檢測罌粟鹼的膠體金免疫試紙及其製備方法

2023-09-21 08:45:15 4

專利名稱：檢測罌粟鹼的膠體金免疫試紙及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種罌粟鹼檢測試紙及其製備方法。
背景技術：
近年來，許多不法商販為了謀取暴利，在食品裡面加入了罌粟殼的粉狀物，罌慄殼(Fructus Depavevia)系罌粟科植物採完阿片後的乾燥成熟果殼，內含罌粟鹼(Papavarine)、嗎啡、那可汀、可待因、那碎因等多種生物鹼。儘管罌粟殼已不是真正意義上的毒品，但它也含有罌粟鹼、可待因、嗎啡等毒性成分，吃少量的罌粟殼粉也會讓人上癮，長期服用後，就相當於吸毒，易使人體產生依賴性，而造成癮癖，對人體肝臟、心臟有毒害作用，危害極大。罌粟殼的粉末添加到湯料或火鍋料等裡面，沒有特別味道，而且沒有顏色，消費者自己無法判別。在食品中添加罌粟殼是國家嚴令禁止的違法行為。罌粟鹼是罌粟殼中主要生物鹼之一。對罌慄鹼的檢測一般採用色譜法，儘管色譜法能夠精確定量，但由於其不僅需要貴重儀器，而且操作過程繁瑣、時間長，操作人員必須具有一定的專業技術知識，才能操作，因此應用範圍受限。

發明內容
本發明的目的是克服現有技術中的不足，提供一種檢測罌粟鹼的膠體金免疫試紙。
本發明的第二個目的是提供一種檢測罌粟鹼的膠體金免疫試紙的製備方法。
本發明的技術方案概述如下一種檢測罌粟鹼的膠體金免疫試紙，包括基板，在所述基板上依次設置有吸水紙、硝酸纖維膜、玻璃纖維膜及加樣紙，所述玻璃纖維膜浸泡於標記罌粟鹼抗體的膠體金探針中，取出，乾燥，所述硝酸纖維膜上設置有罌粟鹼與卵清蛋白的偶連物和羊抗兔抗體。
所述硝酸纖維膜上設置的罌粟鹼與卵清蛋白的偶連物和羊抗兔抗體為點膜機噴成的兩條線。
所述吸水紙的長度為25-35mm，最好為30mm，所述硝酸纖維膜的長度為20-30mm，最好為25mm，所述玻璃纖維膜的長度為1-10mm，最好為6mm，所述加樣紙的長度為10-20mm，最好為15mm。
所述基板的材料最好為聚氯乙烯。
一種檢測罌粟鹼的膠體金免疫試紙的製備方法，包括如下步驟(1)膠體金的製備；(2)膠體金探針的標記將罌粟鹼抗體用0.005mol/L NaCl溶液透析過夜，離心除去蛋白沉澱，調至0.1～0.5mg/mL；取膠體金100mL，調節膠體金溶液pH為9.0，攪拌下加入2.4mL稀釋的罌慄鹼抗體，繼續攪拌5-15分鐘，加入小牛血清白蛋白，使其質量百分比濃度為1％，再攪拌5-15分鐘，離心20分鐘；棄沉澱，上清以10000-15000轉/分鐘，離心30-60分鐘；棄上清，沉澱用0.01mol/L含有質量百分比濃度為1％小牛血清白蛋白的磷酸鹽緩衝液，重新懸浮；將沉澱用0.01mol/L含有質量百分比濃度為1％小牛血清白蛋白的磷酸鹽緩衝液加質量百分比濃度為0.02％疊氮鈉5-10mL懸浮，4℃保存備用；(3)罌粟鹼與卵清蛋白的偶連物的合成取0.15-0.5mL罌粟鹼氨基衍生物加入2.85mL無水乙醇，再滴加9mL雙蒸水，最後加入150～200mg1-乙基-3-(3二甲氨丙基)鹽酸碳二亞胺；在上述溶液中加入7mg卵清蛋白，攪拌30min；加入150～200mg 1-乙基-3，(3-二級甲氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽，4℃攪拌反應，8-12小時；將上述反應液裝入透析袋，用0.01mol/L的磷酸鹽緩衝鹽液透析2-4天；(4)製備檢測罌粟鹼的膠體金免疫試紙先將玻璃纖維膜放入含1％小牛血清白蛋白、1％吐溫-20的磷酸鹽緩衝液中浸泡30min，37℃烘乾，再將玻璃纖維膜浸泡於標記罌粟鹼抗體的膠體金探針中，真空乾燥；在硝酸纖維膜上用點膜機將罌粟鹼與卵清蛋白的偶連物和羊抗兔抗體噴成兩條線，分別為檢測線和質控線，經真空乾燥後，用含有1％小牛血清白蛋白的磷酸鹽緩衝鹽液封閉2h，以0.01mol/L磷酸鹽緩衝鹽液洗滌，再真空乾燥；將吸水紙、硝酸纖維膜、玻璃纖維膜和加樣紙，依次粘於基板上，裁成細條，即製成一種檢測罌粟鹼的膠體金免疫試紙。
膠體金免疫試紙有操作簡便快速、成本低、攜帶方便、非專業人員也能操作及可進行現場檢測等優點。


圖1為本發明的結構示意圖；圖2為本發明檢測罌粟鹼的膠體金免疫試紙的判讀圖。
具體實施例方式
下面結合附圖和實施例對本發明作進一步的說明。
一種檢測罌粟鹼的膠體金免疫試紙，包括基板1，在所述基板上依次設置有吸水紙2、硝酸纖維膜3、玻璃纖維膜4及加樣紙5，玻璃纖維膜浸泡於標記罌粟鹼抗體的膠體金探針中，取出，乾燥，所述硝酸纖維膜上設置有罌粟鹼與卵清蛋白的偶連物6和羊抗兔抗體7。
實施例1罌粟鹼檢測膠體金免疫試紙製備方法，它包括如下步驟1.膠體金的製備用三蒸水溶解氯金酸，使其終濃度為0.1g/L。先進行沸水浴，待氯金酸溶液煮沸後，每100mL加入1％檸檬酸三鈉2.5mL，再沸水浴下快速攪拌，直到氯金酸溶液的顏色穩定，繼續沸水浴10min。
2.膠體金探針的標記將罌慄鹼抗體用0.005mol/L NaCl溶液透析過夜，離心除去蛋白沉澱，調至0.5mg/mL，取膠體金100mL，用0.2mol/L的碳酸鉀把膠體金溶液調至pH為9.0，磁力快速攪拌下緩慢加入2.4mL稀釋的罌粟鹼抗體，繼續攪拌10min，加入小牛血清白蛋白，使其質量百分比濃度為1％，再攪拌10min，將初步製得的膠體金探針以4000rpm離心20min；棄沉澱，上清以10000rpm離心60min；棄上清，沉澱用0.01mol/L含有質量百分比濃度為1％小牛血清白蛋白的磷酸鹽緩衝液，重新懸浮；同前離心洗滌二次，將沉澱用0.01mol/L含有質量百分比濃度為1％小牛血清白蛋白的磷酸鹽緩衝液加0.02％疊氮鈉10mL，懸浮，4℃保存備用。
3.罌粟鹼與卵清蛋白的偶連物的合成小分子物質難以固定在硝酸纖維膜上，只有使它連上大分子物質才能較好地固定。取0.15mL罌粟鹼氨基衍生物加入2.85mL無水乙醇，再滴加9mL雙蒸水，最後加入150mg 1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)鹽酸碳二亞胺；在上述溶液中加入7mg卵清蛋白，攪拌30min；加入150mg 1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)鹽酸碳二亞胺，4℃攪拌反應8小時；將上述反應液裝入透析袋，用0.01mol/L的磷酸鹽緩衝鹽液透析4天。
4.製備檢測罌粟鹼的膠體金免疫試紙將玻璃纖維膜裁成長6mm的細條，然後放入含有質量百分比濃度為1％小牛血清白蛋白、質量百分比濃度為1％的吐溫-20的磷酸鹽緩衝液中浸泡30min，37℃烘乾，再將玻璃纖維膜浸泡於標記罌粟鹼抗體的膠體金探針中，真空乾燥；在硝酸纖維膜上用點膜機將罌粟鹼與卵清蛋白的偶連物和羊抗兔抗體噴成兩條線，分別為檢測線和質控線，經真空乾燥後，用含有質量百分比濃度為1％小牛血清白蛋白的磷酸鹽緩衝鹽液封閉2h，以0.01mol/L磷酸鹽緩衝鹽液洗滌，再真空乾燥。將長為30mm吸水紙、25mm硝酸纖維膜、6mm玻璃纖維膜、15mm加樣紙，依次粘於聚氯乙烯板上，裁成細條，即製成罌粟鹼檢測膠體金免疫試紙。
實施例2罌粟鹼檢測膠體金免疫試紙製備方法，它包括如下步驟1.膠體金的製備(同實施例1)2.膠體金探針的標記將罌粟鹼抗體用0.005mol/L NaCl溶液透析過夜，離心除去蛋白沉澱，調至0.1mg/mL，取膠體金100mL，用0.2mol/L的碳酸鉀把膠體金溶液調至pH為9.0，磁力快速攪拌下緩慢加入2.4mL稀釋的罌粟鹼抗體，繼續攪拌5min，加入小牛血清白蛋白，使其質量百分比濃度為1％，再攪拌5min，將初步製得的膠體金探針以4000rpm離心20min；棄沉澱，上清以15000rpm離心30min；棄上清，沉澱用0.01mol/L含有質量百分比濃度為1％小牛血清白蛋白的磷酸鹽緩衝液，重新懸浮；同前離心洗滌二次，將沉澱用0.01mol/L含有質量百分比濃度為1％小牛血清白蛋白的磷酸鹽緩衝液加0.02％疊氮鈉5mL，懸浮，4℃保存備用。
3.罌粟鹼與卵清蛋白的偶連物的合成取0.5mL罌粟鹼氨基衍生物加入2.85mL無水乙醇，再滴加9mL雙蒸水，最後加入150mg 1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)鹽酸碳二亞胺；在上述溶液中加入7mg卵清蛋白，攪拌30min；加入200mg 1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)鹽酸碳二亞胺，4℃攪拌反應12小時；將上述反應液裝入透析袋，用0.01mol/L的磷酸鹽緩衝鹽液透析2天。
4.製備檢測罌粟鹼的膠體金免疫試紙將玻璃纖維膜裁成長1mm的細條，然後放入含有質量百分比濃度為1％小牛血清白蛋白、質量百分比濃度為1％的吐溫-20的磷酸鹽緩衝液中浸泡30min，37℃烘乾，再將玻璃纖維膜浸泡於標記罌粟鹼抗體的膠體金探針中，真空乾燥；在硝酸纖維膜上用點膜機將罌慄鹼與卵清蛋白的偶連物和羊抗兔抗體噴成兩條線，分別為檢測線和質控線，經真空乾燥後，用含有質量百分比濃度為1％小牛血清白蛋白的磷酸鹽緩衝鹽液封閉2h，以0.01mol/L磷酸鹽緩衝鹽液洗滌，再真空乾燥。將長為25mm吸水紙、30mm硝酸纖維膜、1mm玻璃纖維膜、20mm加樣紙，依次粘於聚氯乙烯板上，裁成細條，即製成罌粟鹼檢測膠體金免疫試紙。
實施例3罌粟鹼檢測膠體金免疫試紙製備方法，它包括如下步驟1.膠體金的製備(同實施例1)2.膠體金探針的標記將罌粟鹼抗體用0.005mol/LNaCl溶液透析過夜，離心除去蛋白沉澱，調至0.3mg/mL，取膠體金100mL，用0.2mol/L的碳酸鉀把膠體金溶液調至pH為9.0，磁力快速攪拌下緩慢加入2.4mL稀釋的罌粟鹼抗體，繼續攪拌15min，加入小牛血清白蛋白，使其質量百分比濃度為1％，再攪拌15min，將初步製得的膠體金探針以4000rpm離心20min；棄沉澱，上清以13000rpm離心45min；棄上清，沉澱用0.01mol/L含有質量百分比濃度為1％小牛血清白蛋白的磷酸鹽緩衝液，重新懸浮；同前離心洗滌二次，將沉澱用0.01mol/L含有質量百分比濃度為1％小牛血清白蛋白的磷酸鹽緩衝液加0.02％疊氮鈉7mL，懸浮，4℃保存備用。
3.罌粟鹼與卵清蛋白的偶連物的合成取0.3mL罌粟鹼氨基衍生物加入2.85mL無水乙醇，再滴加9mL雙蒸水，最後加入200mg 1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)鹽酸碳二亞胺；在上述溶液中加入7mg卵清蛋白，攪拌30min；加入180mg 1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)鹽酸碳二亞胺，4℃攪拌反應10小時；將上述反應液裝入透析袋，用0.01mol/L的磷酸鹽緩衝鹽液透析3天。
4.製備檢測罌粟鹼的膠體金免疫試紙將玻璃纖維膜裁成長10mm的細條，然後放入含有質量百分比濃度為1％小牛血清白蛋白、質量百分比濃度為1％的吐溫-20的磷酸鹽緩衝液中浸泡30min，37℃烘乾，再將玻璃纖維膜浸泡於標記罌粟鹼抗體的膠體金探針中，真空乾燥；在硝酸纖維膜上用點膜機將罌粟鹼與卵清蛋白的偶連物和羊抗兔抗體噴成兩條線，分別為檢測線和質控線，經真空乾燥後，用含有質量百分比濃度為1％小牛血清白蛋白的磷酸鹽緩衝鹽液封閉2h，以0.01mol/L磷酸鹽緩衝鹽液洗滌，再真空乾燥。將長為35mm吸水紙、20mm硝酸纖維膜、10mm玻璃纖維膜、10mm加樣紙，依次粘於聚氯乙烯板上，裁成細條，即製成罌粟鹼檢測膠體金免疫試紙。
實施例4
罌粟鹼檢測膠體金免疫試紙的使用方法如下實際工作中有三種檢樣一種是含油脂較多含蛋白質較少的清湯(如火鍋湯等)，用石油醚抽提除油脂後直接測定；一種是比較粘稠含油脂較多的肉汁(如牛腩汁等)，這種檢樣通過三個步驟處理首選取10mL樣品加2～3倍蒸餾水稀釋，然後用石油醚抽提油脂2～3次，棄去醚層，最後加入一定濃度的硝酸鉛除蛋白；另一種是含油脂和蛋白質都較少的清湯，可直接檢測。檢測將加樣紙一端插入待測液中，溼潤後取出，水平放置，約3～5min，觀察結果見圖2。如試紙條硝酸纖維膜上僅質控線出現一條紫紅色帶為陽性；如出現兩條紫紅色帶為陰性；如質控線不出現紫紅色帶，無論檢測線是否出現，測試結果均無效。
權利要求
1.一種檢測罌粟鹼的膠體金免疫試紙，包括基板，其特徵在所述基板上依次設置有吸水紙、硝酸纖維膜、玻璃纖維膜及加樣紙，所述玻璃纖維膜浸泡於標記罌粟鹼抗體的膠體金探針中，取出，乾燥，所述硝酸纖維膜上設置有罌粟鹼與卵清蛋白的偶連物和羊抗兔抗體。
2.根據權利要求1所述的一種檢測罌粟鹼的膠體金免疫試紙，其特徵是所述硝酸纖維膜上設置的罌粟鹼與卵清蛋白的偶連物和羊抗兔抗體為點膜機噴成的兩條線。
3.根據權利要求1所述的一種檢測罌粟鹼的膠體金免疫試紙，其特徵是所述吸水紙的長度為25-35mm，所述硝酸纖維膜的長度為20-30mm，所述玻璃纖維膜的長度為1-10mm，所述加樣紙的長度為10-20mm。
4.根據權利要求1所述的一種檢測罌粟鹼的膠體金免疫試紙，其特徵是所述基板的材料為聚氯乙烯。
5.根據權利要求3所述的一種檢測罌粟鹼的膠體金免疫試紙，其特徵是所述吸水紙的長度為30mm，所述硝酸纖維膜的長度為25mm，玻璃纖維膜的長度為6mm，所述加樣紙的長度為15mm。
6.一種檢測罌粟鹼的膠體金免疫試紙的製備方法，包括如下步驟(1)膠體金的製備；(2)膠體金探針的標記將罌粟鹼抗體用0.005mol/L NaCl溶液透析過夜，離心除去蛋白沉澱，調至0.1～0.5mg/mL；取膠體金100mL，調節膠體金溶液pH為9.0，攪拌下加入2.4mL稀釋的罌粟鹼抗體，繼續攪拌5-15分鐘，加入小牛血清白蛋白，使其質量百分比濃度為1％，再攪拌5-15分鐘，離心20分鐘；棄沉澱，上清以10000-15000轉/分鐘，離心30-60分鐘；棄上清，沉澱用0.01mol/L含有質量百分比濃度為1％小牛血清白蛋白的磷酸鹽緩衝液，重新懸浮；將沉澱用0.01mol/L含有質量百分比濃度為1％小牛血清白蛋白的磷酸鹽緩衝液加質量百分比濃度為0.02％疊氮鈉5-10mL懸浮，4℃保存備用；(3)罌粟鹼與卵清蛋白的偶連物的合成取0.15-0.5mL罌粟鹼氨基衍生物加入2.85mL無水乙醇，再滴加9mL雙蒸水，最後加入150～200mg1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)鹽酸碳二亞胺；在上述溶液中加入7mg卵清蛋白，攪拌30min；加入150～200mg1-乙基-3，(3-二級甲氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽，4℃攪拌反應8-12小時；將上述反應液裝入透析袋，用0.01mol/L的磷酸鹽緩衝鹽液透析2-4天；(4)製備檢測罌粟鹼的膠體金免疫試紙先將玻璃纖維膜放入含質量百分比濃度為1％小牛血清白蛋白、質量百分比濃度為1％吐溫-20的磷酸鹽緩衝液中浸泡30min，37℃烘乾，再將玻璃纖維膜浸泡於標記罌粟鹼抗體的膠體金探針中，真空乾燥；在硝酸纖維膜上用點膜機將罌粟鹼與卵清蛋白的偶連物和羊抗兔抗體噴成兩條線，分別為檢測線和質控線，經真空乾燥後，用含有質量百分比濃度為1％小牛血清白蛋白的磷酸鹽緩衝鹽液封閉2h，以0.01mol/L磷酸鹽緩衝鹽液洗滌，再真空乾燥；將吸水紙、硝酸纖維膜、玻璃纖維膜和加樣紙，依次粘於基板上，裁成細條，即製成一種檢測罌粟鹼的膠體金免疫試紙。
全文摘要
本發明公開了一種檢測罌粟鹼的膠體金免疫試紙及其製備方法，檢測罌粟鹼的膠體金免疫試紙包括基板，在所述基板上依次設置有吸水紙、硝酸纖維膜、玻璃纖維膜及加樣紙，所述玻璃纖維膜浸泡於標記罌粟鹼抗體的膠體金探針中，取出，乾燥，所述硝酸纖維膜上設置有罌粟鹼與卵清蛋白的偶連物和羊抗兔抗體，本發明的試紙有操作簡便快速、成本低、攜帶方便、非專業人員也能操作及可進行現場檢測等優點。
文檔編號G01N33/558GK1657938SQ200510016288
公開日2005年8月24日 申請日期2005年3月11日 優先權日2005年3月11日
發明者高志賢, 方邢有, 周煥英, 王紅勇, 房彥軍, 趙曉聯 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所