一種表面帶氨基、羧基和羥基多官能團的自發螢光的聚合物微球的製備的製作方法
2023-09-16 17:51:16
本發明涉及一種表面帶氨基、羧基和羥基官能團的自發螢光的聚合物微球及其製備方法，屬於高分子材料領域。該微球表面的多官能團為後續的螢光微球與蛋白等生物分子的結合提供位點，適用於作為示蹤和藥物載體等生物醫藥領域的應用。
背景技術：
螢光微球指直徑在納米或微米級範圍，負載有螢光物質，受外界能量刺激能發出螢光的固體顆粒。近年來發展起來的聚合物螢光微球由於粒度均一、單分散性好、穩定性好、發光效率高，微球表面弧度有利於抗原決定簇和抗體結合位點的暴露面處於最佳的反應狀態，因此在標記、示蹤、檢測、標準、固定化酶、免疫醫學、高通量藥物篩選、基因研究以及某些高新技術領域的基礎研究和應用方面引起廣泛的重視。
理想的螢光微球不僅要求能產生較強的螢光、微球尺寸均勻、粒徑分布窄、化學穩定性好、表面含有豐富的功能基團，且製備工藝簡單，價格便宜。目前螢光微球的製備方法主要分物理法和化學法。物理法是將螢光性物質，如螢光素、量子點或稀土離子等吸附在聚合物微球表面或包覆於其中。聶微等（瀋陽藥科大學學報，2013,30，329）以三氯甲烷和異丙醇為溶脹劑，吖啶橙和羅丹明為螢光素，通過溶劑逐漸揮發法對聚苯乙烯微球染色，製備粒徑為1-5μm的螢光微球。閆凱等（高分子學報，2013,11，1453）在種子磁性微球存在下，以對苯乙烯磺酸鈉、稀土配合物等功能單體，通過無皂種子乳液聚合製備磁性螢光微球。但物理方法製備的螢光微球存在大小不一、螢光物質分布不均以及易脫落等缺點。化學法是將螢光性材料接枝到微球表面，或將含螢光生色團的單體與其它可聚合單體通過懸浮聚合、乳液聚合以及分散聚合等方法獲得螢光微球。化學法製得的螢光微球各方面性能均較為穩定，能避免微球在應用過程中螢光物質的洩漏。顏曉梅等（Journal of Material Chemsity,2010,20,1179）通過分散聚合製備微米級的聚苯乙烯微球，之後再將螢光染料羅丹明6G和帶有羧基官能團的物質在聚苯乙烯種子微球表面共聚，形成核殼結構的螢光微球。然而，接枝法獲得的螢光微球其螢光物質是成點狀分布在微球表面。目前共聚法主要採用可聚合的螢光性單體與苯乙烯共聚，或共軛高分子聚合製備螢光微球。Sherman等（Langmuir, 2005, 21(11)，5218）使用乙烯基苄基（三甲基）-氯化銨對疏水性量子點進行修飾，後與苯乙烯共聚獲得複合螢光微球。範麗娟等（CN102643488B）將聚對苯乙烯撐前驅體溶液吸附在磺化的聚苯乙烯微球表面提供，在溶液中催化四氫噻吩基團消除，得到殼層材料為聚對苯乙烯撐共軛高分子螢光微球。但這類高分子螢光微球生物相容性較差，合成中用到的大量有機溶劑也不利於其在生物醫藥領域的應用，並且還需對微球表面進行官能化修飾的後處理步驟，以便後續的微球與蛋白等生物分子結合。
技術實現要素：
本發明的目的是為了克服現有技術存在的不足，提供一種可自發螢光，無毒性，表面帶有大量氨基、羧基，有利於下一步生物醫學應用的高分子微球及其製備方法。近年綠色螢光蛋白（GFP）作為一種無需底物、自身發光的蛋白為生物科學領域的應用帶來巨大影響。組成蛋白質的胺基酸中，酪氨酸發色團羥基連接在苯環上，使得酪氨酸不僅具有較強的螢光性，還具有多種反應活性。本發明方法以生物小分子酪氨酸為原料，形成油包水的均一乳液，然後升溫乳液縮聚形成初始微球，後經戊二醛固化，脫水得到顆粒尺寸為1-10微米，呈現良好單分散性、自發螢光的酪氨酸-縮甲醛微球。
本發明目的通過以下技術方案實現：本發明所述的表面帶氨基、羧基和羥基多官能團的自發螢光的聚合物微球的製備方法，其特徵在於包括以下步驟：
（1）酪氨酸水相溶液的配製：將一定比例的酪氨酸和草酸溶解在鹽酸溶液中，配製得到濃度為4-30wt%的酪氨酸溶液；然後加入適量乳化劑，混合乳化均勻即成水相，所述乳化劑為Tween20，用量為濃度為4-30wt%的酪氨酸溶液重量的0.3-2wt%；
（2）油相的配製：將乳化劑加入液體石蠟中，混合均勻，置於35 ～ 75℃恆溫水浴中配製得到油相；所述乳化劑為司盤80，用量為液體石蠟重量的0.5 ～ 2wt％ ；
(3) 乳化縮聚：在攪拌條件下採用注射器將步驟（1）獲得的水相滴加到步驟（2）獲得的油相中，水相與油相的體積比為(5 ～ 10) ∶ 1 ；乳化溫度為40 ～ 70℃，在500 ～ 7000r/min 下乳化10 ～ 30min，再逐滴加入一定量甲醛溶液，乳化縮聚10-24h後轉移到冰水浴中；
(4) 固化與脫水：繼續攪拌，向其中滴加適量戊二醛，繼續攪拌，用分液漏鬥緩慢滴加入無水異丙醇，滴加完畢之後，繼續攪拌3-6h，放置0.5-3h；
(5) 洗滌、分離、過篩與乾燥：傾去上清液，用無水異丙醇反覆清洗，抽濾，再用乙醚清洗數次；抽濾，真空乾燥，即得淡黃色微球乾粉。
步驟（1）所述的酪氨酸與草酸的物質的量比為1：（0.01~0.1）。
步驟（1）所述的鹽酸的濃度為0.1 -2 mol/L 。
步驟（3）所述的酪氨酸與甲醛物質的量比為1：（0.6-1.5）。
步驟（4）所述的戊二醛投加量與酪氨酸物質量比為（0.5-1.5）：1，異丙醇投加量為100-150mL。
本發明上述的方法製得的一種表面帶氨基、羧基和羥基多官能團的自發螢光的聚合物微球，其特徵在於：所述自發螢光的聚合物微球呈單分散分布，平均粒徑為0.1-20μm。
所述自發螢光的聚合物微球的激發波長為330-420nm，最大發射波長為510-540nm。
本發明所述的表面帶氨基、羧基和羥基多官能團的自發螢光的聚合物微球的製備方法，具體地說包括以下步驟：
（1）配製水相：將一定比例的酪氨酸和草酸溶解在一定濃度的鹽酸溶液中，配製得到濃度為4-30wt%的酪氨酸溶液；然後加入適量乳化劑，混合乳化均勻即成水相，所述乳化劑為Tween20，用量為濃度為4-30wt%的酪氨酸溶液重量的0.3-2wt%；
（2）配製油相：將乳化劑加入液體石蠟中，混合均勻，置於35 ～ 75℃恆溫水浴中配製得到油相；所述乳化劑為司盤80，用量為液體石蠟重量的0.5 ～ 2wt％ ；
(3) 乳化：在攪拌條件下採用注射器將步驟（1）獲得的水相滴加到步驟（2）獲得的油相中，水相與油相的體積比為(5 ～ 10) ∶ 1 ；乳化溫度為40 ～ 70℃，在500 ～ 7000r/min 下乳化10 ～ 30min，再逐滴加入一定量甲醛溶液，乳化縮聚10-24h後轉移到冰水浴中；
(4) 固化與脫水：繼續攪拌，向其中滴加適量戊二醛，繼續攪拌3-5h，用分液漏鬥滴加無水異丙醇，每分鐘20 滴，滴加完畢之後，繼續攪拌3-6h，放置0.5-3h；
(5) 洗滌、分離與乾燥：傾去上清液，用異丙醇反覆清洗，抽濾，再用乙醚清洗數次；抽濾，乾燥，即得淡黃色微球乾粉。
所述的一種表面帶氨基、羧基和羥基多官能團的自發螢光的聚合物微球，其特徵在於：所述螢光微球呈單分散分布，粒徑可根據需要在0.1-20μm進行調控；螢光微球的激發波長為330-420nm，最大發射波長為510-540nm。
步驟（1）所述的酪氨酸與草酸的物質的量比為1：（0.01~0.1）。
步驟（1）所述的鹽酸濃度為0.1-2mol/L。
步驟（3）所述的酪氨酸與甲醛物質的量比為1：（0.6-1.5）。
步驟（4）所述的戊二醛投加量與酪氨酸物質量比為（0.5-1.5）：1，異丙醇投加量為100-150mL。
與現有技術相比，本發明具有以下優點：
（1）以多官能團的酪氨酸為螢光原料，通過乳液縮聚一步製備粒度分布較為均勻、可在0.1-20μm範圍調控的螢光微球，螢光物質分布均勻、性能穩定、不易洩漏與脫落。
（2）與先合成聚合物再通過乳化-凝聚法製備螢光微球工藝相比，該乳液縮聚一步製備螢光微球直接採用酪氨酸單體為原料，不受聚合物溶解性限制；製備過程通過改變酪氨酸溶液的濃度實現微球粒徑的調控，工藝簡單，反應過程易於控制，生產成本低，重現性好，適合工業化批量生產。
（3）本發明採用的螢光原料酪氨酸為人體組成蛋白質的重要成分，製備的酪氨酸縮甲醛微球不僅具有良好的生物相容性，而且合成的微球表面帶有大量的氨基、羧基和羥基多官能團，為微球的生物反應提供位點，有利於其在示蹤、藥物載體等生物醫藥領域的應用。
附圖說明
圖1為本發明實施例1所製備的酪氨酸縮甲醛螢光微球的FT-IR譜圖。
圖2為本發明實施例1所製備的酪氨酸縮甲醛螢光微球的SEM照片。
圖3為本發明實施例1所製備的酪氨酸縮甲醛螢光微球的發射光譜圖。
具體實施方式
下面結合具體實施例進一步闡述本發明，僅在於說明本發明而不是限制本發明的範圍。
實施例1
（1）稱取1.9g酪氨酸溶解在6mL 0.5mol/L HCl溶液中，加入0.05g草酸，攪拌，使之完全溶解。加入0.08g tween 20 ，攪拌，混合均勻；
（2）在500mL燒杯中加入100mL液體石蠟,加入2.25gspan 80，攪拌，混合均勻；
（3）在60℃條件下，將酪氨酸溶液用注射器緩慢滴加到含有span80 的100mL液體石蠟中，800r/min下乳化30min，逐滴加入2mL37 wt%甲醛溶液，乳化縮聚14h後轉移到冰水浴中；
(4)繼續攪拌，向其中滴加4mL 50wt%戊二醛溶液，繼續攪拌2h，用分液漏鬥逐滴加入100mL無水異丙醇，滴加速率為20d/min，滴加完畢之後，繼續攪拌3h，放置30min ；
(5)傾去上清液，用異丙醇反覆清洗，抽濾，再用乙醚清洗數次，真空40℃乾燥，得到淡黃色粉末狀產物。
產物經紅外光譜鑑定為酪氨酸-甲醛縮聚物；從掃描電子顯微鏡的形貌分析可以看出，形貌為單分散規整圓球狀顆粒，粒子平均尺度為1-10μm；從螢光光譜可以看出，產物受波長為365nm光激發，在540nm處有強發射峰，見圖1、圖2和圖3。
實施例2
（1）稱取1.9g酪氨酸溶解在12mL 1mol/L HCl溶液中，加入0.05g草酸，攪拌，使之完全溶解。加入0.08g tween 20，攪拌，混合均勻；
（2）在500mL燒杯中加入100mL液體石蠟,加入2.25g span 80，攪拌，混合均勻；
（3）在60℃條件下，將酪氨酸溶液用注射器緩慢滴加到含有span80 的100mL液體石蠟中，800r/min下乳化30min，逐滴加入2mL 37 wt%甲醛溶液，乳化縮聚14h後轉移到冰水浴中；
(4)繼續攪拌，向其中滴加4mL 50 wt %戊二醛溶液，繼續攪拌2h，用分液漏鬥逐滴加入100mL無水異丙醇，滴加速率為20d/min，滴加完畢之後，繼續攪拌3h，放置2h；
(5)傾去上清液，用異丙醇反覆清洗，抽濾，再用乙醚清洗數次，沉澱物即為淡黃色，粒徑為1-20微米的酪氨酸縮甲醛螢光微球。各項表徵結果與實施例1合成產物類似。各項表徵結果與實施例1合成產物類似。
實施例3
（1）稱取1.9g酪氨酸溶解在6mL 1mol/L HCl溶液中，加入0.05g草酸，攪拌，使之完全溶解。加入0.08g tween 20 ，攪拌，混合均勻；
（2）在500mL燒杯中加入100mL液體石蠟,加入2.25g span 80，攪拌，混合均勻；
（3）在60℃條件下，將酪氨酸溶液用注射器緩慢滴加到含有span80 的100mL液體石蠟中，7000r/min下乳化30min，逐滴加入2mL 37 wt %甲醛溶液，乳化縮聚14h後轉移到冰水浴中；
(4)繼續攪拌，向其中滴加4mL 50wt%戊二醛溶液，繼續攪拌4h，用分液漏鬥逐滴加入100mL無水異丙醇，滴加速率為20d/min，滴加完畢之後，繼續攪拌5h，放置1h ；
(5)傾去上清液，用異丙醇反覆清洗，抽濾，再用乙醚清洗數次，沉澱物即為淡黃色，粒徑為0.1-5微米的酪氨酸縮甲醛螢光微球。各項表徵結果與實施例1合成產物類似。
以上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請保護範圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發明的涵蓋範圍。