，包括以下步驟1)用PCR方法擴增待測樣品和參考樣品中含有多態性位點的特定區域，得到一套核酸片段；2)將步驟1)獲得的核酸片段固定在微陣列基片上，得到基因分型晶片。
所述PCR方法優選為不對稱PCR方法。不對稱PCR擴增所用的上遊引物及下遊引物的摩爾比率可為1∶12.5-100，優選的摩爾比率為1∶12.5。不對稱PCR擴增的循環數至少為30個，優選的循環數為30-40個。
本發明的晶片可用於HLA(人白細胞抗原)基因多態性位點基因型的檢測，包括I類或II類HLA基因多態性位點的基因型檢測。所述HLA基因包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB、HLA-DQB、HLA-DQA、HLA-DPB及HLA-DPA。當檢測HLA-DRB基因多態性位點的基因型時，晶片上固定的核酸片段是HLA基因複合體中的HLA-DRB基因片段，該核酸片段可由下述引物對(序列表中的SEQ ID №1和SEQ ID №2)擴增得到上遊引物(PMH_0303047a)5』-GATCCTTCGTGTCCCCACAGCAC-3』下遊引物(PMH_0303048d)5』-CGCTGCACTGTGAAGCTCTCAC-3』。
本發明所提供的晶片還可包括更多的對照。例如，當樣品是核酸樣品時，晶片上可以包括雜交反應的陽性對照。其雜交反應的陽性對照可以是包含探針所對應目標位點的任意核酸。由陽性對照位點產生的陽性信號將顯示出雜交反應是成功的。在這點上，雜交反應的陽性對照不同於來源於對照樣品的核酸片段。因為，來源於對照樣品的核酸片段典型地相關於來源於樣品的核酸片段，而雜交反應的陽性對照可以是任意不相關的分子，只要其能夠被探針識別即可。晶片還可以包括空白對照，如空白緩衝液等，以及針對於固定步驟的質量對照，如將一種經標記的寡核苷酸探針固定於晶片表面，此探針信號可以作為固定質量的指示器。
本發明的生物晶片可以是目前所知的任一種生物晶片，其形式包括膜生物晶片(如硝化纖維膜，尼龍膜)、過濾器生物晶片、針生物晶片和微珠生物晶片(如在一液體的漿狀物中)等。本質上而言，能夠經受特定表達分析試驗所需的試劑及反應條件的任意固相支持物都可以被採用。例如，職能化玻璃、矽、二氧化矽、修飾矽、玻璃、石英玻璃、塑料、陶瓷、橡膠、金屬、任意種類聚合體，如(聚)四氟乙烯、偏二氟乙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、或其中的聯合體都可以作為固相晶片的基質。
可採用目前已知的多種方法將樣品及對照樣品固定於晶片表面，如可利用化學反應基團或者生物分子將前述的核酸片段固定於晶片基質表面。所述化學反應基團，如-CHO、-NH2、-SH、-S-S-、環氧基和甲苯磺醯基等；生物分子如生物素、鏈黴親和素、親和素、his-tag、strept-tag、組氨酸以及蛋白A等。較為典型的方法是，將核酸樣品與二甲基亞碸等量混合併放入多孔微量滴定板中，滴定板可放置於Gen III晶片點樣儀中並在表面矽烷化的光學玻璃基片上點樣，然後將基片空氣乾燥，再經紫外線照射即可。用此方法製備的晶片可以立即使用，也可乾燥儲存待用。
本發明的另一個目的是提供一種應用上述基因分型晶片對多個樣品的基因多態性位點進行基因型檢測的方法。
本發明所提供的檢測方法，可包括以下步驟1)製備探針，所述探針至少能夠檢測一個參考樣品多態性位點的已知基因型；2)將一條經標記的探針與上述基因分型晶片雜交；3)將每個待測樣品的雜交信號與至少一個參考樣品的雜交信號進行比較，確定每個待測樣品在某個多態性位點的基因型。
在上述檢測方法中，通過將待測樣品的雜交信號與參考樣品的雜交信號進行比較確定每個樣品多態性位點某種基因型的存在與否。例如，如果探針能檢測出已知基因型的參考樣品的核酸片段，同時又檢測出一個待測樣品的核酸片段，那麼就可以確定待測樣品與參考樣品具有同樣的基因型。來源於每個待測樣品的核酸片段的雜交信號與至少一個參考樣品核酸片段的檢測信號相比較，通過總體的比較結果確定樣品的基因型。
所述探針可以是能夠檢測多態性位點基因型的任何分子。這些探針可包括能夠識別多態性位點的人工合成寡核苷酸、cDNA、RNA、PNA、蛋白或抗體。通常情況下，待測樣品為核酸時，所述探針可為一段單鏈核酸，包含有互補於具有特定基因型的多態性位點的序列。探針長度可以是適於檢測的任意長度，例如當探針是核酸時，其長度可為10-100bp。
探針被能夠產生可檢測信號的可檢測基團以直接或間接的方式標記。信號在檢測前也可以用現有已知方法進行放大。可檢測信號的出現顯示出樣品中相應靶標的存在。對探針進行標記的方式是多種多樣的，如放射標記、化學標記、酶學標記、發光標記、膠體金標記加銀染放大、磁珠標記、螢光共振能量轉移標記等。雜交信號在檢測前也可以進行進一步的放大。檢測方法為現有已知方法，例如，晶片可以被晶片掃描儀掃描，如被博奧生物公司的LuxScan 10K晶片掃描儀掃描。
當進行不同基因型的檢測時，多個探針(如2、3、4、5、6、7、8、9或10個等)可與晶片同時作用(如在幾分鐘內)，此時，不同的探針可以被不同的檢測基團直接或間接地標記，從而實現同時檢測；此外，多個探針還可與晶片作用於不同時間(如幾分鐘、幾天、幾周、幾月的時間間隔)，晶片可以被重複利用數次，即先以一個或一組特定的探針檢測靶標，經清洗、裸露、乾燥後，再以另外一個或一組探針檢測靶標。
上述檢測方法可用於檢測單核苷酸多態性(「SNP」)。HLA-B座位一個多態性位點的基因序列如圖7所示，其中一個單核苷酸序列差異可用上述方法檢測出來。這些序列也可用作探針以檢測其它多態性位點。
本發明提供了一種基因分型晶片。可用本發明的晶片對多個未知樣品的基因多態性位點進行簡單、精確的基因分型。該晶片製備方法簡便，具有工業化生產的可行性。本發明將在未知樣品的基因多態性位點的基因分型中發揮重要作用。
下面結合具體實施例對本發明作進一步說明。


圖1為玻璃基片上HLA樣品(圖中未標記)、HLA標準品(S1-S52)、QC(Hex)、PC和BC的排布樣式圖2為根據探針序列和HLA標準品的基因型得出的理論雜交圖譜圖3為真實的雜交圖譜圖4為不對稱PCR的反應原理5A為對稱PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果圖5B為不對稱PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果圖5C為套式PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果圖6為三種不同PCR反應產物的雜交信號柱形7為HLA-B座位一個多態性位點的基因序列具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法，所用引物及核酸序列均由上海博亞生物技術公司合成。
實施例1、對多個HLA樣品進行基因分型的晶片的製備及其檢測用酚-氯仿的方法從血樣抽提，得到85份待測DNA樣品。52份標準HLA樣品是從國際分型組織(也稱國際組織相容性工作組，IHWG)得到的，所述標準HLA樣品如表1所示
表1標準HLA樣品


用於擴增含有HLA-A位點的目的基因片段的引物序列如下HLA-AF(上遊引物)5』-GGCCTCCCCAGACGCCGAGGATGGC-3』HLA-AR(下遊引物)5』-CGGGTCCCGTGGCCCCTGGTACCC-3』。
然後，分別以待測樣品和標準HLA樣品為模板，在上述引物的引導下，進行常規不對稱PCR擴增。反應結束後，回收並純化PCR擴增產物，將其固定在表面矽烷化的光學玻璃基片上。此外，點在玻璃基片上的核酸片段還有用於對固定化過程進行質量控制的質控探針(QC)，其序列為5』-TTTTTTTTTTTGTCTTCCACCAGGAGTCAGCAG-3』(HEX)，用於對雜交過程進行質控的陽性質控探針(PC)，其序列為5』-TTTTTTTTTTAAAGTTAAAGCAGACCGAAGTGGATTGCGAGTATTTGAAAAGATGTGTTGAGAAATTAACGGAAGAGAA-3』，空白陰性對照(BC)，其成分是50％DMSO。玻璃基片上HLA樣品(圖中未標記)、HLA標準品(S1-S52)、QC(Hex)、PC和BC的排布樣式如圖1所示。
將一條oligo探針(濃度20nM)和上述製備的晶片進行雜交，探針序列為(A07601)5』-CCGAGCGAACCTGGGGACC-3』，根據探針序列和HLA標準品的基因型得出的理論雜交圖譜如圖2所示，真實的雜交圖譜如圖3所示，所有QC、PC、BC和HLA標準品的真實雜交圖譜都和理論預期的完全一致。另外，在未知樣品中有些樣品顯示出了陽性信號，表明它們和顯示陽性信號的標準HLA樣品含有相同的一段基因序列，基因型相同。
實施例2、對多個HLA樣品的HLA-DRB1位點進行基因分型的晶片的製備及檢測不同PCR方法對檢測結果的影響本實施例主要檢測對稱PCR、不對稱PCR和套式PCR三種不同的PCR方法對本發明晶片檢測結果的影響。所用標準HLA樣品購自國際分型組織(IHWG)。分別用對稱PCR、不對稱PCR和套式PCR擴增標準HLA樣品的含有HLA-DRB1位點的核酸片段，三種PCR所用的引物序列如下對稱PCR引物PMH-DF(上遊引物)5』-GATCCTTCGTGTCCCCACAGCAC-3』PMH-DR(下遊引物)5』-CGCTGCACTGTGAAGCTCTCAC-3』；不對稱PCR引物PMH_0303047a(上遊引物)5』-GATCCTTCGTGTCCCCACAGCAC-3』PMH_0303048d(下遊引物)5』-CGCTGCACTGTGAAGCTCTCAC-3』；套式PCR(NP-PCR)引物PMH-HLA-DF(上遊引物)5』-CCGGATCCTTCGTGTCCCCACAGCACG-3』PMH-HLA-DRU(下遊引物)5』-TCACTTGCTTCCGTTGAGGCCGCTGCACTGTGAAGCTCT-3』；通用引物PMH-HLA-U15』-TCACTTGCTTCCGTTGAGG-3』。
以標準HLA樣品為模板，並分別在上述不同引物對的引導下，進行PCR擴增。對稱PCR反應體系為(100μl)10×PCR緩衝液10μl，2.5mM dNTP 8μl，10μM上、下遊引物各4μl，5U/μl Taq 1μl，模板DNA 1μl，ddH2O 72μl。對稱PCR反應條件為先96℃3分鐘，96℃25秒，66℃30秒，72℃30秒，共30個循環；然後72℃5分鐘；最後4℃保溫。不對稱PCR反應體系為(100μl)10×PCR緩衝液10μl，2.5mM dNTP 8μl，50μM上遊引物4μl，1μM下遊引物16μl，5U/μl Taq 1μl，模板DNA 1μl，ddH2O 60μl。不對稱PCR反應條件為先96℃3分鐘，96℃25秒，66℃30秒，72℃30秒，共40個循環；然後72℃5分鐘；最後4℃保溫。套式PCR反應體系為(100μl)10×PCR緩衝液10μl，2.5mM dNTP 8μl，10μM上、下遊引物各3μl，50μM通用引物2μl，5U/μl Taq 1μl，模板DNA 1μl，ddH2O 72μl。套式PCR反應條件為先96℃3分鐘，96℃25秒，66℃30秒，72℃30秒，共25個循環；然後96℃25秒，50℃30秒，72℃30秒，共15個循環；最後72℃5分鐘，4℃保溫。不對稱PCR的反應原理圖如圖4所示，在不對稱PCR反應的前20-25個循環中，上、下遊引物(引物A和引物B)產生雙鏈DNA。單鏈DNA一般在25個循環後的反應中產生，此時限制性的引物B已經基本消耗完畢，體系中只剩下引物A，使得單鏈DNA(ssDNA)呈線性快速積累。本實施例不對稱PCR反應中的上、下遊引物比例是200pmol∶16pmol，經過35-40個循環有2-6pmol的單鏈DNA產物產生。反應結束後，回收三種PCR反應的擴增產物，並用PCR產物純化試劑盒(編號03010，Millipore，麻薩諸塞州)進行純化，對純化產物進行的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖5A-圖5C所示(泳道M表示DL2000 DNA marker(Takara，Bio Inc Dalian，China)；圖5A和圖5C中的泳道N表示空白對照；圖5A中的泳道Sym表示對稱PCR擴增產物；圖5B中的泳道4-1，4-2，4-3，4-4表示不對稱擴增的四次重複，泳道4-N表示空白對照；圖5C中的泳道Tao-1和Tao-2表示套式PCR擴增的兩次重複)，檢測結果表明不對稱PCR能顯著提高PCR產物中的單鏈分子的量。將純化的三種PCR產物溶解於50％DMSO中，然後將其固定在氨基修飾的玻片(AminoSlideTM，博奧公司，北京)表面，每種PCR產物分別按100ng/ul、150ng/ul和200ng/ul的濃度進行固定，固定化是通過紫外交聯儀(Bio-Rad)進行的。然後將一條探針(濃度50nM)和上述製備的晶片進行雜交，探針序列如下通用探針Cy55』-CGACAGCGACGTGGGGGA-3』；特異性探針TAMRA5』-AGaGGAGGCGGGCCGCCGAGG-3』探針在與基因晶片雜交前用螢光素TAMRA和Cy5進行標記(由上海博亞生物技術公司合成)，雜交後的晶片經過洗滌後用晶片掃描儀(GSI Lumonics)進行檢測，檢測結果如圖6所示(每一種PCR反應柱形圖中的3條柱分別代表固定在晶片上的三種不同濃度的PCR產物，分別為100ng/ul、150ng/ul和200ng/ul)，表明不對稱PCR產物的雜交信號顯著高於傳統PCR和套式PCR方法得到的PCR產物，故將不對稱PCR定為製備本發明晶片時優選的核酸片段的擴增方式。
序列表1602210121123212DNA213人工序列220
223
4001gatccttcgt gtccccacag cac 23210221122212DNA213人工序列220
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4002cgctgcactg tgaagctctc ac 2權利要求
1.一種基因分型晶片，包括一套來自待測樣品的核酸片段及另一套來自多個參考樣品的核酸片段；所述核酸片段均是在完全相同的條件下，分別擴增待測樣品與參考樣品中含有多態性位點的基因片段得到的；核酸片段固定於晶片表面，且每個參考樣品都含有一個已知基因型的多態性位點。
2.根據權利要求1所述的基因分型晶片，其特徵在於所述參考樣品為雙鏈或單鏈核酸。
3.根據權利要求1所述的基因分型晶片，其特徵在於所述參考樣品中至少有一個是自然存在的樣品。
4.根據權利要求1所述的基因分型晶片，其特徵在於所述參考樣品中至少有一個是自然存在樣品的人工修飾產物。
5.根據權利要求1所述的基因分型晶片，其特徵在於所述另一套來自多個參考樣品的核酸片段至少來自於10個參考樣品。
6.根據權利要求5所述的基因分型晶片，其特徵在於所述另一套來自多個參考樣品的核酸片段至少來自於30個參考樣品。
7.根據權利要求6所述的基因分型晶片，其特徵在於所述另一套來自多個參考樣品的核酸片段至少來自於50個參考樣品。
8.根據權利要求1所述的基因分型晶片，其特徵在於所述來自待測樣品的核酸片段及另一套來自多個參考樣品的核酸片段均為包含某個HLA基因的多態性位點的核酸片段。
9.根據權利要求8所述的基因分型晶片，其特徵在於所述HLA基因包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB、HLA-DQB、HLA-DQA、HLA-DPB和HLA-DPA。
10.根據權利要求8或9所述的基因分型晶片，其特徵在於所述參考樣品為HLA的標準樣品。
11.根據權利要求1所述的基因分型晶片，其特徵在於所述來自多個參考樣品的核酸片段中至少有兩個來自於同一個參考樣品。
12.根據權利要求1所述的基因分型晶片，其特徵在於所述基因分型晶片中的核酸片段是用不對稱PCR方法擴增的。
13.一種權利要求1所述的基因分型晶片的製備方法，包括以下步驟1)用PCR方法擴增待測樣品和參考樣品中含有多態性位點的特定區域，得到一套核酸片段；2)將步驟1)獲得的核酸片段固定在微陣列基片上，得到基因分型晶片。
14.根據權利要求13所述的製備方法，其特徵在於所述固定在微陣列基片上的核酸片段還包括一個或多個來自雜交反應陽性對照、雜交反應陰性對照和固定化質控對照的核酸片段。
15.根據權利要求13或14所述的製備方法，其特徵在於所述核酸片段是用不對稱PCR方法擴增得到的。
16.根據權利要求15所述的製備方法，其特徵在於所述不對稱PCR擴增所用的上遊引物及下遊引物的摩爾比率為1∶12.5-100。
17.根據權利要求16所述的製備方法，其特徵在於所述不對稱PCR擴增所用的上遊引物及下遊引物的摩爾比率為1∶12.5。
18.根據權利要求15所述的製備方法，其特徵在於所述不對稱PCR擴增的循環數為30-40個。
19.根據權利要求15所述的製備方法，其特徵在於所述來自待測樣品的核酸片段及來自多個參考樣品的核酸片段為包含某個HLA基因的多態性位點的核酸片段。
20.根據權利要求19所述的製備方法，其特徵在於所述HLA基因包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB、HLA-DQB、HLA-DQA、HLA-DPB和HLA-DPA。
21.根據權利要求20所述的製備方法，其特徵在於所述HLA基因為HLA-A基因。
22.根據權利要求21所述的製備方法，其特徵在於所述用於擴增待測樣品和參考樣品包含HLA-A基因的多態性位點的核酸片段的引物為序列表中的SEQ ID №1和SEQ ID №2。
23.一種用權利要求1所述的基因分型晶片對多個樣品的基因多態性位點進行基因型檢測的方法，包括以下步驟1)製備探針，所述探針至少能夠檢測一個參考樣品多態性位點的已知基因型；2)將一條經標記的探針與上述基因分型晶片雜交；3)將每個待測樣品的雜交信號與至少一個參考樣品的雜交信號進行比較，確定每個待測樣品在某個多態性位點的基因型。
24.根據權利要求23所述的檢測方法，其特徵在於所述探針的數目至少為2個。
25.根據權利要求24所述的檢測方法，其特徵在於所述多個探針同時和晶片進行雜交。
26.根據權利要求24所述的檢測方法，其特徵在於所述多個探針先後連續地和晶片進行雜交。
27.根據權利要求23所述的檢測方法，其特徵在於所述探針為單鏈核酸。
28.根據權利要求23所述的檢測方法，其特徵在於所述探針是用不對稱PCR方法擴增得到的。
29.根據權利要求28所述的檢測方法，其特徵在於所述不對稱PCR擴增所用的上遊引物及下遊引物的摩爾比率為1∶12.5-100。
30.根據權利要求29所述的檢測方法，其特徵在於所述不對稱PCR擴增所用的上遊引物及下遊引物的摩爾比率為1∶12.5。
31.根據權利要求28或29或30所述的檢測方法，其特徵在於所述不對稱PCR擴增的循環數為30-40個。
全文摘要
本發明公開了一種基因分型晶片及其製備方法與應用。其目的是提供一種基因分型晶片及其製備方法與其在對基因多態性位點進行基因型檢測中的應用。該晶片包括一套來自待測樣品的核酸片段及另一套來自多個參考樣品的核酸片段；所述核酸片段均是在完全相同的條件下，分別擴增待測樣品與參考樣品中含有多態性位點的基因片段得到的；核酸片段固定於晶片表面，且每個參考樣品都含有一個已知基因型的多態性位點。本發明將在未知樣品的基因多態性位點的基因分型中發揮重要作用。
文檔編號C12Q1/68GK1834261SQ200510123228
公開日2006年9月20日 申請日期2005年11月15日 優先權日2005年11月15日
發明者高華方, 李澤, 王棟, 劉彥華, 劉湘, 江揚洲, 趙傳贊, 李麗, 蘭更欣, 過濤, 蔡斌, 邢婉麗, 周玉祥, 程京 申請人:北京博奧生物晶片有限責任公司, 清華大學