抑血管生成素的藥物用途的製作方法

2023-09-16 18:14:15

專利名稱：抑血管生成素的藥物用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物醫藥技術領域，具體是涉及一種生物材料的藥物用途，更具體地說，本發明研究了一種抑血管生成素作為抗炎藥物有效成份的應用。
背景技術：
抑血管生成素(angiostatin),又稱血管抑素、血管生成抑制素，是纖溶酶原(plasminogen)在體內的天然水解產物，能夠有效抑制血管內皮細胞的增殖、遷移和管狀結構的形成而參與對血管生成(angiogenesis)的調節。血管生成是指從已經存在的血管生長出新的分枝血管的過程，該過程在胚胎發育組織器官形成中發揮重要作用，而在一般成體組織(除雌性生殖系統等組織)並不活躍。然而在某些病理條件下，如傷口癒合、炎症、腫瘤的生長和惡性轉移、動脈粥樣硬化時，卻常常伴隨活躍的血管生成過程。某一組織在某一特定時間是否能夠進行血管生成取決於在本地環境中促血管生成因子和血管生成抑制·分子之間的平衡。目前為止，已經發現近30種內源性的血管生成抑制因子。抑血管生成素對血管生成的抑制作用，提示其作為一種特異性的針對血管內皮細胞的藥物治療與血管生成有關的疾病的可能性。1994年，哈佛醫學院的Folkman實驗室首次從肺癌轉移模型小鼠的血清和尿液中分離得到一種抑血管生成素。由於纖溶酶原存在不同的裂解位點，因此在不同的細胞環境中會產生不同形式的抑血管生成素。抑血管生成素是在細胞膜上還是進入細胞內來完成其對內皮細胞的抑制作用，尚未見報導。無論是纖溶酶原還是纖溶酶在細胞膜表面都存在多種受體，然而它們並沒有抑制血管生成功能，這說明抑血管生成素可能通過不同的細胞表面受體發揮作用。此外，不同的抑血管生成素以及不同的翻譯後修飾過程都會導致抑血管生成素以不同的方式結合併將信號傳遞到胞內。除了細胞表面受體外，抑血管生成素也能結合胞外的某些分子如組織型纖溶酶原抑制因子，說明抑血管生成素也可以通過調節細胞周圍的蛋白水解活性參與血管生成過程。腫瘤的生長和轉移過程離不開血管生成，在過去幾年裡，大量的研究表明重組或純化的抑血管生成素蛋白能顯著抑制多種原發性腫瘤的生長。目前，關於抑血管生成素的臨床應用已進入一期階段。炎症是威脅人類健康的一種常見病和多發病。炎性反應是由多種介質參與、炎性因子與機體不斷鬥爭直至達到一個平衡的複雜過程。目前抗炎藥主要包括留體類抗炎藥(steroia anti-inflammatory drugs, SAIDs)、非留體類抗炎藥(non-steroiaanti-inflammatory drugs,NSAIDs)和中藥。甾體類藥物雖然有極好的療效,但長期使用可引起水鹽代謝和糖、脂肪、蛋白質代謝的嚴重紊亂；非留體類藥物是目前臨床上炎症治療應用最廣泛的藥物，由於NSAIDs抑制了前列腺素(PGs)的合成，因此在起抗炎作用的同時，也造成了對胃腸道的副作用，主要表現為胃、十二指腸潰瘍引起的上消化道出血；還可引起鈉水瀦留和水腫、高血症、腎病症候群並發間質性腎炎、腎功能不全、急性間質性腎炎、腎乳頭壞死等嚴重的腎損害；亦可增加使用人群發生血栓性不良事件(心肌梗死、不穩定心絞痛、心臟血栓、猝死等)、充血性心力衰竭、高血壓、冠心病等的風險；還可能發生肝損害、嗜睡、神情恍惚、頭痛、頭暈、耳鳴、視神經炎、哮喘、皮膚損害等其他不良反應；另外，從近幾年的文獻可以看出，對抗炎中藥的研究還比較膚淺，對中藥具體作用過程的了解還不夠系統。腫瘤血管生成(angiogenesis)是指血管內皮細胞從現存的血管系統中分化、遷移而形成新的微血管的複雜生物學過程。成人的血管內皮細胞基本處於靜止狀態，在傷口癒合、組織修復、女性生育和月經期、胎兒發育等生理刺激下會生成新的血管，這屬於生理性血管生成。此時的血管生成是處於刺激因子和抑制因子的嚴格控制和協調下，在有限時間內的一種有序的生理過程，增生的內皮細胞很快恢復為正常的靜止狀態。當血管生成調節機制失控和血管生成過度時，則成為致病因素，導致風溼性關節炎、糖尿病性或黃斑變性視網膜病變、嬰兒血管瘤和惡性腫瘤等血管生成依賴性疾病的發生和發展。早在1971年，Folkman闡明了腫瘤血管生成在腫瘤發展、轉移和擴散中的重要意義，並提出血管發生的抑制劑可能會成為一種新型的、有價值的腫瘤治療手段。目前，破壞血管生 成在癌症研究中佔據重要的地位。內源性和外源性的腫瘤血管生成抑制物為這類疾病的治療提供新的臨床用藥方向。專利申請201010252717. 7公開了一種從尖吻蝮蛇蛇毒中提取的抑血管生成素結構及其製備方法，以及應用其製備的抗腫瘤藥物，本發明對該結構的抑血管生成素的藥用價值進行深入實驗測量，發現其還具備新的抗炎特性，為抗炎藥物的研製提供了一種新的途徑和方向。

發明內容
本發明旨在解決現有抗炎藥物研究中的技術發展停滯不前狀態，提出一種新的抗炎藥物研究方向。實現上述發明目的的技術方案為，抑血管生成素的藥物用途，抑血管生成素作為活性成份製備抗炎藥物中的應用。上述作為抗炎藥物活性成份的抑血管生成素採用還原性SDS-PAGE法測定顯示為兩條帶，分別稱α鏈和β鏈，分子量分別為12000 22000道爾頓、9000 19000道爾頓，其中，α鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO. I所示，β鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。上述作為抗炎藥物活性成份的抑血管生成素經雙向電泳後會分別產生與所述α鏈和β鏈對應的異構體各三個。上述作為抗炎藥物活性成份的抑血管生成素的製備方法包括如下步驟
(a)將尖吻蝮蛇粗毒溶解於緩衝液中，其中蛇毒與緩衝液的體積比為I 2 10，離心得到上清液，這裡所用的緩衝液是pH 7. O 9. 0，O. 01 O. lmol/L的Tris-HCl緩衝液，離心次數2次，離心速度為4000r/min,每次離心15min ；
(b)將所得上清液過二乙胺乙基陰離子交換層析柱進行層析，得到抑血管生成素粗溶液,層析具體為層析pH 6. O 9. O的O. 01 O. 05mol/L的Tris-HCl緩衝液和O. 05 O. 6mol/L NaCl溶液作為洗脫液進行線性梯度洗脫，洗脫時間為1440min，洗脫流速5ml/min0(C)將雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體與親和層析載體偶聯，製備得免疫親和層析柱，這裡的親和層析柱載體為4B瓊脂糖凝膠、二乙氨基葡聚糖凝膠、羧甲基葡聚糖凝膠中的任意一種；
(d)用所得免疫親和層析柱純化步驟(b)所得抑血管生成素粗溶液，以洗脫緩衝液洗脫，收集得到抑血管生成素，所用洗脫緩衝液為PH2. O 4. 0,0. 01 O. 03 mo I/L的Gly-HCl緩衝液。本發明所研究發現的抑血管生成素作為一種新型的天然蛋白質類抗炎藥物，其對身體不存在明顯的毒副作用，具有廣闊的應用前景，是傳統抗炎藥物研究在另一方面的開拓。


圖I是根據本發明的抑血管生成素的製備工藝流程 圖2是抑血管生成素對小鼠RAW 264. 7巨噬細胞的測量結果。
具體實施例方式本發明的技術方案主要是涉及抑血管生成素作為抗炎藥物的藥物用途，先根據具體實驗測量詳述確定其抗炎效果。(I)對大鼠後足急性炎症的治療作用
採用向大鼠後足皮下注射炎性物質(包括角叉藻聚糖)的方法誘導大鼠後足急性炎症。在炎症誘導前的Ih 口服給予抑血管生成素(2. 5mg/kg)、卩引哚美辛(indomethacin,陽性對照藥，10mg/kg)或溶媒(O. 5%羧甲基纖維素鈉CMC)。炎症誘導時，向大鼠的右後足蹠肌下組織注射溶於生理鹽水中(O. 9% w/v NaCl)新鮮製備的角叉藻聚糖溶液(O. 1ml, 1% w/v)ο未注射的左後足作為對照。在炎症誘導前的Ih以及注射炎性物質後O. 5-6h所設的不同時間，使用容積測量器對每隻動物的兩隻後足進行容積測定。按以下公式計算各大鼠在各時間點右後足容積的增加百分數(足部腫脹)增加百分數(％)= 100* (A-B)/B，A代表注射後各時間點的足容積，B代表注射前的足容積。與未給藥的左足對照，注射角叉藻聚糖溶液後大鼠右後足產生了明顯的炎症。該抑血管生成素對角叉藻聚糖誘導的大鼠急性足部腫脹效應的主要實驗結果如下
權利要求
1.抑血管生成素的藥物用途，其特徵在於，抑血管生成素作為活性成份製備抗炎藥物的應用。
2.如權利要求I所述的抑血管生成素的藥物用途，其特徵在於，作為抗炎藥物活性成份的抑血管生成素採用還原性SDS-PAGE法測定顯示為兩條帶，分別稱a鏈和P鏈，分子量分別為12000 22000道爾頓、9000 19000道爾頓，其中，a鏈的胺基酸序列如SEQ IDNO. I所示，P鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.如權利要求2所述的抑血管生成素的藥物用途，其特徵在於，作為抗炎藥物活性成份的抑血管生成素經雙向電泳後會分別產生與所述a鏈和3鏈對應的異構體各三個。
4.如權利要求I至3任一項抑血管生成素的藥物用途，其特徵在於，作為抗炎藥物活性成份的抑血管生成素的製備方法包括如下步驟 (a)將尖吻蝮蛇粗毒溶解於緩衝液中，其中蛇毒與緩衝液的體積比為I 2 10，離心得到上清液，這裡所用的緩衝液是pH 7. 0 9. 0，0. 01 0. lmol/L的Tris-HCl緩衝液，離心次數2次，離心速度為4000r/min,每次離心15min ； (b)將所得上清液過二乙胺乙基陰離子交換層析柱進行層析，得到抑血管生成素粗溶液,層析具體為層析pH 6. 0 9. 0的0. 01 0. 05mol/L的Tris-HCl緩衝液和0. 05 0.6mol/L NaCl溶液作為洗脫液進行線性梯度洗脫，洗脫時間為1440min，洗脫流速5ml/min ； (C)將雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體與親和層析載體偶聯，製備得免疫親和層析柱，這裡的親和層析柱載體為4B瓊脂糖凝膠、二乙氨基葡聚糖凝膠、羧甲基葡聚糖凝膠中的任意一種； Cd)用所得免疫親和層析柱純化步驟(b)所得抑血管生成素粗溶液，以洗脫緩衝液洗脫，收集得到抑血管生成素，所用洗脫緩衝液為pH2. 0 4. 0,0. 01 0. 03 mo I/L的Gly-HCl緩衝液。
全文摘要
本發明公開了抑血管生成素的藥物用途，抑血管生成素作為活性成份製備抗炎藥物的應用，作為抗炎藥物活性成份的抑血管生成素採用還原性SDS-PAGE法測定顯示為兩條帶，分別稱α鏈和β鏈，分子量分別為12000～22000道爾頓、9000～19000道爾頓，其中，α鏈的胺基酸序列如SEQIDNO.1所示，β鏈的胺基酸序列如SEQIDNO.2所示，經雙向電泳後會分別產生與所述α鏈和β鏈對應的異構體各三個。本發明研究發現的抑血管生成素作為新型的天然蛋白質類抗炎藥物，其對人身體不存在明顯的毒副作用，具有廣闊的應用前景，是傳統抗炎藥物研究在另一方面的開拓。
文檔編號C07K14/435GK102847137SQ20121022443
公開日2013年1月2日 申請日期2012年7月2日 優先權日2012年7月2日
發明者李小羿, 張國輝, 戴向榮, 凌娟, 吳豔, 胡代娣 申請人:兆科藥業(香港)有限公司