輔助鑑定人類星狀病毒的方法及其專用引物的製作方法
2023-09-23 07:36:00 1
專利名稱：輔助鑑定人類星狀病毒的方法及其專用引物的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種輔助鑑定人類星狀病毒的方法及其專用引物。
背景技術：
星狀病毒科(Astroviridae)是一種感染哺乳類及鳥類的病毒，它的基因體是不分節，正股的RNA，它沒有套膜且蛋白殼體為正20面體，主要造成腹瀉、下腹痛等症狀， 主要是藉由水及飲食傳播。星狀病毒科包括哺乳動物星狀病毒屬(Mamastrovirus)和禽星狀病毒屬(Avastrovirus)。哺乳動物星狀病毒屬的代表種為人類星狀病毒(Human astrovirus)。禽星狀病毒屬的代表種為火雞星狀病毒(Turkey astrovirus)。人星狀病毒於1975年從腹瀉嬰兒糞便中分離得到，球形，28-30nm，無包膜，電鏡下表面結構呈星形，有5-6個角。核酸為單正鏈RNA，7. 01Λ，兩端為非編碼區，中間有三個重疊的開放讀碼框架。星狀病毒與腹瀉密切相關，目前認為星狀病毒是嬰幼兒病毒性胃腸炎的第二位病因，僅次於輪狀病毒。此外，老年人和免疫缺陷患者也是星狀病毒感染的高危人群，人類免疫缺陷病毒感染者、接受骨髓移植及聯合免疫缺陷患者發生星狀病毒感染均已有報導。星狀病毒亦是健康成年人發生胃腸炎的病因之一。該病毒呈世界性分布，糞-口傳播，易感者為5歲以下嬰幼兒，其中5% -20%為隱性感染。在溫帶地區，冬季為流行季節。 病毒侵犯十二指腸黏膜細胞，並在其中大量增殖，造成細胞死亡，釋放病毒於腸腔中。在急性期，糞中病毒可達1010病毒體克，是醫院內感染的主要病原體。潛伏期3-4天，症狀包括發熱、頭痛、噁心、腹瀉，後者可持續2-3天，甚至更長。環介導逆轉錄等溫擴增技術(RT-LAMP)是在實驗過程中使核酸鏈通過在等溫環境中的循環置換擴增實現對靶序列的放大，而達到檢測目的。由於反應中使用了兩對特異性引物，只有兩對引物均與特異的靶序列結合時擴增反應才能進行，因此這種檢測方法的特異性很高。其中一對特殊的引物的5』端含有一端與下遊擴增產物互補的序列，因此，這對引物的單鏈產物就形成了一個類似 鈴狀迴文結構，這種結構正好為下一步等溫置換擴增反應提供了一個可被周而復始利用的模板，從而保證了擴增的持續進行，最終，擴增產物在核酸電泳膠上形成連續的梯狀條帶。從RT-LAMP的原理和特點上不難看出，該方法在RNA 病毒的檢測方面應該有著傳統基因診斷方面無法比擬的優勢，與一些常規的基因檢測手段相比，該技術在可操作性和檢測時間及設備要求方面具有更大的優勢。這主要體現在以下幾個方面首先，它的檢測時間可以縮短到兩個小時以內，靈敏度可以達到檢測10個拷貝左右的病毒核酸分子；除了應用一些常用的聚合酶外，對硬體設備基本無特殊要求，在普通的生物實驗室就可完成這項檢測工作；第二，該技術省略了單獨的逆轉錄和巢式PCR的二次擴增步驟，在實驗設施中反轉錄與擴增過程在恆溫條件下一步完成，沒有核酸的變復性過程，不但節省了大量的時間又減少了 RNA酶和擴增核酸的汙染機會；第三，擴增反應只有在四條引物完全與識別的靶序列中六個結合區匹配的情況下才能順利進行，從而大大提高了反應的特異性；第四，RT-LAMP的擴增反應中可以形成可視的焦磷酸酶沉澱，因此肉眼可觀察到陽性反應管中的白色混濁物；第五，也可在RT-LAMP反應體系中加入HNB染料，即可通過觀察顏色變化指示陽性結果。
發明內容
本發明的目的是提供一種輔助鑑定人類星狀病毒的方法及其專用引物。本發明提供的輔助鑑定人類星狀病毒的專用引物，為如下(a)或(b)(a)由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示 DNA和序列表的序列4所示DNA組成的專用引物；(b)由序列表的序列1所示DNA的反向互補DNA、序列表的序列2所示DNA的反向互補DNA、序列表的序列3所示DNA的反向互補DNA和序列表的序列4所示DNA的反向互補 DNA組成的專用引物。所述專用引物可用於製備輔助鑑定人類星狀病毒的試劑盒。本發明還保護一種輔助鑑定人類星狀病毒的試劑盒，包括所述專用引物。所述試劑盒還可包括陽性質粒；所述陽性質粒可為含有序列表的序列5所示DNA 的質粒。所述陽性質粒具體可為將星狀病毒A-X3178G基因(核苷酸如序列如序列表的序列5所示)反向插入pGH載體的SmaI酶切位點得到的重組質粒。所述弓I物或所述試劑盒可用於輔助鑑定人類星狀病毒。本發明還保護一種輔助鑑定人類星狀病毒的方法，包括如下步驟(1)提取待測病毒的RNA ；(2)將步驟(1)提取的RNA採用所述專用引物進行環介導逆轉錄等溫擴增；(3)根據步驟O)的擴增產物鑑定待測病毒是否為人類星狀病毒。所述環介導逆轉錄等溫擴增的反應程序具體可為64_65°C水浴1-1. ^i°C。所述步驟C3)具體可為將環介導逆轉錄等溫擴增的擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，根據電泳顯示的擴增條帶鑑定待測病毒是否為人類星狀病毒。所述步驟C3)具體還可為將環介導逆轉錄等溫擴增的擴增產物用限制性內切酶 Alu I進行酶切鑑定，根據酶切產物鑑定測病毒是否為人類星狀病毒。如果Alu I酶切後得到155bp和64bp的鏈條DNA片段，待測病毒為候選的人類星狀病毒。所述待測病毒具體可為人類星狀病毒、人類輪狀病毒或諾如病毒。 所述專用弓I物或所述試劑盒可用於輔助檢測待測樣本中是否含有人類星狀病毒。本發明中，設計了用於鑑定人類星狀病毒(Human astrovirus)的一組專用引物， 採用該組專用引物可以通過環介導逆轉錄等溫擴增技術鑑定人類星狀病毒，進而應用於人類星狀病毒在各種水體(汙水、再生水、地表水、飲用水)及腸道病患者(人、獸)糞便中的監測。應用本發明的專用引物鑑定人類星狀病毒，具有準確、特異、靈敏、快捷的優勢，主要體現在以下幾個方面首先，擴增反應只有在四條引物完全與識別的靶序列中六個結合區匹配的情況下才能順利進行，所有這些特性在很大程度上減少了擴增反應的背景，從而使檢測特異性得到改善；第二，該技術省略了單獨的逆轉錄和巢式PCR的二次擴增步驟，力口之擴增反應在65°C等溫條件下進行，沒有核酸的變復性過程，不但節省了大量的時間又減少了 RNA酶和擴增核酸的汙染機會，從而提高了檢測的靈敏性和安全性；第三，所有的擴增反應在65°C左右等溫條件下進行，無需PCR儀，降低了對實驗硬體的要求，有利於基層水質監測及衛生防疫等的推廣；第四，較RT-PCR縮短了檢測所需的時間(0.5-2小時即可完成)。
圖1為星狀病毒質粒的結構示意圖。圖2為實施例2中環介導逆轉錄等溫擴增後各反應管的照片。圖3為實施例2中環介導逆轉錄等溫擴增產物的電泳圖。圖4為實施例2中環介導逆轉錄等溫擴增產物酶切後的電泳圖。圖5為實施例3中環介導逆轉錄等溫擴增後各反應管的照片。圖6為實施例3中環介導逆轉錄等溫擴增產物的電泳圖。圖7為實施例4中環介導逆轉錄等溫擴增後各反應管的照片。圖8為實施例4中環介導逆轉錄等溫擴增產物的電泳圖。
具體實施例方式以下的實施例便於更好地理解本發明，但並不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重複實驗，結果取平均值。Betaine :SIGMA。HNB 染料SIGMA。Bst-DNA polymerase :NEB。AMV 反轉錄酶 Promega0 dNTP :biodee。Marker D2000 天根。實施例中用作陰性對照的水均為天根公司的 RNase-free ddH20。實施例1、輔助鑑定人類星狀病毒的專用引物的設計一、輔助鑑定人類星狀病毒的專用引物的設計通過NCBI、Blast、Primerexplorer V4 程序，獲得 Astrovirus 基因序列並設計四條引物，兩條外引物(aF3、aB3)和兩條內引物(aFIP、aBIP)。四條引物的序列如下aF3(序列 1) :5，-CAACAGCAACCCTTGGGA-3，；aB3(序列 2) 5' -GGACAGTACCATTGACAGCA-3，；aFIP(序列；3) :5，-GCGTCCTTAACAAGGACAGGGTTTTTGTCGGGTCAAACACCAGTG-3，；aBIP (序列 4) :5，-GTGCAGGCGTTAGGTGCACATTTTTGCGCCAACCATAGAGGTTA-3，。由於LAMP擴增產物為環連接的長鏈DNA，不同的擴增片段難以通過電泳圖譜判定大小作出鑑定。本發明中，通過在擴增引物中引入酶切位點，在擴增反應結束後可採用限制性內切酶消化的方法，較好的實現擴增產物的特異性長度檢測。二、陽性對照的製備星狀病毒質粒由北京奧科生物技術有限責任公司合成(發貨質粒編號為 D9256-4)，結構示意圖見圖1，是將星狀病毒A-X3178G基因(核苷酸如序列如序列表的序列 5所示，通過ncbi資料庫獲得)反向插入pGH載體的SmaI酶切位點得到的重組質粒。三、輔助鑑定人類星狀病毒的試劑盒的製備輔助鑑定人類星狀病毒的試劑盒由步驟一設計的四條引物(aF3、aB3、aFIP和 aBIP ；均由北京奧科生物技術有限責任公司合成)和步驟二製備的星狀病毒質粒組成。實施例2、試劑盒(專用引物)的特異性
實驗樣本為2007年從疾病控制中心的腹瀉患者(知情同意的志願者)糞便中提取的人類星狀病毒、人類輪狀病毒和諾如病毒，公眾可以從中國科學院生態環境研究中心獲得。人類星狀病毒(astrovirus)參考文獻Liu C, Grillner L, Jonsson K et al.Identification of viral agents associated with diarrhea in young children during a winter season in Beijing, China. J Clin Virol. 2006,35 :69_72。人類輪狀病毒(rotavirus)參考文獻He，X. Q. ； Cheng, L. ； Zhang, D. Y. ；Li, W. ；Xie, Χ. Μ.； Ma, Μ. ；Wang, Ζ.J. First Molecular Detection of Group A Rotaviruses in Drinking Water Sources in Beijing, China. Bulletin of Environmental Contamination and ^Toxicology. 2009,83 :120-124。諾如病毒(norovirus):參考文獻Liu C, Grillner L, Jonsson K et al. Identification of viral agents associated with diarrhea in young children during a winter season in Beijing, China. J Clin Virol. 2006,35 69-72。採用實施例1製備的試劑盒分別對各個實驗樣本進行鑑定，步驟如下1、採用天根公司的病毒基因組RNA/DNA提取試劑盒提取待測樣本的RNA。2、將提取的RNA採用四條引物(aF3、aB3、aFIP和aBIP)進行環介導逆轉錄等溫擴增(RT-LAMP)。RT-LAMP 體系(25 μ L)如下:aF3 與 aB3 均為 5pmol, aBIP 與 aFIP 均為 40pmol, dNTP lmmol/L，Betaine (甜菜鹼)lmol/L，MgSO4 4mmol/L, 2. 5 μ L 10 X Bst-DNAPolymerase Buffer, 8U Bst-DNA polymerase, IOU AMV 反轉錄酶，5μ L RNA 樣品，其餘為水。 RT-LAMP 體系混勻，65°C，水浴 1. 5h。同時設立陽性對照和陰性對照即用5μ L星狀病毒質粒(1. ^X IO11拷貝數)代替RNA樣品作為陽性對照，用5 μ L水代替RNA樣品作為陰性對照。陽性對照和陽性樣本在擴增反應中可以形成可視的焦磷酸酶沉澱，離心後肉眼可觀察到反應管中的白色混濁物。陰性對照和陰性樣本不能得到白色混濁物。陰性對照的結果見圖2Α，陽性對照的結果見圖2Β。人類星狀病毒的結果同陽性對照，具有白色混濁物。人類輪狀病毒和諾如病毒的結果同陰性對照，沒有得到白色混濁物。3、檢測環介導逆轉錄等溫擴增的擴增產物為了進一步對步驟2中肉眼觀察的判斷結果進行確認，進行如下操作(1)環介導逆轉錄等溫擴增完成後，將擴增產物進行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳。電泳圖見圖3。圖3中M =Marker D2000 ；CK 陰性對照；1 陽性對照。人類星狀病毒的結果同陽性對照，擴增得到各種不同大小的擴增片段。人類輪狀病毒和諾如病毒的結果同陰性對照，基本沒有得到擴增片段。(2)環介導逆轉錄等溫擴增完成後，將擴增產物用限制性內切酶Alu I進行酶切鑑定。20 μ L酶切反應體系5 μ L擴增產物，2 μ L 10Xbuffer,lyL Alu I內切酶，加無菌水至20μ ;371反應池，651，201^11終止反應。將酶切產物進行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳。電泳圖見圖4。圖4中M =Marker D2000 ；CK 陰性對照；1和2 陽性對照。人類星狀病毒的結果同陽性對照，酶切得到155bp和64bp的DNA片段。人類輪狀病毒和諾如病毒的結果同陰性對照，沒有顯示得到酶切片段。實施例3、試劑盒(專用引物)的特異性
實驗樣本同實施例2。採用實施例1製備的試劑盒分別對各個實驗樣本進行鑑定，步驟如下1、採用天根公司的病毒基因組RNA/DNA提取試劑盒提取待測樣本的RNA。2、將提取的RNA採用四條引物(aF3、aB3、aFIP和aBIP)進行環介導逆轉錄等溫擴增(RT-LAMP)。RT-LAMP 體系 Q5 μ L)如下aF3 與 aB3 均為 5pmol，aBIP 與 aFIP 均為 40pmol, dNTP lmmol/L, MgSO4 lmmol/L，2· 5 μ L IOXBst-DNA Polymerase Buffer, 8U Bst-DNApolymerase, IOU AMV反轉錄酶，5 μ L RNA樣品，2μ L(l. 5mmol/L)HNB染料(羥基萘酚藍)，其餘為水。RT-LAMP 體系混勻，64°C，水浴 lh。同時設立陽性對照和陰性對照即用5μ L星狀病毒質粒(1. ^X IO11拷貝數)代替RNA樣品作為陽性對照，用5 μ L水代替RNA樣品作為陰性對照。結果見圖5。圖5中CK1 陰性對照；CK2 陽性對照；A 人類星狀病毒；R 人類輪狀病毒；N 諾如病毒。陽性對照和陽性樣本均可觀察到顏色變化(由反應起始時的紫色變為反應結束時的天藍色)。陰性對照和陰性樣本沒有顏色變化(反應起始和反應結束時均為紫色)。3、檢測環介導逆轉錄等溫擴增的擴增產物為了進一步對步驟2中肉眼觀察的判斷結果進行確認，環介導逆轉錄等溫擴增完成後，將擴增產物進行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳。電泳圖見圖6。圖6中M =Marker D2000 ；CK 陰性對照；A 人類星狀病毒；R 人類輪狀病毒；N:諾如病毒。人類星狀病毒擴增得到各種不同大小的的擴增片段。人類輪狀病毒和諾如病毒的結果同陰性對照，基本沒有得到擴增片段。實施例4、試劑盒(專用引物)的靈敏度採用實施例1製備的試劑盒進行靈敏度測定，步驟如下1、用水(天根公司的RNase-free ddH20)將星狀病毒質粒梯度稀釋為表1中的各個濃度。表1各個稀釋液中星狀病毒質粒的濃度
權利要求
1.輔助鑑定人類星狀病毒的專用引物，為如下(a)或(b)(a)由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成的專用引物；(b)由序列表的序列1所示DNA的反向互補DNA、序列表的序列2所示DNA的反向互補 DNA、序列表的序列3所示DNA的反向互補DNA和序列表的序列4所示DNA的反向互補DNA 組成的專用引物。
2.權利要求1所述專用引物在製備輔助鑑定人類星狀病毒的試劑盒中的應用。
3.一種輔助鑑定人類星狀病毒的試劑盒，包括權利要求1所述專用引物。
4.權利要求1所述專用引物或權利要求3所述試劑盒在輔助鑑定人類星狀病毒中的應用。
5.一種輔助鑑定人類星狀病毒的方法，包括如下步驟(1)提取待測病毒的RNA；(2)將步驟(1)提取的RNA採用權利要求1所述專用引物進行環介導逆轉錄等溫擴增；(3)根據步驟O)的擴增產物鑑定待測病毒是否為人類星狀病毒。
6.如權利要求5所述的方法，其特徵在於所述環介導逆轉錄等溫擴增的反應程序為 640C -65°C水浴 1-1. 5h。
7.如權利要求5或6所述的方法，其特徵在於所述步驟C3)為將環介導逆轉錄等溫擴增的擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，根據電泳顯示的擴增條帶鑑定待測病毒是否為人類星狀病毒。
8.如權利要求5或6所述的方法，其特徵在於所述步驟C3)為將環介導逆轉錄等溫擴增的擴增產物用限制性內切酶Alu I進行酶切鑑定，根據酶切產物鑑定測病毒是否為人類星狀病毒。
9.如權利要求7或8所述的方法，其特徵在於所述待測病毒為人類星狀病毒、人類輪狀病毒或諾如病毒。
10.權利要求1所述專用引物或權利要求3所述試劑盒在輔助檢測待測樣本中是否含有人類星狀病毒中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種輔助鑑定人類星狀病毒的方法及其專用引物。本發明提供的專用引物由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成。採用該組專用引物可以通過環介導逆轉錄等溫擴增技術鑑定人類星狀病毒，進而應用於人類星狀病毒在各種水體(汙水、再生水、地表水、飲用水)及腸道病患者(人、獸)糞便中的監測。
文檔編號C12Q1/70GK102465184SQ201010549298
公開日2012年5月23日 申請日期2010年11月18日 優先權日2010年11月18日
發明者何曉青, 朱軼, 楊麗, 王子健, 程莉 申請人:中國科學院生態環境研究中心