一種抗氧化活性肽及其製備方法
2023-09-21 23:47:50 3
專利名稱：一種抗氧化活性肽及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種抗氧化活性肽，本發明還涉及一種該抗氧化活性肽的製備 方法。
背景技術：
玉米蛋白粉(Corn Gluten Meal縮寫CGM)俗稱玉米黃粉，是玉米溼法生 產澱粉的副產物之一，約含60%的蛋白質，抽樣檢測其蛋白質組成為玉米醇溶 蛋白(zein)佔68%、谷蛋白(glutelin)佔22%，其餘為球蛋白(globulins) 和白蛋白(albumin)。玉米蛋白粉是一種資源豐富、成本低廉的天然植物蛋白 原料，但就其胺基酸組成而言，由於賴氨酸和色氨酸的含量都不高，所以玉米 蛋白是一種非全營養蛋白。另外，玉米蛋白粉所含的蛋白質難溶於水，組成復 雜，口感粗糙，因此，無論是在食品領域還是在飼料行業都很少有人予以重視， 有些工廠甚至將其與其它副產物一起不加回收就自然排放掉了，這不僅是對糧 食資源的一種浪費，同時也對生態環境造成了一定程度的汙染。
再者，由於人類生存環境和生活方式、尤其是飲食結構的改變，體內環境 也在發生著潛移默化的改變。以基礎物質代謝為例，越來越多的過氧化物質和 有害自由基正在人們體內源源不斷的生成，嚴重地威脅著人們的健康。對此， 絕大多數人都缺少認知。雖然醫學專業人員為解決這一問題做了很多的研究， 但是目前真正能夠起到預防氧化、有效抑制體內自由基形成的高活性抗氧化物 質還不很多，這就需要我們相關專業的技術人員進一步做出更多的努力。
發明內容
本發明要解決的第一個技術問題是提供一種抗氧化活性肽，由於生產該產 品的主要原料是玉米蛋白粉，首先為這種長期被冷落、被遺棄的天然資源提供 了一種有效的利用途徑，同時還開發出了一種具有防治疾病、抗衰老等功能， 可以做為醫藥、化妝品等產品添加劑使用的抗氧化活性肽。本發明要解決的另 一個技術問題是提供一種該抗氧化活性肽的製備方法。
本發明產品抗氧化活性肽的分子量在20，100-31，000之間，N端5個胺基酸 序列為K-V-T-Y-H，抗氧化活力為236.68U/mL。
本發明產品抗氧化活性肽的製備方法以微生物納豆芽孢桿菌(Bac,7/附 為菌種，以玉米蛋白粉為原料，採用液態培養方式，獲得具有抗氧化活 性的多肽混合物，再通過離子交換層析、凝膠層析、反相色譜逐級收集高活性 且分子量〉5，000Da部分，最後通過凝膠電泳獲得。
在上述技術方案中所使用的納豆芽孢桿菌(J fl"7/"simrto)可以採用現有品 種，該菌種目前已經很容易得到。本發明最優選的菌種是本課題組於日本傳統 食品納豆中分離、篩選得到的，保藏號為00]\1<:€]\0.2236的菌株。該菌種最 突出的特性就是其分泌蛋白酶的活力較現有菌株至少要高出2.66%。
本發明產品製備的具體方法
1、發酵液的製備
以納豆芽孢桿菌(5""7/"s"a/to)為發酵菌種，將lmL種子培養液接入裝 有初始pH7.0的30mL發酵培養基的250mL三角瓶中，於34°C 、 200r/min條 件下振蕩培養32h後5000 r/min離心10min，在沸水浴中滅酶活10min，所得 液體為抗氧化活性肽的混合物。2、 DEAE-Sepharose Fast Flow弱陰離子交換層析
將第一步所得的混合物10000r/min離心15min，取上清液過0.22pm的微 孔濾膜，濾液進行弱陰離子交換層析((p2.6*20cm)。起始緩衝液25mmol/L pH 9.0Tris-HCl ，洗脫液含lmol NaCl的25mmol/L pH 9.0 Tris-HCl，流速 1.5mL/min, UV280nm處檢測。測定各管收集液的抗氧化活力，收集高活性部 分備用。
3、 Sephadex G-25凝膠過濾層析
① 將DEAE-S印harose Fast Flow的高活力樣品冷凍抽乾濃縮後，用洗脫液 25mmol/L pH 9.0 Tris-HCl溶解後進行凝膠層析脫鹽((pl.6*50)，流速2.0mL/ min， UV280nm處檢測。測定各管收集液的抗氧化活力，收集高活性部分備用。
② 將Q- Sepharose HP的高活力樣品冷凍抽乾濃縮後，用洗脫液雙蒸水溶 解後10000r/min離心10min，取上清液進行凝膠層析脫鹽(cpl.6*50),流速 2.0mL/min， UV280nm處檢測，測定各管收集液的抗氧化活力，收集高活性且 分子量〉5，000Da部分備用。
4、 Q-SepharoseHP強陰離子交換層析色譜
將進行過①Sephadex G-25脫鹽後的活性部分進行Q-Sepharose HP分離。 起始緩衝液25mmol/L pH 9.0 Tris-HCl，洗脫液:含lmolNaCl的25mmol/L pH 9.0Tris-HCl，流速2.0mL/min， UV280nm處檢測，測定各管收集液的抗氧化 活力，收集高活性且分子量〉5，000Da部分備用。
5、 CM-S印harose Fast Flow弱陽離子交換層析
將進行過②Sephadex G-25脫鹽後的活性部分進行CM-Sepharose Fast Flow色譜分離。起始緩衝液lmmol/L pH 3.0 Gly-HCl，洗脫液含lmol NaCl的0.001mol/LpH3.0Gly-HCl，流速2.0mL/min， UV280nm處檢測，測定各 管收集液的抗氧化活力，收集活性部分備用。
6、 反相色譜
RESOURCE RPC (3mL)反相色譜分離
將經過②Sephadex G-25脫鹽後活性部分進行RESOURCE RPC 3mL反 相色譜分離。洗脫液A: 0.065%TFA， 2%乙腈；洗脫液B: 0.05%TFA, 80% 乙腈；流速1.0mL/min， UV280nm處檢測。測定各管收集液的抗氧化活力， 收集活性部分作下一步色譜分離用。
② 第一次SymmetryShield TMRP 18 ( 5jim)反相色譜
將進行過CM-Sepharose Fast Flow的高活力樣品，進行Symmetry Shield TMRP18反相色譜分離。洗脫液A: 0.065%TFA ， 2%乙腈；洗脫液B: 0.05%TFA， 80%乙腈；流速1.0mL/min， UV280nm處檢測。測定各管收集 液的抗氧化活力，收集活性部分進行第二次SymmetryShield TMRP 18反相色譜
③ 第二次SymmetryShield RP 18 (5jim)反相色譜 將第一次進行SymmetryShield TMRP 18反相色譜分離的高活力部分冷凍抽
幹後進行第二次SymmetryShield RP 18分離。洗脫液A: 0.065%TFA， 8% 乙腈；洗脫液B: 0.05%TFA， 60%乙腈；流速1.0mL/min, UV280nm處檢 測，測定各管收集液的抗氧化活力，收集活性部分進行蛋白質電泳。
7、 酸、鹼性PAGE凝膠電泳垂直板電泳槽中灌注交聯度為2.6%，濃度 為10% (w/v)分離膠和5% (w/v)濃縮膠。鹼性電泳濃縮膠部分恆壓40v，分離膠部分恆壓70v，電泳2.0h左右。酸性電泳濃縮膠部分恆壓100v，分離膠部 分恆壓200v，電泳4.0h。
本發明的有益效果是本發明設計的產品具有很高的抗氧化活力，經測定 為236.68U/mL。純品可滿足對抗氧化活性肽結構、物性測定，活性、毒理實 驗，乃至於治療、培育等大規模應用的要求。同時抗氧化活性物質對超氧陰離 子自由基和羥基自由基有強烈的清除作用，並能顯著抑制紅細胞和肝臟、心臟、 腦組織脂質過氧化反應的發生，具有防治疾病、抗衰老等功能，所以本發明產 品可進一步開發成醫藥、化妝品等產品添加劑使用。
本發明中優選的納豆芽孢桿菌(^"7/附/m加)菌株已由本申請人於2007 年10月30日向中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC) 提供了保藏，保藏號為CGMCCNo.2236。
具體實施例方式
實施例1:
1、 菌種納豆芽孢桿菌(5fl"7/附wfl加)菌株，保藏號為CGMCC No.2236。
2、 斜面培養基及培養條件
斜面培養基牛肉膏O.Sg,蛋白腖lg， NaC10.5g，瓊脂2g，水100mL， pH7.0-7.2， 37。C培養12h。
實施例2:
1、 菌種、斜面培養同實施例1
2、 種子培養基及培養條件
種子培養基蛋白腖lg，葡萄糖2g, K2HPO40.1g， MgSO40.05g，水100mL， pH7.0-7.2， 37°C、 200r/min條件下振蕩培養12h。實施例3:
1、 菌種、斜面培養同實施例1
2、 種子培養同實施例2
3、 主要檢測方法
(1) 蛋白含量測定Folin-酚法
(2) 抗氧化活力測定鄰苯三酚自氧化法
4、 發酵培養基及發酵條件
發酵培養基玉米蛋白粉與水按一定比例配製。
取lmL種子培養液接入裝有初始pH7.0的30mL發酵培養基的250mL三 角瓶中，34°C、 200r/min條件下振蕩培養32h。
實施例4:
1、 斜面培養同實施例1
2、 種子培養同實施例2
3、 發酵條件同實施例3
4、 抗氧化活性肽的分離純化
將發酵液10000r/min離心15min後，取上清液用0.22jim微孔濾膜過濾， 濾液進行弱陰離子交換層析，收集活性髙的部分用Sephadex G-25凝膠層析脫 鹽。脫鹽後的活性部分進行Q-SepharoseHP色譜分離，收集活性髙的部分用 Sephadex G-25凝膠層析進行脫鹽。脫鹽後的收集的活性部分再次進行弱陰離子 交換層析分離並脫鹽。收集活性部分進行Symmetry Shield TMRP 18反相色譜分 離，收集高活性部分第二次經SymmetryShieldTMRP18反相色譜分離，收集活 性部分進行蛋白質電泳，並印跡至PVDF膜上。實施例5:
1、 斜面培養同實施例1
2、 種子培養同實施例2
3、 發酵條件同實施例3
4、 抗氧化活性肽的分離純化同實施例4
5、 抗氧化活性肽的胺基酸序列的測定
將印跡到PVDF膜上的肽送到上海生化蛋白質組學研究分析中心用PE公 司的ABI491A胺基酸序列分析儀進行胺基酸序列測定。
實施例6
本發明產品抗氧化活力的測定，採用的方法是改進的鄰苯三酚自氧化法， 採用4.5mL體系對各組分進行鄰苯三酚自氧化的測定。Tris-HCl (pH8.2， 0.05mol/L) 4.5mL， 25。C水浴保溫20min,對照管中加O.01mol/L HC1 10jiL和 4.5mL Tris-HCl，空白管中加入25°C預熱的45mmol/L的鄰苯三酚10jiL和4.5mL Tris-HCl混勻，開始計時，反應30s後，於325nm處作時間掃描，反應4min， 空白最佳的自氧化速率控制為0.070±0.002A/min,取玉米蛋白水解液10pL加入 到Tris-HCl緩衝液4.5mL中，同25。C預熱的45mmol/L的鄰苯三酚lOpL混勻， 30s後，於325nm處掃描，最後計算抗氧化活力。
計算酶活力(U/mL) = ( ODA-ODB) /ODaX100。/。/50。/。xV N/V2 其中Vr反應液總體積，mL
Vr測定樣品的體積，mL N-樣品稀釋倍數 ODA-鄰苯三酚自氧化法速率ODB-樣品光密度值變化速率 經測定其抗氧化活力為236.68U/mL。
實施例7
本發明產品胺基酸序列的測定，所採用的方法是Edman降解法，測定該 抗氧化活性肽的胺基酸序列結果是該肽N端5個胺基酸序列為K-V-T-Y-H。
權利要求
1、一種抗氧化活性肽，其特徵是該產品的分子量在20,100--31,000之間，N端5個胺基酸序列為K-V-T-Y-H，抗氧化活力為236.68U/mL。
2、 一種如權利要求1所述抗氧化活性肽的製備方法，其特徵是該產品 是以玉米蛋白粉為原料，使用納豆芽孢桿菌(5fl"7/附/iWto)為發酵菌種，採用 液態培養方式，獲得具有抗氧化活性的多肽混合物，再通過離子交換層析、凝 膠層析、反相色譜，逐級收集高活性並分子量〉5，000Da部分，最後通過電泳分 離獲得。
3、 根據權利要求2所述的抗氧化活性肽的製備方法，其特徵是所述的 納豆芽孢桿菌(5fl"7/"s/m"o)菌種為本申請人於2007年10月30日在中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏號為CGMCC No.2236的菌株。
4、 一種如權利要求2或3所述抗氧化活性肽的製備方法，其特徵是所述 的液態培養方式如下；取發酵菌種納豆芽孢桿菌(^1"7/附《^似)菌株，將lmL 種子培養液接入裝有初始pH7.0的30mL發酵培養基的250mL三角瓶中，於 34。C 、 200r/min條件下振蕩培養32h後5000 r/min離心10min,在沸水浴中滅 酶活10min，所得液體為抗氧化活性肽混合物。
5、 一種如權利要求4所述抗氧化活性肽的製備方法，其特徵是所述的 離子交換層析包括弱陰離子交換層析，具體;r序為使用的弱陰離子為DEAE 一SepharoseFastFlow，具體步驟是將抗氧化活性肽混合物10000r/min離心 15min ，取上清液過0.22jim微孔濾膜，濾液進行弱陰離子交換層析((p2.6*20cm );起始緩衝液25mmol/L pH 9.0 Tris-HCl ,洗脫液含lmol NaCl的25mmol/L pH9.0Tris-HCl，流速1.5mL/min， UV280nm處檢測，測定各管收集液的抗 氧化活力，收集高活性部分備用。
6、 一種如權利要求5所述抗氧化活性肽的製備方法，其特徵是所述的凝 膠層析採用Sephadex G-25,具體步驟是① 將DEAE-Sepharose Fast Flow的高活力樣品冷凍抽乾濃縮後，用洗脫液 25mmol/L pH 9.0 Tris-HCl溶解後進行凝膠層析脫鹽(q>1.6*50)，流速為 2.0mL/min， UV280nm處檢測；測定各管收集液的抗氧化活力，收集高活性部 分備用；② 將Q- S印harose HP的高活力樣品冷凍抽乾濃縮後，用洗脫液雙蒸水溶 解後10000r/min離心lOmin，取上清液進行凝膠層析脫鹽(<pl.6*50)，流速 2.0mL/min， UV280nm處檢測，測定各管收集液的抗氧化活力，收集高活性並 分子量〉5，000Da部分備用。
7、 一種如權利要求6所述抗氧化活性肽的製備方法，其特徵是所述的反 相色譜包括強陰離子交換層析色譜，採用的是Q-SepharoseHP，具體步驟是 將進行過Sephadex G-25脫鹽後的活性部分進行Q-S印harose HP分離，起始緩 衝液25mmol/L pH 9.0 Tris-HCl，洗脫液:含ImolNaCI的25mmol/L pH 9.0 Tris-HCl,流速2.0mL/min， UV280nm處檢測，測定各管收集液的抗氧化活 力，收集高活性並分子量〉5，000Da部分備用。
8、 一種如權利要求7所述抗氧化活性肽的製備方法，其特徵是所述的離 子交換層析還包括弱陽離子交換層析，使用的是CM-Sepharose Fast Flow,具 體步驟是將進行過Sephadex G-25脫鹽後的活性部分進行CM-Sepharose FastFlow色譜分離；起始緩衝液lmmol/LpH3.0Gly-HCl，洗脫液含lmolNaCl 的0.001mol/LpH3.0Gly-HCl，流速2.0mL/min， UV280nm處檢測，測定各 管收集液的抗氧化活力，收集活性部分備用。
9、 一種如權利要求8所述抗氧化活性肽的製備方法，其特徵是所述的反 相色譜分離步驟包括 RESOURCE RPC (3mL)反相色譜分離將經過②S印hadex G-25脫鹽後活性部分進行RESOURCE RPC 3mL反 相色譜分離；洗脫液A: 0.065%TFA， 2%乙腈；洗脫液B: 0.05%TFA, 80% 乙腈；流速1.0mL/min， UV280nm處檢測；測定各管收集液的抗氧化活力， 收集活性部分作下一步色譜分離用；② 第一次SymmetryShield TMRP 18 ( 5jun)反相色譜將進行過CM-Sepharose Fast Flow的高活力樣品，進行Symmetry Shield TMRP18反相色譜分離；洗脫液A: 0.065%TFA , 2%乙腈；洗脫液B: 0.05%TFA， 80%乙腈；流速1.0mL/min， UV280nm處檢測；測定各管收集 液的抗氧化活力，收集活性部分進行第二次SymmetryShield TMRP 18反相色譜③ 第二次SymmetryShield TMRP 18 (5jim)反相色譜 將第一次進行SymmetryShield TMRP 18反相色譜分離的高活力部分冷凍抽乾後進行第二次SymmetryShield TMRP 18分離；洗脫液A: 0.065%TFA， 8% 乙腈；洗脫液B: 0.05%TFA， 60%乙腈；流速1.0mL/min， UV280nm處檢測，測定各管收集液的抗氧化活力，收集活性部分進行蛋白質電泳。
10、 一種如權利要求9所述抗氧化活性肽的製備方法，其特徵是所述的 酸、鹼性PAGE凝膠電泳垂直板電泳槽中灌注交聯度為2.6%，濃度為10% (w/v)分離膠和5% (w/v)濃縮膠；鹼性電泳濃縮膠部分恆壓40v，分離膠部分 恆壓70v，電泳2.0h;酸性電泳濃縮膠部分恆壓100v，分離膠部分恆壓200v，電 泳4.0h。
全文摘要
本發明公開了一種抗氧化活性肽及其製備方法，產品是以微生物納豆芽孢桿菌(Bacillus natto)為菌種，玉米蛋白粉為原料，經液態培養，再通過離子交換層析、凝膠層析、反相色譜和電泳法對發酵液進行分離製備而成；該產品的分子量在20,100-31,000之間，N端5個胺基酸序列為K-V-T-Y-H，抗氧化活力為236.68U/mL；本發明產品具有較高的抗氧化活力，純品可滿足對抗氧化活性肽結構、物性測定，活性、毒理實驗，乃至於治療、培育等大規模應用的要求；由於抗氧化活性物質對超氧陰離子自由基和羥基自由基有強烈的清除作用，並能顯著抑制紅細胞和肝臟、心臟、腦組織脂質過氧化反應的發生，具有防治疾病、抗衰老等功能，可進一步開發成醫藥、化妝品等產品添加劑使用。
文檔編號C12R1/07GK101284872SQ20081006429
公開日2008年10月15日 申請日期2008年4月9日 優先權日2008年4月9日
發明者劉曉蘭, 傑 林, 王曉傑, 鄭喜群 申請人:齊齊哈爾大學