微陣列底物上的生物材料的選擇性處理的製作方法

2023-09-22 00:41:00 1

專利名稱：微陣列底物上的生物材料的選擇性處理的製作方法
技術領域：
本發明涉及在微陣列載玻片表面上的生物材料的處理。因此，本發明涉及分子生物學和化學領域。
背景技術：
微陣列是一種高通量技術，其由被稱作「特徵」的排列的一系列數以千計的生物材料的精微的斑點組成。例如，DNA微陣列包括含有特定DNA序列的DNA片段的特徵。這可以包括基因或其它DNA元件的短的部分，其被用作可以在適當的條件下與cDNA或cRNA樣品(有時稱作靶標)雜交的探針。使用基於螢光的檢測法通過檢測螢光團標記的靶標來測定核酸序列的相對豐度，從而可以檢測並定量探針-靶標的雜交。在標準的微陣列中，探針與固體表面例如玻璃或矽共價偶聯。

發明內容
本發明提供了用於從微陣列載玻片上的一個或多個獨特的和/或不連續的空間位置上選擇性洗脫生物材料的方法和系統。例如，在一個方面，用於回收與微陣列載玻片偶聯的生物材料的方法可以包括選擇要從微陣列載玻片回收的生物材料，在微陣列載玻片表面上的獨特或不連續空間區域內找到該生物材料，並且從所述獨特的空間區域洗脫至少一部分所選擇的生物材料，但不從所述獨特或不連續空間區域之外的微陣列載玻片區域洗脫實質數量的非選擇的生物材料。在一個具體方面，洗脫進一步包括向所述獨特或不連續空間區域施加洗脫緩衝液。在另一個具體方面，所述洗脫緩衝液是變性緩衝液，其作用是從微陣列載玻片表面釋放該部分的生物材料。在另一個具體方面，將至少一部分的不連續空間區域加熱以促進從微陣列表面釋放至少一部分所選擇的生物材料。預期多種類型的生物材料用於本發明，包括但不限於，DNA、cDNA、RNA、肽、及其組合。在本發明的另一個方面，提供了用於從微陣列回收核酸材料的方法。此方法可以包括選擇已經在獨特或不連續空間區域內的微陣列載玻片表面上雜交的核酸材料，向所述獨特空間區域施加變性緩衝液以使所選擇的核酸材料至少部分變性，以及使用惰性回收緩衝液衝洗所述微陣列表面以回收所選擇的核酸材料的變性的部分。在更具體的方面，該方法還可以包括從所述惰性回收緩衝液中收集所選擇的核酸材料的變性的部分。在另一個更具體的方面，該方法還可以包括向所述獨特空間區域施加熱量以促進至少一部分所選擇的核酸材料的變性。本發明另外提供了用於從微陣列載玻片上的獨特空間位置選擇性洗脫生物材料的系統。例如，在一個方面，用於從微陣列回收核酸材料的系統可以包括微陣列掃描器，其配置為掃描微陣列表面並鑑定待回收的核酸材料的位置；分配器，其配置為接收來自所述微陣列掃描器的輸入並將洗脫緩衝液在由所述微陣列掃描器指定的位置處分配在所述微陣列表面的不連續分配區；和回收器，其配置為從所述微陣列表面回收所述洗脫緩衝液。還有可能接受來自另一個來源例如不同陣列的信息輸入，以確定從哪個區域進行洗脫。在更具體的方面，所述系統還可以包括加熱器，其配置為加熱所述不連續分配區。在另一個更具體的方面，所述加熱器是雷射。本發明還提供了用於選擇性標記與微陣列載玻片偶聯的生物材料的方法。在一個方面，此方法可以包括選擇待標記的生物材料，確定該生物材料在微陣列載玻片表面上的獨特空間區域內的位置，並且標記至少一部分來自該獨特空間區域的所選擇的生物材料， 而不標記來自所述獨特空間區域之外的微陣列載玻片區域的實質數量的非選擇的生物材料。雖然可以使用多種選擇性標記技術，但是在一個方面，標記可以進一步包括向所述獨特空間區域施加緩衝液，該區域不包括實質上在所述獨特空間區域之外的微陣列載玻片的區域；和將標記物加入到所述獨特空間區域的緩衝液中，從而所述緩衝液內的至少一部分生物材料摻入所述標記物。還有可能分配有反應活性的化合物，其可以使位於感興趣的空間區域或位置處的核酸脫保護。這些經脫保護的序列可以與隨後的處理選擇性反應。在一些方面，這可以通過使用通常用於合成陣列的設備來進行。在本發明的另一個方面，可以使用光來促進標記並回收存在於所選擇的位置處的材料。例如，定向的光可用於使有反應活性的基團脫保護，然後所述基團可以與螢光團或其它可見標記物或半抗原例如生物素反應。 在一些方面，這可以通過使用用於合成陣列的設備來進行。此外，所選擇的生物材料可以包括能夠被標記的任何生物材料，包括但不限於，DNA、cDNA、RNA、肽、及其組合。本發明還提供了用於擴增與微陣列載玻片偶聯的生物材料的方法。在一個方面， 此方法可以包括選擇待擴增的生物材料，確定該生物材料在微陣列載玻片表面上的獨特空間區域內的位置，和擴增至少一部分來自該獨特空間區域的所選擇的生物材料，而不擴增來自所述獨特空間區域之外的微陣列載玻片區域的實質數量的非選擇的生物材料。在一個具體方面，擴增可以進一步包括向所述獨特空間區域施加擴增緩衝液，該區域不包括實質上在所述獨特空間區域之外的微陣列載玻片的區域；和擴增所述擴增緩衝液內的至少一部分所選擇的生物材料。在本發明的另一個方面，光可用於促進存在於所選擇的位置處的材料的擴增。例如，光可用於使所選擇的區域內的核酸的3』末端脫保護並促進所選擇的擴增。在一些情況下，這可以通過使用用於合成陣列的設備來進行。能夠擴增微陣列載玻片表面上的生物材料的任何擴增技術應該被認為在本發明範圍內。非限制性實例可以包括等溫循環和熱循環。因此相當寬泛地概述了本發明的重要的特徵，從而可以更好地理解以下的其詳細描述，並且從而更好地認識本發明對現有技術的貢獻。通過以下的本發明的詳細描述並結合附圖
和權利要求，可以更清晰地獲知本發明的其它特徵，或者通過實施本發明可以學習本發明。
具體實施例方式在公開並描述本發明之前，應該理解，本發明不限於本文公開的特定的結構、方法步驟或材料，而是延伸至如相關領域普通技術人員所認識到的其等同物。還應該理解，本文使用的術語僅是為了描述特定實施方式的目的，不是意在限制。必須注意，除非上下文另有明確指明，否則如本說明書和隨附的權利要求中所使用的單數形式「一個」、「一種」和「該」包括複數指稱。因此，例如，提及「一種緩衝液」包括一種或多種此類緩衝液，提及「該化學品」包括提及一種或多種此類化學品。定義
在描述並要求保護本發明時，將根據以下列出的定義使用以下術語。如本文使用的術語「洗脫」是指從底物或溶液中移除生物材料的動作。在一些方面，所述的移除可以通過使用液體或流體，例如緩衝液來進行。如本文使用的術語「獨特空間位置」是指可以從中回收生物材料的微陣列載玻片上的獨特空間位置。在一個方面，所述獨特空間位置可以是這樣的探針集合在所述探針集合的周圍有獨特的邊界。此類邊界可以包括不含附著的探針的載玻片表面上的空間。在另一個方面，所述獨特空間位置可以是位於微陣列載玻片的表面上的沉積探針的較大區域內的探針集合，並且在這樣的情況下，可以沒有圍繞不含探針的獨特空間位置的區域。如本文使用的術語「實質上」是指某作用、特性、性質、狀態、結構、項目或結果的完全或幾乎完全的程度或度。例如，「實質上」被包被的物體意思是該物體完全被包被或接近完全被包被。在一些情況下，偏離絕對完全性的精確的可允許程度取決於具體情形。但是，一般而言，完全性的接近性將與如同獲得絕對且全部完全性具有相同的總體結果。當用於否定式含義以指稱完全沒有或幾乎完全沒有某作用、特性、性質、狀態、結構、項目或結果時，「實質上」同樣適用。例如，「實質上不含」顆粒的組合物將完全缺乏顆粒，或如此接近完全缺乏顆粒以致於效應將與如同完全缺乏顆粒一樣。換言之，「實質上不含」某成分或要素的組合物實際上仍然可以含有此類項目，只要不存在其可測定的效應。如本文使用的術語「大約，，用於通過提供給定數值可以比端點值「高一點，，或「低一點」而提供數值範圍端點值的靈活性。如本文使用的多個項目、結構元件、組合物要素、和/或材料可以為了方便而呈現為普通列舉式。但是，這些列舉應該被解釋為該列舉的每個成員均被單一地指明作為單獨的且獨特的成員。因此，除非另有指明，否則不應僅僅基於它們呈現在共同的組中而將此類列舉的單個成員解釋為同一列舉的任意其它成員的事實上的等同物。濃度、數量和其它數值數據在本文中可以表示或呈現為範圍的形式。應該理解，此類範圍形式僅僅是為了方便和簡潔而使用，因此，應該靈活地解讀為不僅包括明確記載的作為範圍限值的數值，而且包括該範圍內包括的所有單一數值或亞範圍，如同明確記載了每個數值和亞範圍一樣。舉例而言，「大約1至大約5」的數值範圍應該被解讀為不僅包括明確記載的大約1至大約5的數值，而且包括指明範圍內的單一數值和亞範圍。因此，該數值範圍內包括例如2、3和4的單一數值，以及例如1-3、2-4、和3-5等亞範圍，以及單個的 1、2、3、4和5。該原則同樣適用於僅記載作為最小值或最大值的一個數值的範圍。此外，與所描述的範圍或特徵的寬度無關，此類解讀都應該適用。發明
本發明提供了用於從微陣列載玻片上的獨特空間位置選擇性洗脫生物材料的方法和系統。如已經描述的那樣，在一個方面，微陣列載玻片包含多個用於測定生物材料的特異性結合或雜交位點。例如，在DNA微陣列的情況下，具有特定序列的核苷酸在特定特徵處聚簇在一起，通常被稱作探針組。然後互補性核苷酸序列可以與對應於靶核苷酸序列的探針特徵雜交並由此定位於所述探針特徵處。因此，由於在對應於該序列的探針處的核苷酸結合， 可以驗證樣品中的特定核苷酸序列的存在。由於其高診斷實用性，微陣列已經被經常使用。但是，之前的用途經常局限於編目生物材料或分析表達水平的變化。事實證明難以從陣列中分離特定的序列，這是因為微陣列中結合了大量的靶序列。從微陣列中回收靶序列一般需要使所有結合的序列從微陣列中變性，並且擴增感興趣的靶序列。本發明提供了用於從微陣列載玻片分離靶序列或靶序列集合的技術。此類靶序列，或者換言之，生物材料，被選擇為從微陣列載玻片中回收。可以由於微陣列載玻片的診斷性用途而選擇生物材料。例如，可以基於其在微陣列載玻片上的結合位置而鑑定想要的生物材料。因此，可以將微陣列載玻片表面設計為將探針在空間上排列於促進鑑定和選擇性回收與其結合的生物材料的位置處。另外，可以將探針排列於微陣列載玻片表面，從而相關的生物材料在空間上被歸組在一起，以促進相伴地鑑定和選擇性回收歸組的生物材料。應該注意，可以通過多種方式定義探針集合，所有這些方式都應該包括在本發明的範圍內。例如，在一個方面，探針的集合可以包括多個探針的混合物，它們沉積在微陣列載玻片上的獨特空間位置或斑點處。因此，探針可以遍及所述獨特空間位置均勻混合在一起。回收與該探針集合雜交的生物材料將包括與沉積在該獨特位置處的探針混合物匹配的生物材料的混合物。在另一個方面，探針集合可以沉積在微陣列載玻片上，從而獨特空間位置可以包括很多單一或多個探針斑點。換言之，該獨特空間位置可以由很多較小的探針斑點構成，其中每個探針斑點包括探針總集合的子集，但是其中探針的總集合由遍及探針斑點的集合所代表。在一個具體方面，每個探針斑點可以包含單一探針序列。在另一個具體方面，每個探針斑點可以包含來自總集合的探針序列的子集。生物材料可以從遍及整個獨特空間位置回收，或者在一些情況下，從探針集合內的探針斑點的子集回收。還預期獨特空間位置可以由含有單一探針序列的探針斑點的集合以及含有一個以上探針序列的探針斑點的集合組成。然後將所選的生物材料定位於特徵中，或換言之，定位於微陣列載玻片的獨特位置處。然後從所述獨特空間區域洗脫至少一部分所選擇的生物材料，但不從所述獨特空間區域之外的微陣列載玻片區域洗脫實質數量的非選擇的生物材料。此類選擇性洗脫可以通過多種方式進行。例如，可以將洗脫緩衝液施加到微陣列上。在一個方面，所述洗脫緩衝液可以是變性緩衝液，其促進所選擇的生物材料從微陣列中變性。在此種情況下，有益的是將變性溶液的施用限定於獨特空間位置，以避免非選擇的生物材料的變性。在另一個方面，該洗脫緩衝液可以配置為不實質上促進該生物材料變性的緩衝液。在這樣的情形中，將施加第二變性機制以使所選擇的生物材料變性。例如，在一個方面， 可以將洗脫緩衝液施加到獨特空間位置，並且可以通過將熱源應用到所述獨特空間位置而使所選擇的生物材料變性。因此，從所述熱源產生的熱可用於使生物材料變性，然後所述生物材料從微陣列中釋放出來以懸浮在該洗脫緩衝液中。在另一個方面，可以將洗脫緩衝液施加至跨越微陣列的較大的區域，並且可以將熱源應用到獨特空間位置以使所選擇的生物材料變性。因為所述洗脫緩衝液不實質上促進生物材料的變性，所以主要的所選擇的生物
7材料應該由於變性熱源的定位化的作用而從微陣列載玻片的表面釋放進入該洗脫緩衝液中。與僅將緩衝液應用到獨特空間位置的情況相比，由於可以使用較大體積的洗脫緩衝液， 所以在該技術中可以使用較高的熱。還應該注意，可以在存在變性緩衝液的情況下將熱源應用至獨特空間位置，以進一步促進所選擇的生物材料的變性。在另一個方面，可以通過光來促進洗脫。例如，如果包含預雜交的微陣列的寡核苷酸利用光不穩定性化學鍵附著至表面，則定向的光可以在所選擇的位置特異性切割該寡核苷酸和雜交的材料。在一些情況下， 這可以通過使用用於合成陣列的設備來進行。所選擇的生物材料變性之後，可以使用惰性回收緩衝液衝洗微陣列以回收洗脫的生物材料。然後可以在回收緩衝液中使用所選擇的生物材料，或者可以使用標準技術從回收緩衝液中進一步分離此類材料。通過重複應用洗脫緩衝液、變性和生物材料回收的步驟， 可以從單個微陣列載玻片實現不同靶材料的分別回收。在本發明的一個具體方面，可以通過使用帶電的表面來回收所選擇的生物材料。 例如，在回收核酸的情況下，表面將帶有正電荷。帶電的表面可以是任何促進生物材料回收的幾何構型。非限制性實例可以包括平面、針、半球，等等。在一個方面，變性緩衝液可以放置於感興趣的獨特空間區域，可以將帶正電的表面導入變性緩衝液中以將帶負電的生物材料吸引至其上。然後可以將帶電的表面放置於回收溶液中，可以向所述帶電錶面施加負電荷以釋放所述生物材料。此類技術的一個益處包括具有在釋放該生物材料之前清洗帶電錶面以回收變性緩衝液的能力。然後回收的洗脫的生物材料片段可隨後用於進一步處理，例如測序、雜交、PCR等等。在一個方面，回收的材料可用作用於測序的輸入樣品。例如，微陣列可用於從輸入庫中分離核酸片段的一個或多個子集，然後回收的子集可用於測序。在一些方面，可以掃描雜交後的陣列，並且選擇靶核酸片段，單一地或同時地收集以用於測序或其它用途。陣列上的位置可用作鑑定用於回收的靶片段的方法的一部分。在該過程中可以預先鑑定用來收集的靶片段，或者可以在該過程中鑑定。根據本發明的方法鑑定並收集靶片段的能力極大地改善了後續的測序過程的效率。在另一個方面，所述生物材料可用於原位雜交。在更具體的方面，一種原位雜交技術可以包括使用該生物材料作為探針或作為多個探針以用於通過aCGH(陣列比較型基因組雜交)鑑定的染色體區域的FISH (螢光原位雜交)分析。aCGH是基於陣列的技術，其用於檢查基因組拷貝數變異。aCGH的一個潛在問題是輸入樣品的異質性，尤其是腫瘤組織的異質性，其經常發生反覆的基因組變異並經常與非轉化的組織混合。如果用於製備樣品的細胞群體中的基因組拷貝數是可變的，則得到的數據將代表該群體的平均值，並因此將降低來自感興趣的任何單一細胞的靈敏性。FISH允許進行單個細胞的檢查和特異性染色體基因座定量。染色體FISH中靶DNA分子的數目經常會很小，在正常情況下是2個分子/細胞。 因此，必須從每個探針分子產生顯著的螢光信號，以便在標準的實驗室螢光顯微鏡下觀察得到。為了補償，用於FISH的核酸探針(通常是BAC)通常很長(大於100 kb)，從而每個探針中摻入數以千計的螢光染料分子。可以將這些BAC探針剪成小的DNA片段，但是結果是，螢光標記的探針靶向的感興趣的染色體區域通常超過100 1Λ。在使用從基因組範圍的 CGH陣列回收的片段時(其中探針相對稀疏地沿著染色體定位，並且標記的靶標相對較短)，
8這是個潛在的問題。一個實例可以是300，000個探針的人CGH陣列，其與平均長度為300 個鹼基的標記的靶標雜交。如果想回收材料以靶向FISH中的100 1Λ的區域，則將從微陣列上的僅10個探針回收材料(300，000探針/30億鹼基=1探針/10，000鹼基)，並且靶向僅3%的感興趣的染色體區域(1探針/10，000鹼基χ平均300鹼基/探針=3%)。因此，潛在的信號將僅是使用BAC探針可以獲得的信號的3%，使用BAC探針靶向多達100%的感興趣區域。因此，優選的是在微陣列實驗中使用高密度陣列和較長的標記靶標。例如，如果在FISH實驗中使用600 bp的片段雜交2，100, 000探針的陣列，則將靶向42%的感興趣染色體區域(2，100, 000探針/3，000, 000, 000鹼基=1探針/1430鹼基χ平均600鹼基 / 探針=42%)。如已經描述的那樣，本發明提供了用於從高密度陣列上的單一探針回收片段的方法。但是，在其它方面，可能需要產生由固定的探針的「集合」組成的微陣列，給定集合中的每個探針是不同的序列，並且探針的每個集合對應於單一的基因組位置。例如，可以通過產生3000個探針集合的微陣列通過陣列CGH來測試3000 MB的人類基因組。這些集合將在陣列上空間上分離，從而可以從單一或一小組集合內的每個探針變性並回收雜交的材料， 而不影響任何鄰近的集合。可以通過使用微量吸液針頭完成變性和回收，其在給定的探針位置反覆地分配並吸取極小滴的變性緩衝液。在該實例中，每個集合將代表源自連續1 MB 區域內的序列的探針。集合將由大約均勻分布在1 MB區域內的1000個探針組成。該過程將產生1 MB的解析度，換言之，允許對任意1 MB的窗口內的所有基因組片段取樣，以用於後續的生物化學處理，例如FISH。應該注意，固定於「集合」中的探針可以對應於多個基因組位置。例如，針對具有相似功能，或者與特定疾病或病況具有相關性的生物材料的靶序列的探針可以定位於集合中，以便促進功能上相關的生物材料的同時回收。在一個方面，如果洗脫的標記的樣品可以直接用作FISH探針而無需擴增，則該技術對於FISH可以是特別有利的。由於洗脫的材料的總量可能是極低的，所以儀器應該以非常小的體積回收洗脫的材料，例如1微升，以使雜交反應中的濃度最大化。因此，用於 FISH雜交的組織樣品需要非常小(直徑為數毫米或更小)並且腔室的體積需要為僅數微升。 該技術特別好地適合於微流量裝置。此類裝置的實例可以包括但不限於，BioMicro's 16 chamber MAUI Mixer0在另一個方面，可以在從微陣列載玻片回收之後但是在使用之前擴增生物材料，或對生物材料進行化學修飾。另外預期可以通過本發明的技術分離可能位於微陣列載玻片表面上的所有類型的生物材料。此類生物材料的非限制性實例包括DNA、cDNA、RNA、肽、脂、碳水化合物等，及其組合。本領域普通技術人員將理解微陣列的構型、溶液和緩衝液，熱源和溫度等可以根據生物材料的類型而變化。因此，這些變化應該被認為是在本發明的範圍內。本發明另外提供了用於從微陣列載玻片上的獨特空間位置選擇性洗脫生物材料的系統。例如，在一個方面，用於從微陣列回收核酸材料的系統可以包括微陣列掃描器，其配置為掃描微陣列表面並鑑定待回收的核酸材料的位置；分配器，其配置為接收來自所述微陣列掃描器的輸入並在由所述微陣列掃描器指定的位置處將洗脫緩衝液分配在所述微陣列表面的不連續分配區；和回收器，其配置為從所述微陣列表面回收所述洗脫緩衝液。在更具體的方面，所述系統還可以包括加熱器，其配置為加熱所述不連續分配區。在另一個更具體的方面，所述加熱器是雷射。作為實例，片段洗脫過程可以按照如下進行可以使用標準的微陣列掃描器掃描經雜交並清洗的微陣列。得到的輸出文件將用於指導分配器將變性緩衝液精確放置於微陣列上。例如，微陣列點染器例如Array Jet 可用作分配器。所述變性緩衝液和程序應該有效洗脫其接觸的雜交片段，在該過程中不應該蒸發，並且應該可以被回收而不使來自陣列上的不想要的位置的片段變性。在一個方面，一種可能的方案是分配含有脲和甘油的緩衝液，加熱陣列以引起變性，冷卻陣列以終止變性，然後以非變性回收緩衝液衝洗整個陣列並收集洗脫的片段。此外，變性和回收效率可能隨著每一輪的載玻片清洗和乾燥而顯著並持續下降。 為了穩定雜交的片段並改善特異性回收效率，可以開發穩定化清洗緩衝液(含有特殊的表面活性劑)或微陣列表面。應該注意，來自陣列上的位置的未經歷變性緩衝液處理的片段的回收可能汙染洗脫的片段。直接從分配洗脫緩衝液的陣列上的位置回收所述洗脫緩衝液將是有用的。這可以通過使用最少的回收緩衝液將洗脫緩衝液從微陣列上吸取回來並且儘可能少地涉及鄰近的陣列位置來實現。還可以通過印跡或通過使用珠子來回收液體和變性的片段。這應該防止任何流體接觸陣列的其它部分，這應該消除不想要的片段的回收。很多微陣列的特徵的中心至中心斑點距離可以比變性緩衝液的分配的液滴的最小可能大小小得多，這會使得難以從單一斑點回收片段。一個可能的方案是應用tiling陣列，其中斑點排列為使任意「洗脫空間」中的探針之間的幾何距離最小化。在本發明的另一個方面，提供了用於選擇性標記與微陣列載玻片偶聯的生物材料的方法。在一個方面，此方法可以包括選擇待標記的生物材料，確定該生物材料在微陣列載玻片表面上的獨特空間區域內的位置，以及標記至少一部分來自該獨特空間區域的所選擇的生物材料，而不標記來自所述獨特空間區域之外的微陣列載玻片區域的實質數量的非選擇的生物材料。雖然可以使用多種選擇性標記技術，但是在一個方面，標記可以進一步包括向所述獨特空間區域施加緩衝液，所述區域不包括實質上在所述獨特空間區域之外的微陣列載玻片的區域；和將標記物加入到所述獨特空間區域的緩衝液中，從而所述緩衝液內的至少一部分生物材料摻入所述標記物。此外，所選擇的生物材料可以包括能夠被標記的任何生物材料，包括但不限於，DNA、cDNA、RNA、肽、及其組合。此類選擇性可以包括僅標記存在於陣列上的特定位置處的生物材料。在標記步驟之後，可以從精確位置回收經標記的材料，或者可以從整個陣列回收經標記的材料聯同其它材料。如果非標記的(或以不同標記物標記的)回收的材料不幹擾ISH測定，則回收經標記的材料聯同未標記(或以不同標記物標記)的材料的技術可用於下遊處理，例如原位雜交 (ISH)0 一個實例為，以螢光標記的靶標進行的CGH測定。在一個方面，空間特異性標記可以使用半抗原，例如生物素、獨特的寡聚體或肽序列，或可以在隨後的ISH測試中被區分的其它分子。使用獨特的寡聚體或肽序列的優勢在於可以在多個不同位置同時進行多個標記反應。從陣列表面回收之後，可以在同一 ISH測試中同時檢測來自aCGH分析的多個暗示的區域。在一些方面，隨後還可以使用多個標記物將差別化標記的和回收的片段親和純化進入不同的庫，以用於下遊應用，例如測序。標記步驟之後，可以使用多種機制從微陣列表面釋放固定的材料，例如探針。非限制性機制可以包括，使雜交的或非共價結合的材料變性，在探針與底物之間引入可逆的鍵合(例如硫鍵)，部分切割想要的材料(例如，使用核酸酶)，或總體釋放與底物結合的所有材料。在一個具體方面，從陣列上的特定位置釋放材料的機制可以使用光不穩定性鍵，其被定向的光切斷，這將允許精確地釋放僅感興趣的材料。在本發明的另一個方面，提供了用於選擇性擴增與微陣列載玻片偶聯的生物材料的方法。在一個方面，此方法可以包括選擇待擴增的生物材料，確定該生物材料在微陣列載玻片表面上的獨特空間區域內的位置，以及擴增至少一部分來自該獨特空間區域的所選擇的生物材料，而不擴增來自所述獨特空間區域之外的微陣列載玻片區域的實質數量的非選擇的生物材料。在一個具體方面，擴增可以進一步包括向所述獨特空間區域施加擴增緩衝液，所述區域不包括實質上在所述獨特空間區域之外的微陣列載玻片的區域；和擴增所述擴增緩衝液內的至少一部分的所選擇的生物材料。能夠擴增微陣列載玻片的表面上的生物材料的任意擴增技術應該被認為在本發明範圍內。非限制性實例可以包括等溫循環和熱循環。此類用於擴增的方法有幾個潛在的益處，包括但不限於1)可以在陣列上的不同位置同時進行多個擴增；和2)每個擴增可以摻入不同的標記物，因此允許一起回收所有的擴增產物並且每個產物可以保持其獨特性質。此外，以下方法可用於在微陣列上的特定位置完成擴增1)雜交的核酸可以用作模板；和2)固定的探針可以用作針對存在於反應試劑中的非位置特異性模板的探針。在後一種情況下，可以從不同的來源例如不同的微陣列獲得空間信息。可以使用一定的方式或機制例如移液或噴墨印表機將包括引物的擴增反應試劑精確地施加至想要的位置。然後，使用熱循環或等溫方式或方法進行擴增反應。多種熱和等溫方法是已知的，適用於選擇性擴增微陣列載玻片上的生物材料的任意此類方法均應被認為是在本發明的範圍內。在一個方面，可以通過首先封閉在陣列上的所有位置的擴增，然後精確地在感興趣區域解除封閉而將擴增控制在不連續位置。可以使用定向的光精確控制解除封閉。當然，應該理解，以上描述的安排僅僅是為了解釋本發明的原理的應用。本領域技術人員可以不脫離本發明的精神和範圍而獲得多種修飾和替代性安排，隨附的權利要求意在包括此類修飾和安排。因此，雖然上文以特性和細節聯同現在被認為是本發明的最實用和優選的實施方式描述了本發明，但是對本領域普通技術人員顯而易見的是可以不脫離本文給出的原理和概念作出多種改變，包括但不限於關於大小、材料、形狀、形式、功能和操作方式、組裝和用途的改變。
1權利要求
1.用於回收與微陣列載玻片偶聯的生物材料的方法，包括 選擇要從微陣列載玻片回收的生物材料；在微陣列載玻片表面上的獨特空間區域內找到該生物材料；和從所述獨特空間區域洗脫至少一部分所選擇的生物材料，但不從所述獨特空間區域之外的微陣列載玻片區域洗脫實質數量的非選擇的生物材料。
2.權利要求1的方法，其中所述洗脫進一步包括向所述獨特空間區域施加洗脫緩衝液。
3.權利要求2的方法，其中所述洗脫緩衝液是變性緩衝液，其作用是從微陣列載玻片表面釋放該部分的生物材料。
4.權利要求2的方法，其中將至少一部分的獨特空間區域加熱以促進從微陣列表面釋放至少一部分所選擇的生物材料。
5.權利要求1的方法，其中所選擇的生物材料為選自DNA、cDNA、RNA、肽、及其組合的成員O
6.用於從微陣列回收核酸材料的方法，包括選擇已經雜交至獨特空間區域內的微陣列載玻片表面的核酸材料； 向所述獨特空間區域施加變性緩衝液以使所選擇的核酸材料至少部分變性；和使用惰性回收緩衝液衝洗所述微陣列表面以回收所選擇的核酸材料的變性的部分。
7.權利要求6的方法，還包括從所述惰性回收緩衝液中收集所選擇的核酸材料的變性的部分。
8.權利要求6的方法，還包括向所述獨特空間區域施加熱量以促進至少一部分所選擇的核酸材料的變性。
9.用於從微陣列回收核酸材料的系統，其包括微陣列掃描器，其配置為掃描微陣列表面並鑑定待回收的核酸材料的位置； 分配器，其配置為接收來自所述微陣列掃描器的輸入並將洗脫緩衝液在由所述微陣列掃描器指定的位置處分配在所述微陣列表面的不連續分配區；和回收器，其配置為從所述微陣列表面回收所述洗脫緩衝液。
10.權利要求9的系統，還包括加熱器，其配置為加熱所述不連續分配區。
11.權利要求10的系統，其中所述加熱器是雷射。
12.權利要求10的系統，其中所述回收器是帶電的表面。
13.使用生物材料作為原位雜交探針的方法，包括 如權利要求1所述回收生物材料；使用所述生物材料作為用於原位雜交的探針。
14.權利要求13的方法，其中不經過顯著擴增使用所述生物材料作為探針。
15.權利要求13的方法，其中在被用作探針之前，所述生物材料經過擴增。
16.權利要求13的方法，其中所述原位雜交是螢光原位雜交。
17.選擇性標記與微陣列載玻片偶聯的生物材料的方法，包括 選擇待標記的生物材料；確定該生物材料在微陣列載玻片表面上的獨特空間區域內的位置；和標記至少一部分來自該獨特空間區域的所選擇的生物材料，而不標記來自所述獨特空間區域之外的微陣列載玻片區域的實質數量的非選擇的生物材料。
18.權利要求17的方法，其中所述標記進一步包括在獨特空間位置選擇性修飾生物材料；和使用僅能與經過之前修飾的那些生物材料反應的試劑處理微陣列載玻片的一部分或整個微陣列載玻片。
19.權利要求18的方法，其中使用定向的光選擇性修飾所述生物材料。
20.權利要求18的方法，其中使用分配劑選擇性修飾所述生物材料。
21.權利要求17的方法，其中所述標記還包括向所述獨特空間區域施加緩衝液，所述區域不包括實質上在所述獨特空間區域之外的微陣列載玻片的區域；和將標記物加入到所述獨特空間區域的緩衝液中，從而所述緩衝液內的至少一部分的生物材料摻入所述標記物。
22.權利要求17的方法，其中所選擇的生物材料為選自DNA、cDNA、RNA、肽、及其組合的成員。
23.用於選擇性擴增與微陣列載玻片偶聯的生物材料的方法，包括選擇待擴增的生物材料；確定該生物材料在微陣列載玻片表面上的獨特空間區域內的位置；和擴增至少一部分來自該獨特空間區域的所選擇的生物材料，而不擴增來自所述獨特空間區域之外的微陣列載玻片區域的實質數量的非選擇的生物材料。
24.權利要求23的方法，其中所述標記進一步包括在獨特空間位置選擇性修飾生物材料；和使用僅能與經過之前修飾的那些生物材料反應的試劑處理微陣列載玻片的一部分或整個微陣列載玻片。
25.權利要求對的方法，其中使用定向的光選擇性修飾所述生物材料。
26.權利要求對的方法，其中使用分配劑選擇性修飾所述生物材料。
27.權利要求23的方法，其中所述擴增還包括向所述獨特空間區域施加擴增緩衝液，所述區域不包括實質上在所述獨特空間區域之外的微陣列載玻片的區域；和擴增所述擴增緩衝液內的至少一部分的所選擇的生物材料。
28.權利要求23的方法，其中通過等溫循環擴增所選擇的生物材料的部分。
29.權利要求23的方法，其中通過熱循環擴增所選擇的生物材料的部分。
全文摘要
本發明提供了用於從微陣列載玻片上的獨特空間位置上選擇性洗脫生物材料的方法和系統。例如，在一個方面，用於回收與微陣列載玻片偶聯的生物材料的方法可以包括選擇要從微陣列載玻片回收的生物材料，在微陣列載玻片表面上的獨特空間區域內找到該生物材料，並且從所述獨特空間區域洗脫至少一部分所選擇的生物材料，但不從所述獨特空間區域之外的微陣列載玻片區域洗脫實質數量的非選擇的生物材料。
文檔編號G01N33/50GK102292635SQ200980145609
公開日2011年12月21日 申請日期2009年9月18日 優先權日2008年9月22日
發明者A·阿利凡特, N·阿迪, W·敖 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司