用病毒清除細胞的製作方法
2023-09-21 18:37:50 2
專利名稱：用病毒清除細胞的製作方法
技術領域：
本發明涉及病毒，這些病毒能清除(減少或去除)細胞混合體中的不良細胞。不良細胞包括瘤細胞、介導移植物抗宿主疾病的細胞和自身免疫細胞。本發明還涉及在對哺乳動物治療中清除離體的骨髓或外周血細胞中的不良細胞，所述哺乳動物包括癌症患者、移植物接受者和自身免疫性疾病患者。
除瘤細胞外，離體的骨髓或外周血祖細胞會含有其他不良細胞，如患有關節炎或硬化症的患者體內的自身免疫細胞。其他不良細胞包括在同種異體移植中介導移植物抗宿主疾病的細胞(例如，某種T-淋巴細胞)。在癌症和自身免疫性疾病的治療中，減少或去除這些不良細胞將是重要的。
Roberts等的PCT申請(WO/9918799和PCTUS98/21230)涉及用病毒治療腫瘤。
本發明進一步的目的是提供病毒，用以減少或去除正常細胞和瘤細胞的混合體中的瘤細胞。
本發明進一步的目的是提供病毒，用於從正常造血細胞如骨髓或外周血祖細胞中體外清除瘤細胞。
本發明進一步的目的是提供病毒，用於從正常造血細胞如骨髓或外周血祖細胞中體外清除自身免疫細胞。
本發明的進一步的目的是提供病毒，用於從正常造血細胞如骨髓或外周血祖細胞中體外清除介導移植物抗宿主疾病的細胞。
本發明進一步的目的是提供治療哺乳動物疾病的方法，該方法通過使良性細胞和不良細胞的混合體與病毒接觸，從而將這些細胞移植到哺乳動物體內。
本發明進一步的目的是提供治療哺乳動物癌症的方法，該方法通過使離體細胞與病毒接觸，將這些被淨化的造血細胞移植到經過成髓細胞治療的哺乳動物體內。
本發明進一步的目的是提供防止哺乳動物發生移植物抗宿主疾病的方法，該方法通過使離體細胞與病毒接觸，將這些被淨化的造血細胞移植到經過成髓細胞治療的哺乳動物體內。
本發明進一步的目的是提供治療哺乳動物自身免疫疾病的方法，該方法通過使離體細胞與病毒接觸，將這些被淨化的造血細胞移植到經過成髓細胞治療的哺乳動物體內。
本發明進一步的目的是提供為接受骨髓或外周血幹細胞移植的哺乳動物治療癌症的方法，該方法包括病毒的移植療法。
因此，本發明涉及一種方法，該方法通過使良性細胞和不良細胞的混合體與病毒接觸，從而減少或去除其中的不良細胞。
本發明還涉及一種方法，該方法通過使良性細胞和不良細胞的混合體與RNA病毒接觸，從而減少或去除其中的不良細胞。
本發明還涉及一種方法，該方法通過使離體的正常造血細胞和瘤細胞混合體與病毒如RNA病毒接觸，從而減少或去除其中的瘤細胞。
本發明還涉及一種方法，該方法通過使離體的骨髓或外周血幹細胞與病毒如RNA病毒接觸，從而體外清除其中的瘤細胞。
本發明還涉及一種方法，該方法通過使離體的骨髓或外周血幹細胞與病毒如RNA病毒接觸，從而體外清除其中的自身免疫細胞。
本發明還涉及一種方法，該方法通過使骨髓或外周血幹細胞的細胞群與病毒如RNA病毒接觸，從而體外清除其中的介導移植物抗宿主疾病的細胞。
本發明還涉及治療或預防哺乳動物疾病如癌症的方法，該方法包括
a)取出所述哺乳動物的骨髓或外周血細胞，b)在體外將所述骨髓或外周血細胞與病毒如RNA病毒接觸，c)對所述哺乳動物進行成髓細胞治療，和d)將步驟b中淨化的造血細胞移植到所述哺乳動物體內。
本發明還涉及為接受了骨髓或外周血祖細胞移植的哺乳動物治療癌症的方法，該方法包括將移植物的離體細胞與病毒如RNA病毒接觸，然後給所述哺乳動物施用經過淨化的細胞。
本發明還涉及為接受了骨髓或外周血祖細胞移植的哺乳動物治療自身免疫疾病的方法，該方法包括將移植物的離體細胞與病毒如RNA病毒接觸，然後給所述哺乳動物施用經過淨化的細胞。
本發明還涉及為接受了骨髓或外周血祖細胞移植的哺乳動物預防移植物抗宿主疾病的方法，該方法包括將移植物的離體細胞與病毒如RNA病毒接觸，然後給所述哺乳動物施用經過淨化的細胞。
本發明的方法瘤細胞的清除正常細胞和瘤細胞的混合體與病毒一起孵育，結果選擇性地殺死了瘤細胞而不殺死正常細胞。從造血細胞中清除瘤細胞的有效方法可用於接受了同種異體骨髓或外周血幹細胞移植的哺乳動物的癌症治療。例如，在移植前將取自患腫瘤的哺乳動物的骨髓或外周血幹細胞與病毒接觸，以防止該腫瘤的復發。能用本發明的方法清除的腫瘤細胞包括但不局限於(1)白血病，(2)淋巴瘤，(3)癌症如乳腺癌、肺癌、腸癌、前列腺癌和胰腺癌，(4)惡性毒瘤，和(5)神經上皮來源的癌例如黑色素瘤和神經母細胞瘤。
各種病毒如RNA病毒[例如但不限於，小囊狀的口腔炎病毒(VSV)、新城疫病毒(NDV)和呼腸孤病毒]可用於從正常造血細胞中清除瘤細胞。正常造血細胞對很多病毒包括RNA病毒的感染具有抵抗力。例如，正常人骨髓細胞對彈狀病毒屬的VSV的感染具有抵抗力，這種抵抗力取決於感染性病毒的增殖力和存活力。來自兩個捐獻者的正常骨髓細胞即使被高度多重感染(例如10個噬菌斑形成單位(pfu)/細胞；見實施例1)也不產生感染的病毒。被感染的骨髓細胞用甲基纖維素體外培養後，被感染的骨髓細胞培養物與假性感染的培養物在形成正常的造血細胞類型譜方面的能力沒有差別。又例如，富含CD34+的正常人骨髓對來自另一種屬(副粘病毒屬)的病毒NDV的感染具有抵抗力，見Robbert等的WO/9918799。
很多類型的瘤細胞對很多病毒包括RNA病毒的細胞殺傷作用有高度的敏感性。使用VSV的一個例子是，急性骨髓性白血病細胞系OCI/AML3、OCI/AML4H和OCI/AML5對VSV的感染高度敏感，0.05pfu/細胞在24小時內可殺死50％的細胞，少至0.0003pfu/細胞在48小時內也可殺死50％的細胞(實施例1)。本實驗中所用的印第安納血清型的VSV是從鼠L929細胞增殖並獲得的。在另一實施例中，不同類型的腫瘤細胞對VSV表現出敏感性，這些腫瘤細胞包括卵巢癌細胞、纖維肉瘤細胞、肺癌細胞、黑色素瘤細胞、前列腺癌細胞和白血病細胞(見實施例3)。NDV還可殺死大多數的人腫瘤細胞(見Robbert等的WO/9918799)。3型呼腸孤病毒可殺死人的纖維肉瘤細胞，而不殺死正常的纖維母細胞(見實施例4)。
多種病毒可用於選擇性地去除正常造血細胞和瘤細胞的聯合培養物中的瘤細胞。例如，在含白血病OCI/AML3型細胞和正常骨髓細胞的聯合培養物中(比例為1∶9和1∶3)，VSV殺死了所有的白血病細胞，而對正常的造血細胞如果說有影響的話，其影響也是很小的(實施例2)。本實驗中所用的印第安納血清型的VSV是從鼠L929細胞增殖並獲得的。這些數據顯示了在骨髓淨化中，採用病毒如VSV選擇性地破壞了正常骨髓和白血病細胞的混合體中的白血病細胞。在另一個實施例中，採用NDV選擇性地去除了正常造血細胞和瘤細胞的聯合培養物中的瘤細胞。NDV的PPMK107毒株是中等NDV毒株的MK107毒株經淨化的具有三個菌斑的純品種，該NDV的PPMK107毒株可選擇性地殺死人的口腔癌細胞與纖維母細胞的混合培養物中的人的口腔癌細胞(見Robbert等的WO/9918799)。
介導移植物抗宿主疾病的細胞的清除不良細胞例如能引起移植物抗宿主疾病T淋巴細胞和良性細胞的混合體與病毒一起孵育，結果選擇性地殺死了不良細胞。這種淨化骨髓或外周血細胞的有效方法可用於預防哺乳動物的移植物抗宿主疾病。
介導自身免疫疾病的細胞的清除能引起自身免疫疾病的自身免疫細胞和良性細胞的混合體與病毒一起孵育，結果選擇性地殺死了自身免疫細胞。這種淨化不良細胞的有效方法可用於治療自身免疫疾病，如類風溼性關節炎或多發性硬化症。
不良細胞的篩選本發明中的不良細胞包括瘤細胞，所述瘤細胞發生了染色體缺失或基因重組，或含有編碼蛋白質或細胞幹擾素反應的調製物，或具有其他有缺陷的幹擾素反應(Colamonici OR等，1992，《血液》(Blood)，80744-749；Heyman M等，1994，《白血病》(Leukemia)，8425-434；Billard C等，1986，《血液》(Blood)，67821-826)。骨髓或PBPC細胞群體具有暫時中止的性質，這使得其便於用螢光激活細胞分類術(FACS)進行分析，以確定細胞的幹擾素反應狀態。幹擾素反應性探針包括用於基因消除或重組的染色體雜交探針，或用於細胞受體分析以及在細胞對幹擾素的反應中的信號轉導途徑的成分分析的探針，如抗體。
本發明的組合物本發明的病毒能區分不良細胞如瘤細胞與良性細胞如正常的造血細胞。本發明的RNA病毒包括但不局限於(1)單鏈病毒，包括反義RNA病毒和正義RNA病毒，和(2)雙鏈RNA病毒。本發明的單鏈反義RNA病毒包括但不局限於不分段的病毒屬，如彈狀病毒屬[例如，小囊狀的口腔炎病毒(VSV)]和副粘病毒屬[例如，新城疫病毒(NDV)和人的3型副流感病毒]。本發明的單鏈正義RNA病毒包括但不局限於微小核糖核酸病毒[例如，鼻病毒]和披膜病毒類[例如，新培斯病毒]。本發明的雙鏈RNA病毒類包括呼腸孤病毒。本發明包括能複製的RNA病毒和不能複製的RNA病毒。
本發明包括Robbert等在WO/9918799中描述的「幹擾素敏感性病毒」，本文對其作了完整引用供參考。由於瘤細胞缺乏對幹擾素介導抗病毒反應的選擇性，所以幹擾素敏感病毒經過選擇性複製並殺死瘤細胞。除RNA病毒外，「幹擾素敏感病毒」還包括腺病毒的VAI突變異種，這是一種DNA病毒。
彈狀病毒屬由具有緊密相關的被膜的、不分段的反義RNA病毒組成，該類病毒包括以下能感染動物的種類(1)水泡性病毒屬(例如，小囊狀的口腔炎病毒，VSV)；(2)狂犬病病毒屬(例如，狂犬病病毒)；(3)短生病毒屬(ephemervirus)[Dietzschold B et al.，1996.彈狀病毒(Rhabdoviruses).In《病毒學領域》(Fields Virology)第3版，(編輯Fields B.N.等)，pp1137-1159]。
在本發明的一個特別有益的實施方式中，所用的彈狀病毒是小囊狀的口腔炎病毒(VSV)。人們已經識別出了幾種血清學性質顯著的VSV毒株和很多被表徵的突變異種。VSV的自然宿主包括昆蟲、齧齒動物和家養動物。一般來講，北美人幾乎沒有與這類病毒接觸過，人的感染大多發生在實驗室人員和農民身上。人類感染或者無症狀或表現為流感樣症狀。VSV毒株包括但不局限於印地安那(Indiana)、新澤西(New Jersy)、Priy、球菌的(Coccal)和Chandipura。而本文所公開的實施例涉及印地安那VSV毒株。應當理解，採用本文所述的方法，本領域的技術人員可以容易地篩選出其他的VSV毒株及其衍生物，所述衍生物包括可選擇性地殺死瘤細胞的VSV的突變異種。
不分段的反義RNA病毒類的副粘病毒屬包括三種(1)副粘病毒，包括新城疫病毒(NDV)；(2)麻疹樣病毒(麻疹病毒)；和(3)呼吸道多核體病毒(肺炎病毒)。本發明的NDV是一種有利的病毒。按照對小雞和雞胚的影響，可將NDV分為3個明顯不同的類別。「低毒株」被稱為輕型毒株，它在最小致死量(MLD)下用90-150個小時殺死雞胚；「中毒株」被稱為中等毒株，它在最小致死量下用60-90個小時殺死雞胚；「高毒株」被稱為強毒株，在最小致死量下用40-60個小時殺死雞胚。參見例如，Hanson和Bradley，1955(Science，122156-157)和Diardiri等，1961(Am J Vet Res 9918-920)。所有這三類都有用，包括有益的NDV的中等毒株如MK107。
在本發明的一個特別有益的實施方式中，雙鏈RNA病毒是呼腸孤病毒。在本發明的另一個有益的實施方式中，呼腸孤病毒是3型呼腸孤病毒。
在本發明另一個有益的實施方式中，採用了能在與枯草桿菌蛋白酶相關的蛋白酶表達有缺陷的腫瘤中複製的RNA病毒。人類3型副流感病毒就是這種類型的病毒。
為了特定的目的，期望獲得無性系病毒以確保或增加特種毒株的遺傳同質性，並能去除有缺陷的幹擾性病毒顆粒。有缺陷的幹擾性病毒顆粒的去除可增加成品的純度，因為純度是用每個感染顆粒中病毒顆粒的總數來估計的。可採用噬斑純化或採用Robbert等在WO/9918799中所描述的其他方法增殖無性系病毒。
在本發明的另一個的實施方式中對病毒進行了遺傳修飾，例如為增加病毒對瘤細胞的選擇性。彈狀病毒如VSV的遺傳控制技術(Robberts A.和J.K.Rose，《病毒學》(Virology)，1998，2471-6)已經成熟，這使得改變病毒的遺傳特性成為可能。此外，可以採用本領域技術人員所熟知的標準技術來對VSV進行遺傳修飾，並給VSV的基因組中導入良性基因以產生VSV的重組體(例如，Sambrook等，1989，《實驗手冊》(ALaboratory Manual)，New York，Cold Spring Harboor Press)。在本發明的一個的實施方式中，VSV的G蛋白可經修飾產生融合物，該融合物以腫瘤細胞的特定位點為靶點。在本發明的另一個的實施方式中，VSV被遺傳性改變來表達一種或多種自殺基因，所述自殺基因能使前體藥物代謝生成有毒的代謝物，這樣通過施用前體藥物即可將被VSV感染的腫瘤細胞殺死。經修飾可表達皰疹病毒胸苷激酶基因或胞嘧啶脫氨酶基因的VSV，可被用來分別將9-1，3-二羥-2-丙氧甲基鳥嘌呤或5-氟胞嘧啶轉變為有毒的化合物。然而，應當理解也可採用其他的自殺基因。
配方與施藥本發明的一個有益的實施方式涉及試劑盒，該試劑盒用於良性細胞和不良細胞的混合體中不良細胞的體外清除。所述試劑盒包括預先測定數量的配製的病毒，該試劑盒適用於處理含一定數量的良性細胞和不良細胞的混合體。有益的配方包括賦形劑，該賦形劑用以穩定病毒以免失去感染性，或用以提高良性細胞的生存力或存活性。一個更有益的試劑盒不需生物密封裝置即可在無菌步驟中將病毒配方和靶細胞混合體相接觸。這種裝置的一個例子是一個隔離成多個空間的靶細胞混合體的收集容器，在其中一個獨立的隔間中裝有預先測定的病毒。在隔間之間設有開放的通道，使得病毒、靶細胞群以及一種或多種賦形劑可以相互接觸。如果病毒和賦形劑是分開的，則病毒和賦形劑可同時或先後接觸。在本發明另一個有益的實施方式中，提供了一種隔離成多個空間的容器，在病毒與良性和不良的靶細胞的混合體接觸期間，該容器的溫度保持在病毒細胞反應最適宜的溫度。本發明另一個有益的實施方式涉及一種試劑盒，該試劑盒可使結合在一起的細胞混合體與病毒、賦形劑或前述二者經過適當的時間分離開來。本領域的技術人員可以知道或確定這一適當的接觸時間。
本發明中病毒的適當配方包括為那些用於治療腫瘤的病毒所列出的配方(Robbert等，1999，PCT WO9918799)。此外，有益的配方包括化合物或生物製品，所述化合物或生物製品對良性細胞和不良細胞的混合體中的良性細胞有以下一種或多種活性區分、增殖、不幹擾、刺激、保護包括休眠。例如，這些化合物或生物製品包括細胞因子、細胞周期中的肽類調製物、白細胞介素、生長因子、能量源、維生素和電解質。附加的適當賦形劑包括冷凍保護組合物。
發明將相當數量的病毒用於減少或去除不良細胞，而保留了良性細胞。本領域的技術人員應當理解，根據所選病毒、不良細胞的種類和數量以及需保留的良性細胞的種類和數量的不同，用來減少或去除不良細胞所需病毒的數量也不同。例如，可採用0.00001到10pfu/細胞的VSV，更優選0.0003到10pfu/細胞。
在本發明的另一個有益的實施方式中，採用病毒與瘤細胞和正常細胞的混合體相接觸，這些細胞在與病毒接觸之前、之中或之後用幹擾素處理。幹擾素能增強對正常細胞的保護(參見實施例3，和Robbert等的WO/9918799)。幹擾素(INF)選自I級(α、β、ω)組和II級(γ)組、重組體變體及其類似物，如Sreevalsoun T所描述的(《癌症的生物療法》(Biologic Therapy of cancer)第二版，1995，V.T.Devita.Jr等編，J.B.Lippincott Company，Philadephia.pp347-364)。
在本發明的另一個有益的實施方式中，病毒與瘤細胞和正常細胞的混合體相接觸，這些細胞在與病毒接觸之前、之中或之後用化療製劑處理。該化療製劑用以進一步降低瘤細胞的存活力。
以下實施例的目的在於說明，而非限制本發明的方法和組合物。對於在臨床治療經常遇到的各種條件和參數所做的適當的修改和調整，只要這種修改和調整對於本領域的技術人員來說是顯而易見的，均在本發明的精神和範圍之內。
實施例1由獨立的細胞培養所確定的小囊狀的口腔炎病毒(VSV)選擇性地殺死白血病細胞而不殺死正常的骨髓細胞將印第安納血清型VSV在鼠L929的細胞對噬斑進行純化。用單個噬斑感染L929細胞的單層，18小時後獲取上清液並以6,000×g離心10分鐘。澄清的上清液經0.2的微孔過濾器(Millipore)過濾，然後滴定L細胞，等分後在-80℃下保存。每一等分的病毒只用一次。
取自兩個不同的健康的捐贈者的正常骨髓培養物對印第安納血清型的小囊狀的口腔炎病毒(VSV)的感染具有抵抗力。即使在10pfu/細胞的高濃度感染下，正常骨髓細胞也不產生感染性的VSV顆粒。其次，被感染的骨髓細胞用甲基纖維素體外培養後，被感染的骨髓細胞培養物與假性感染的培養物在形成正常的造血細胞類型譜方面的能力沒有差別。相反，AML細胞系OCI/AML3、OCI/AML4和OCI/AML5對VSV感染有高度的敏感性，0.05pfu/細胞的VSV 24小時殺死50％的細胞，少至0.0003pfu/細胞的VSV 48小時也殺死50％的細胞。
實施例2用小囊狀的口腔炎病毒(VSV)選擇性地殺死白血病細胞和正常骨髓細胞的混合培養物中的白血病細胞按實施例1中所述的方法製備印第安納血清型的VSV。在白血病OCI/AML3細胞和正常骨髓細胞相混合(比例為1∶9)的聯合培養物中，VSV有選擇性的腫瘤消解特性。在這個試驗中(表1)，用1pfu/細胞或5pfu/細胞的VSV大量地感染聯合培養物達24小時，然後將該培養物種植在含有或不含生長因子的甲基纖維素中。存在生長因子時，正常骨髓細胞和腫瘤細胞都生長，而沒有生長因子存在時，只有OCI/AML3形成菌落。14天後進行菌落計數(表1)，結果顯示，不依賴生長因子的白血病細胞全部被清除，且不幹擾正常骨髓祖細胞。採用白血病OCI/AML3細胞和正常骨髓細胞的1∶3的混合物時，觀察到了相同的結果。這些數據顯示，正常骨髓的混合群體中白血病細胞被選擇性地破壞了，VSV在骨髓體外淨化中具有實用性。
表1.選擇性地殺死正常骨髓和急性骨髓性白血病細胞(AML)的聯合培養物中的急性骨髓性白血病細胞被VSV感染兩周後觀察到的每皿(裝有104個細胞)中的菌落列於下表，這些菌落有瘤細胞(白血病)和正常造血細胞(中性粒細胞、細胞混合體和單核細胞)。
*-沒有生長因子的皿中，即使每皿裝有105個細胞，也未觀察到白血病細胞菌落。
實施例3.與單獨的細胞培養物中的正常細胞相比，VSV選擇性地在瘤細胞中生長並殺死瘤細胞。
將多種正常細胞系和轉化細胞系不做處理或用100單位IFN-α預處理，用MOI為0.1pfu/ml的印第安那型VSV感染，然後在37℃下孵育18小時(表2)。滴定每個樣本的培養基以確定VSV的繁殖數。用幹擾素預處理的正常細胞培養物使感染性病毒顆粒的繁殖數減少到＜1000/ml，而腫瘤細胞系能繼續產生大量的病毒顆粒(105-108pfu/ml)。發現VSV在腫瘤細胞中的生長比在來自纖維母細胞或上皮的正常細胞的培養物中的生長更為迅猛。各種細胞類型的差異不僅表現在病毒顆粒的增殖上，還表現在顯微水平觀察到細胞病變的作用(cpe)。
表2，或未經處理或用IFN處理的各種細胞系過夜感染後，VSV的病毒產量
實施例4.3型呼腸孤病毒在各個細胞培養物中選擇性地殺死瘤細胞而不殺死正常纖維母細胞在24孔的組織培養皿中，使人的腫瘤細胞(HT1080纖維肉瘤)和正常細胞(CCD922sk，正常的人的皮膚纖維母細胞)生長達到約80％融合。除去生長介質，並以從1E+6pfu/孔到10倍的稀釋液10pfu/孔加入PPVR-824(實驗組I)或以7.2E+7pfu/孔10倍的稀釋液從107稀釋到100pfu/孔加入PPVR-824(實驗組II)，所述PPVR-824為人的3型呼腸孤病毒的純化噬斑菌落，即Dearing毒株。每個孔板上都有未加病毒的對照孔。37℃下在搖床上將病毒吸收90分鐘。孵育周期結束後，棄去病毒稀釋液，用1ml生長介質置換。然後將孔板在37℃、5％CO2中孵育5天。採用比色計MTT(2-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑溴)測定儀(細胞滴定量96，#G4000類，Promega Corporation，Madison WI 53711)在570nm下監測，定量測定細胞毒性，該法測定了線粒體的酶活性(Mosman，T.，1983，《免疫方法雜誌》(J.Immunol.Methods)65∶55)。用對照孔中未處理的細胞活性的百分數來表示經過病毒處理的細胞的生存能力。用該數據作pfu/孔隨對照細胞活性變化的曲線圖。計算IC50，這就是細胞存活量減少50％的病毒的數量，單位為pfu/孔。瘤細胞對PPVR-824的殺死作用具有數個數量級的敏感度(表3)。
表3在單獨的細胞培養物中3型呼腸孤病毒選擇性地殺死瘤細胞而不殺死正常的纖維母細胞
上述實施例意在說明而非限制本發明。在本發明的精神和範圍之內可做很多變化和修改。
權利要求
1.體外減少或去除正常造血細胞和瘤細胞的混合體中的瘤細胞的方法，所述方法包括使所述混合體與病毒接觸。
2.如權利要求1的方法，其中所述病毒是RNA病毒。
3.如權利要求1的方法，其中所述的瘤細胞是白血病細胞。
4.如權利要求1的方法，其中所述造血細胞是骨髓細胞。
5.如權利要求1的方法，其中所述的造血細胞是外周血細胞。
6.如權利要求2的方法，其中所述的RNA病毒是單鏈RNA病毒。
7.如權利要求6的方法，其中所述的單鏈RNA病毒是不分段的反義RNA病毒。
8.如權利要求7的方法，其中所述的不分段的反義RNA病毒是彈狀病毒。
9.如權利要求8的方法，其中所述的彈狀病毒是小囊狀的口腔炎病毒。
10.如權利要求7的方法，其中所述的不分段的反義RNA病毒是副粘病毒。
11.如權利要求10的方法，其中所述副粘病毒是新城疫病毒。
12.如權利要求6的方法，其中所述單鏈RNA病毒是辛德畢斯病毒。
13.如權利要求2的方法，其中所述RNA病毒是雙鏈RNA病毒。
14.如權利要求13的方法，其中所述雙鏈RNA病毒是呼腸孤病毒。
15.如權利要求14的方法，其中所述呼腸孤病毒是3型呼腸孤病毒。
16.如權利要求13的方法，其中所述呼腸孤病毒是無性的。
17.如權利要求2的方法，其中所述RNA病毒是有複製能力的RNA病毒。
18.如權利要求2的方法，其中所述RNA病毒是無複製能力的RNA病毒。
19.如權利要求1的方法，其中所述瘤細胞是淋巴瘤病毒。
20.如權利要求1的方法，所述方法進一步包括在與所述病毒接觸之前、之中或之後施用化療劑。
21.如權利要求1的方法，所述方法進一步包括在與所述病毒接觸之前、之中或之後施用幹擾素。
22.治療哺乳動物癌症的方法，所述方法包括a)取出所述哺乳動物的骨髓或外周血細胞，b)在體外將所述骨髓或外周血細胞與病毒如RNA病毒接觸，c)對所述哺乳動物進行成髓細胞治療，和d)將步驟b中淨化的造血細胞移植到所述哺乳動物體內。
23.如權利要求22的方法，其中所述成髓細胞療法是大劑量的化療法。
24.為接受骨髓或外周血幹細胞移植的哺乳動物治療癌症的方法，所述方法包括使離體的移植細胞在體外與病毒接觸，並給所述哺乳動物施用該經過淨化的細胞。
全文摘要
本發明涉及病毒，這些病毒能清除(減少或去除)細胞混合體中的不良細胞。不良細胞包括瘤細胞、介導移植物抗宿主疾病的細胞和自身免疫細胞。本發明還涉及在對哺乳動物治療中清除離體的骨髓或外周血細胞中的不良細胞，所述哺乳動物包括癌症患者、移植物接受者和自身免疫性疾病患者。
文檔編號A61K35/76GK1454254SQ01811802
公開日2003年11月5日 申請日期2001年6月26日 優先權日2000年6月26日
發明者哈羅德·L·阿特金斯, 約翰·C·貝爾, 小康拉德·J·海爾曼, 布賴恩·D·利克蒂, 羅伯特·M·洛朗斯, 麥可·S·羅伯茨, 大衛·F·什託伊德爾 申請人:威爾斯達特生物製劑公司, 渥太華大學