檢測雌二醇的膠體金免疫試紙及其製備方法

2023-09-21 11:51:40 2

專利名稱：檢測雌二醇的膠體金免疫試紙及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測雌二醇的試紙及其製備方法。
背景技術：
人類對動物內分泌幹擾物所造成的環境汙染和危害的普遍認知和系統研究還不到十年的歷史，但越來越多的研究表明，具有內分泌幹擾性的汙染物不斷富集所造成的汙染正通過各種途徑給人類和野生生物帶來危害，且其已在世界範圍內的自然水體，城市汙水處理系統及供水系統中被廣泛檢出。雌二醇(17β-Estradiol)是天然雌激素的重要成分，它可以促進少女性早熟，因此，對食品中尤其是對畜禽產品進行雌二醇檢測是很有必要的。目前，雌二醇的測定多採用放射免疫分析、酶聯免疫分析或化學發光免疫分析法，但這些方法的操作過程繁瑣、時間長，操作人員必須具有一定的專業技術知識才能操作，因此應用範圍受限。

發明內容
本發明的目的是克服現有技術中的不足，提供一種操作簡便快速、成本低、攜帶方便、非專業人員也能操作及可進行現場檢測的檢測雌二醇的膠體金免疫試紙。
本發明的第二個目的是提供一種檢測雌二醇的膠體金免疫試紙的製備方法。
本發明的技術方案概述如下一種檢測雌二醇的膠體金免疫試紙，包括基板，在所述基板的中部設置有硝酸纖維膜，吸水紙的一端與所述基板的A端對齊設置，所述吸水紙的另一端搭蓋在所述硝酸纖維膜的近A端的表面上，玻璃纖維膜的近B端覆蓋在基板的近中部，所述玻璃纖維膜的近A端搭蓋在所述硝酸纖維膜的近B端的表面上，加樣紙的一端與所述基板的B端對齊設置，所述加樣紙的另一端搭蓋在所述玻璃纖維膜的近B端表面上，所述玻璃纖維膜浸泡於標記雌二醇抗體的膠體金探針中，取出，乾燥；所述硝酸纖維素膜上設置有雌二醇與卵清蛋白的偶連物和兔抗鼠抗體。
所述硝酸纖維素膜上設置的雌二醇與卵清蛋白的偶連物和兔抗鼠抗體為點膜機噴成的兩條線。
所述吸水紙的長度為25-35mm，優選30mm，所述硝酸纖維膜的長度為20-30mm，優選25mm，所述玻璃纖維膜的長度為1-10mm，優選6mm，所述加樣紙的長度為10-20mm，優選15mm。
所述基板的材料為聚氯乙烯。
一種檢測雌二醇的膠體金免疫試紙製備方法，包括如下步驟(1)膠體金的製備；(2)膠體金探針的標記①將雌二醇抗體0.005mol/LNaCl水溶液透析8-12小時離心除去蛋白沉澱，調至0.4-0.6mg/ml水溶液；②取膠體金100ml，用0.2mol/LK2CO3水溶液或0.2mol/L NaOH將膠體金溶液調至pH為8.2-9.0，磁力攪拌下加入2.4ml雌二醇抗體溶液，繼續攪拌5-15min，加入牛血清白蛋白，使其最終質量百分濃度為1％，再攪拌5-15min，4000轉/分離心20-25min，棄沉澱；③上清以10000轉/分離心50-70min，棄上清，沉澱用0.01mol/L的磷酸鹽緩衝溶液重新懸浮洗滌1-3次，所述磷酸鹽緩衝溶液中含質量百分濃度為1％的牛血清白蛋白；④將沉澱用0.01mol/L的磷酸鹽緩衝溶液懸浮，所述磷酸鹽緩衝溶液中含質量百分濃度為1％的牛血清白蛋白，含質量百分濃度為0.02％的NaN3，製成標記雌二醇抗體的膠體金探針，4℃保存；(3)抗原的合成①取卵清白蛋白10毫克，3毫升水，3毫升二氧六環，1N氫氧化鈉0.3毫升配成卵清白蛋白溶液；②取雌二醇-6-肟43mg，加入三正丁胺50μL，二氧六環4毫升，冷卻到0-10℃，加入氯甲酸乙酯15μL，4-10℃下反應30分鐘，加入卵清白蛋白溶液，4℃冰浴攪拌，控制pH為8，反應5-7小時，③將反應液加入透析袋，透析45-50小時，將透析液調至pH4.5，冰箱4℃，放置4天，有黃色沉澱出現，離心收集沉澱，冷凍乾燥，4℃冰箱保存，將卵清白蛋白溶於透析液內作參比，用紫外光譜法對雌二醇-6肟-卵清白蛋白進行定性檢驗，經紫外測定證明卵清蛋白已與雌二醇衍生物結合成雌二醇與卵清蛋白的偶連物；(4)試紙製備將玻璃纖維膜放入含1％牛血清白蛋白、1％吐溫-20的磷酸鹽緩衝溶液中浸泡20-40min，浸泡於標記雌二醇抗體的膠體金探針中，真空乾燥；在硝酸纖維膜上用點膜機將雌二醇與卵清蛋白的偶連物和兔抗鼠抗體噴成兩條線，分別為檢測線和對照線，經真空乾燥後，用1％牛血清白蛋白、0.01mol/L磷酸鹽緩衝溶液封閉1.5-2.5小時，以0.01mo1/L磷酸鹽緩衝溶液洗滌，真空乾燥，將硝酸纖維膜粘於基板的中部，吸水紙的一端與所述基板的A端對齊粘接，所述吸水紙的另一端粘接在所述硝酸纖維膜的近A端的表面上，玻璃纖維膜的近B端粘接在基板的近中部，所述玻璃纖維膜的近A端粘接在所述硝酸纖維膜的近B端的表面上，加樣紙的一端與所述基板的B端對齊粘接，所述加樣紙的另一端粘接在所述玻璃纖維膜的近B端表面上製成一種檢測雌二醇的膠體金免疫試紙。
使用本發明的一種檢測雌二醇的膠體金免疫試紙，操作簡便快速、成本低、攜帶方便、非專業人員也能操作及可進行現場檢測。


圖1為本發明的結構示意圖。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例對本發明作進一步的說明實施例1一種檢測雌二醇的膠體金免疫試紙，包括基板1，在基板的中部設置有硝酸纖維膜2，吸水紙3的一端與基板的A端對齊設置，吸水紙的另一端搭蓋在所述硝酸纖維膜的近A端的表面上，玻璃纖維膜4的近B端覆蓋在基板的近中部，玻璃纖維膜的近A端搭蓋在硝酸纖維膜的近B端的表面上，加樣紙5的一端與基板的B端對齊設置，加樣紙的另一端搭蓋在玻璃纖維膜的近B端表面上，玻璃纖維膜浸泡於標記雌二醇抗體的膠體金探針中，取出，乾燥；硝酸纖維素膜上設置有雌二醇與卵清蛋白的偶連物和兔抗鼠抗體。
硝酸纖維素膜上設置的雌二醇與卵清蛋白的偶連物和兔抗鼠抗體為點膜機噴成的兩條線，檢測線7和質控線6。
吸水紙的長度為25-35mm，優選30mm，所述硝酸纖維膜的長度為20-30mm，優選25mm，所述玻璃纖維膜的長度為1-10mm，優選6mm，所述加樣紙的長度為10-20mm，優選15mm。
所述基板的材料為聚氯乙烯。
實施例2一種檢測雌二醇的膠體金免疫試紙製備方法，包括如下步驟(1)膠體金的製備用三蒸水溶解氯金酸，使其終濃度為0.1g/L，先進行沸水浴，待氯金酸溶液煮沸後，每100mL加入質量百分濃度為1％的檸檬酸三鈉水溶液2.5mL，再沸水浴下攪拌，直到氯金酸溶液的顏色穩定，繼續沸水浴10min製成膠體金；(2)膠體金探針的標記①將雌二醇抗體用0.005mol/LNaCl水溶液透析10小時離心除去蛋白沉澱，調至0.5mg/ml水溶液②取膠體金100ml，用0.2mol/LK2CO3水溶液將膠體金溶液調至pH為9.0，磁力攪拌下加入2.4ml雌二醇抗體溶液，繼續攪拌10min，加入牛血清白蛋白，使其最終質量百分濃度為1％，再攪拌10min，4000轉/分離心20min，棄沉澱；③上清以10000轉/分離心60min，棄上清，沉澱用0.01mol/L的磷酸鹽緩衝溶液重新懸浮洗滌21-3次，所述磷酸鹽緩衝溶液中含質量百分濃度為1％的牛血清白蛋白；④將沉澱用0.01mol/L的磷酸鹽緩衝溶液懸浮，所述磷酸鹽緩衝溶液中含質量百分濃度為1％的牛血清白蛋白，含質量百分濃度為0.02％的NaN3，製成標記雌二醇抗體的膠體金探針，4℃保存；(3)抗原的合成①取卵清白蛋白10毫克，3毫升水，3毫升二氧六環，1N氫氧化鈉0.3毫升配成卵清白蛋白溶液；②取雌二醇-6-肟43mg，加入三正丁胺50μL，二氧六環4毫升，冷卻到0℃，加入氯甲酸乙酯15μL，4℃下反應30分鐘，加入卵清白蛋白溶液，4℃冰浴攪拌，控制pH為8，反應6小時，③將反應液加入透析袋，透析48小時，將透析液調至pH4.5，冰箱4℃，放置4天，有黃色沉澱出現，離心收集沉澱，冷凍乾燥，4℃冰箱保存，將卵清白蛋白溶於透析液內作參比，用紫外光譜法對雌二醇-6肟-卵清白蛋白進行定性檢驗，經紫外測定證明卵清蛋白已與雌二醇衍生物結合成雌二醇與卵清蛋白的偶連物；(4)試紙製備將玻璃纖維膜放入含1％牛血清白蛋白、1％吐溫-20的磷酸鹽緩衝溶液中浸泡30min，浸泡於標記雌二醇抗體的膠體金探針中，真空乾燥；在硝酸纖維膜上用點膜機將雌二醇與卵清蛋白的偶連物和兔抗鼠抗體噴成兩條線，分別為檢測線和對照線，經真空乾燥後，用1％牛血清白蛋白、0.01mol/L磷酸鹽緩衝溶液封閉1.5小時，以0.01mol/L磷酸鹽緩衝溶液洗滌，真空乾燥，將硝酸纖維膜粘於基板的中部，吸水紙的一端與所述基板的A端對齊粘接，所述吸水紙的另一端粘接在所述硝酸纖維膜的近A端的表面上，玻璃纖維膜的近B端粘接在基板的近中部，所述玻璃纖維膜的近A端粘接在所述硝酸纖維膜的近B端的表面上，加樣紙的一端與所述基板的B端對齊粘接，所述加樣紙的另一端粘接在所述玻璃纖維膜的近B端表面上製成一種檢測雌二醇的膠體金免疫試紙。
實施例3一種檢測雌二醇的膠體金免疫試紙製備方法，包括如下步驟(1)膠體金的製備用三蒸水溶解氯金酸，使其終濃度為0.1g/L，先進行沸水浴，待氯金酸溶液煮沸後，每100mL加入質量百分濃度為1％的檸檬酸三鈉水溶液2.5mL，再沸水浴下攪拌，直到氯金酸溶液的顏色穩定，繼續沸水浴10min製成膠體金；(2)膠體金探針的標記①將雌二醇抗體用0.005mol/LNaCl水溶液透析8-12小時離心除去蛋白沉澱，調至0.4mg/ml；②取膠體金100ml，用0.2mol/L NaOH將膠體金溶液調至pH為8.2，磁力攪拌下加入2.4ml雌二醇抗體溶液，繼續攪拌5-15min，加入牛血清白蛋白，使其最終質量百分濃度為1％，再攪拌5-15min，4000轉/分離心25min，棄沉澱；③上清以10000轉/分離心50-70min，棄上清，沉澱用0.01mol/L的磷酸鹽緩衝溶液重新懸浮洗滌1-3次，所述磷酸鹽緩衝溶液中含質量百分濃度為1％的牛血清白蛋白；④將沉澱用0.01mol/L的磷酸鹽緩衝溶液懸浮，所述磷酸鹽緩衝溶液中含質量百分濃度為1％的牛血清白蛋白，含質量百分濃度為0.02％的NaN3，製成標記雌二醇抗體的膠體金探針，4℃保存；(3)抗原的合成①取卵清白蛋白10毫克，3毫升水，3毫升二氧六環，1N氫氧化鈉0.3毫升配成卵清白蛋白溶液；②取雌二醇-6-肟43mg，加入三正丁胺50μL，二氧六環4毫升，冷卻到10℃，加入氯甲酸乙酯15μL，10℃下反應30分鐘，加入卵清白蛋白溶液，4℃冰浴攪拌，控制pH為8，反應5-7小時，③將反應液加入透析袋，透析45-50小時，將透析液調至pH4.5，冰箱4℃，放置4天，有黃色沉澱出現，離心收集沉澱，冷凍乾燥，4℃冰箱保存，將卵清白蛋白溶於透析液內作參比，用紫外光譜法對雌二醇-6肟-卵清白蛋白進行定性檢驗，經紫外測定證明卵清蛋白已與雌二醇衍生物結合成雌二醇與卵清蛋白的偶連物；(4)試紙製備將玻璃纖維膜放入含1％牛血清白蛋白、1％吐溫-20的磷酸鹽緩衝溶液中浸泡20-40min，浸泡於標記雌二醇抗體的膠體金探針中，真空乾燥；在硝酸纖維膜上用點膜機將雌二醇與卵清蛋白的偶連物和兔抗鼠抗體噴成兩條線，分別為檢測線和對照線，經真空乾燥後，用1％牛血清白蛋白、0.01mol/L磷酸鹽緩衝溶液封閉2.5小時，以0.01mol/L磷酸鹽緩衝溶液洗滌，真空乾燥，將硝酸纖維膜粘於基板的中部，吸水紙的一端與所述基板的A端對齊粘接，所述吸水紙的另一端粘接在所述硝酸纖維膜的近A端的表面上，玻璃纖維膜的近B端粘接在基板的近中部，所述玻璃纖維膜的近A端粘接在所述硝酸纖維膜的近B端的表面上，加樣紙的一端與所述基板的B端對齊粘接，所述加樣紙的另一端粘接在所述玻璃纖維膜的近B端表面上製成一種檢測雌二醇的膠體金免疫試紙。
實施例4一種檢測雌二醇的膠體金免疫試紙製備方法，包括如下步驟(1)膠體金的製備用三蒸水溶解氯金酸，使其終濃度為0.1g/L，先進行沸水浴，待氯金酸溶液煮沸後，每100mL加入質量百分濃度為1％的檸檬酸三鈉水溶液2.5mL，再沸水浴下攪拌，直到氯金酸溶液的顏色穩定，繼續沸水浴10min製成膠體金；(2)膠體金探針的標記①將雌二醇抗體用0.005mol/L水溶液透析12小時離心除去蛋白沉澱，調至0.6mg/ml的水溶液；②取膠體金100ml，用0.2mol/L NaOH將膠體金溶液調至pH為8.2，磁力攪拌下加入2.4ml雌二醇抗體溶液，繼續攪拌15min，加入牛血清白蛋白，使其最終質量百分濃度為1％，再攪拌15min，4000轉/分離心25min，棄沉澱；③上清以10000轉/分離心70min，棄上清，沉澱用0.01mol/L的磷酸鹽緩衝溶液重新懸浮洗滌1次，所述磷酸鹽緩衝溶液中含質量百分濃度為1％的牛血清白蛋白；④將沉澱用0.01mol/L的磷酸鹽緩衝溶液懸浮，所述磷酸鹽緩衝溶液中含質量百分濃度為1％的牛血清白蛋白，含質量百分濃度為0.02％的NaN3，製成標記雌二醇抗體的膠體金探針，4℃保存；(3)抗原的合成①取卵清白蛋白10毫克，3毫升水，3毫升二氧六環，1N氫氧化鈉0.3毫升配成卵清白蛋白溶液；②取雌二醇-6-肟43mg，加入三正丁胺50μL，二氧六環4毫升，冷卻到5℃，加入氯甲酸乙酯15μL，10℃下反應30分鐘，加入卵清白蛋白溶液，4℃冰浴攪拌，控制pH為8，反應7小時，③將反應液加入透析袋，透析50小時，將透析液調至pH4.5，冰箱4℃，放置4天，有黃色沉澱出現，離心收集沉澱，冷凍乾燥，4℃冰箱保存，將卵清白蛋白溶於透析液內作參比，用紫外光譜法對雌二醇-6肟-卵清白蛋白進行定性檢驗，經紫外測定證明卵清蛋白已與雌二醇衍生物結合成雌二醇與卵清蛋白的偶連物；(4)試紙製備將玻璃纖維膜放入含1％牛血清白蛋白、1％吐溫-20的磷酸鹽緩衝溶液中浸泡40min，浸泡於標記雌二醇抗體的膠體金探針中，真空乾燥；在硝酸纖維膜上用點膜機將雌二醇與卵清蛋白的偶連物和兔抗鼠抗體噴成兩條線，分別為檢測線和對照線，經真空乾燥後，用1％牛血清白蛋白、0.01mol/L磷酸鹽緩衝溶液封閉2.5小時，以0.01mol/L磷酸鹽緩衝溶液洗滌，真空乾燥，將硝酸纖維膜粘於基板的中部，吸水紙的一端與所述基板的A端對齊粘接，所述吸水紙的另一端粘接在所述硝酸纖維膜的近A端的表面上，玻璃纖維膜的近B端粘接在基板的近中部，所述玻璃纖維膜的近A端粘接在所述硝酸纖維膜的近B端的表面上，加樣紙的一端與所述基板的B端對齊粘接，所述加樣紙的另一端粘接在所述玻璃纖維膜的近B端表面上製成一種檢測雌二醇的膠體金免疫試紙。
權利要求
1.一種檢測雌二醇的膠體金免疫試紙，包括基板，其特徵在所述基板的中部設置有硝酸纖維膜，吸水紙的一端與所述基板的A端對齊設置，所述吸水紙的另一端搭蓋在所述硝酸纖維膜的近A端的表面上，玻璃纖維膜的近B端覆蓋在基板的近中部，所述玻璃纖維膜的近A端搭蓋在所述硝酸纖維膜的近B端的表面上，加樣紙的一端與所述基板的B端對齊設置，所述加樣紙的另一端搭蓋在所述玻璃纖維膜的近B端表面上，所述玻璃纖維膜浸泡於標記雌二醇抗體的膠體金探針中，取出，乾燥；所述硝酸纖維素膜上設置有雌二醇與卵清蛋白的偶連物和兔抗鼠抗體。
2.根據權利要求1所述的一種檢測雌二醇的膠體金免疫試紙，其特徵是所述硝酸纖維素膜上設置的雌二醇與卵清蛋白的偶連物和兔抗鼠抗體為點膜機噴成的兩條線。
3.根據權利要求1所述的一種檢測雌二醇的膠體金免疫試紙，其特徵是所述吸水紙的長度為25-35mm，所述硝酸纖維膜的長度為20-30mm，所述玻璃纖維膜的長度為1-10mm，所述加樣紙的長度為10-20mm。
4.根據權利要求1所述的一種檢測雌二醇的膠體金免疫試紙，其特徵是所述基板的材料為聚氯乙烯。
5.根據權利要求3所述的一種檢測雌二醇的膠體金免疫試紙，其特徵是所述吸水紙的長度為30mm，所述硝酸纖維膜的長度為25mm，所述玻璃纖維膜的長度為6mm，所述加樣紙的長度為15mm。
6.一種檢測雌二醇的膠體金免疫試紙製備方法，包括如下步驟(1)膠體金的製備；(2)膠體金探針的標記①將雌二醇抗體用0.005mol/LNaCl水溶液透析8-12小時，離心除去蛋白沉澱，調至0.4-0.6mg/ml水溶液；②取膠體金100ml，調pH為8.2-9.0，磁力攪拌下加入2.4ml雌二醇抗體溶液，繼續攪拌5-15min，加入牛血清白蛋白，使其最終質量百分濃度為1％，再攪拌5-15min，4000轉/分離心20-25min，棄沉澱；③上清以10000轉/分離心50-70min，棄上清，沉澱用0.01mol/L的磷酸鹽緩衝溶液重新懸浮洗滌1-3次，所述磷酸鹽緩衝溶液中含質量百分濃度為1％的牛血清白蛋白；④將沉澱用0.01mol/L的磷酸鹽緩衝溶液懸浮，所述磷酸鹽緩衝溶液中含質量百分濃度為1％的牛血清白蛋白，含質量百分濃度為0.02％的NaN3，製成標記雌二醇抗體的膠體金探針，4℃保存；(3)抗原的合成①取卵清白蛋白10毫克，3毫升水，3毫升二氧六環，1N氫氧化鈉0.3毫升配成卵清白蛋白溶液；②取雌二醇-6-肟43mg，加入三正丁胺50μL，二氧六環4毫升，冷卻到0-10℃，加入氯甲酸乙酯15μL，4-10℃下反應30分鐘，加入卵清白蛋白溶液，4℃冰浴攪拌，控制pH為8，反應5-7小時，③將反應液加入透析袋，透析45-50小時，將透析液調至pH4.5，冰箱4℃，放置4天，有黃色沉澱出現，離心收集沉澱，冷凍乾燥，4℃冰箱保存，將卵清白蛋白溶於透析液內作參比，用紫外光譜法對雌二醇-6肟-卵清白蛋白進行定性檢驗，經紫外測定證明卵清蛋白已與雌二醇衍生物結合成雌二醇與卵清蛋白的偶連物；(4)試紙製備將玻璃纖維膜放入含1％牛血清白蛋白、1％吐溫-20的磷酸鹽緩衝溶液中浸泡20-40min，浸泡於標記雌二醇抗體的膠體金探針中，真空乾燥；在硝酸纖維膜上用點膜機將雌二醇與卵清蛋白的偶連物和兔抗鼠抗體噴成兩條線，分別為檢測線和對照線，經真空乾燥後，用1％牛血清白蛋白、0.01mol/L磷酸鹽緩衝溶液封閉1.5-2.5小時，以0.01mol/L磷酸鹽緩衝溶液洗滌，真空乾燥，將硝酸纖維膜粘於基板的中部，吸水紙的一端與所述基板的A端對齊粘接，所述吸水紙的另一端粘接在所述硝酸纖維膜的近A端的表面上，玻璃纖維膜的近B端粘接在基板的近中部，所述玻璃纖維膜的近A端粘接在所述硝酸纖維膜的近B端的表面上，加樣紙的一端與所述基板的B端對齊粘接，所述加樣紙的另一端粘接在所述玻璃纖維膜的近B端表面上製成一種檢測雌二醇的膠體金免疫試紙。
全文摘要
本發明公開了檢測雌二醇的膠體金免疫試紙及其製備方法，檢測雌二醇的膠體金免疫試紙包括基板，在基板的中部設置有硝酸纖維膜，吸水紙的一端與基板的A端對齊設置，吸水紙的另一端搭蓋在硝酸纖維膜的近A端的表面上，玻璃纖維膜的近B端覆蓋在基板的近中部，玻璃纖維膜的近A端搭蓋在硝酸纖維膜的近B端的表面上，加樣紙的一端與基板的B端對齊設置，加樣紙的另一端搭蓋在玻璃纖維膜的近B端表面上，玻璃纖維膜浸泡於標記雌二醇抗體的膠體金探針中，取出，乾燥；硝酸纖維素膜上設置有雌二醇與卵清蛋白的偶連物和兔抗鼠抗體，使用本發明的一種檢測雌二醇的膠體金免疫試紙，操作簡便快速、成本低、攜帶方便、非專業人員也能操作及可進行現場檢測。
文檔編號G01N33/532GK1866016SQ200610014168
公開日2006年11月22日 申請日期2006年6月8日 優先權日2006年6月8日
發明者高志賢, 孫思明 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所