用微細胞團塊再生法脫除丹參病毒的方法

2023-09-21 18:39:05 3

專利名稱：用微細胞團塊再生法脫除丹參病毒的方法
技術領域：
本發明屬於植物的提純復壯和繁育，特別是指一種用微細胞團塊再生法脫除丹參病毒的方法。
背景技術：
常規的「熱處理+莖尖培養」脫除植物病毒方法存在著熱處理雖鈍化病毒，但持續高溫處理也對植株造成傷害，甚至死亡，易造成植株乾枯、死亡。脫毒處理過程時間長、效果差的問題。

發明內容
本發明的目的在於是根據植物分裂的細胞中基本未受病毒侵染，分生頂點(莖尖)或分裂細胞中不含病毒，由頂點(莖尖)或分化細胞得到的植株不含病毒或含病毒率很低這樣一個基本原理。避開常規方法脫病毒的熱處理過程，提供一種用微細胞團塊再生法脫除丹參病毒的方法以脫除丹參中的黃瓜花葉病毒(CMV)。
本發明的整體技術構思是用微細胞團塊再生法脫除丹參病毒的方法，包括如下工藝步驟(1)愈傷組織誘導將丹參外植體洗淨消毒後，接種在愈傷誘導培養基上在黑暗條件下進行誘導愈傷得到誘導後的愈傷組織；(2)愈傷組織調控將誘導出的愈傷組織從母體上分離出來後，進行繼代培養，使愈傷組織呈鬆散、顆粒狀；(3)細胞懸浮培養將步驟(2)中獲得的鬆散、顆粒狀愈傷組織1～2克，壓碎後接種於培養基上培養，過濾獲得微小細胞團塊；(4)愈傷誘導再生植株將步驟(3)中獲得的微小細胞團塊，轉移到培養基上培養，誘導再生植株；(5)再生植株的病毒檢測用酶鏈免疫吸附法檢測，獲得脫除了病毒的丹參植株並進行組培擴繁。
本發明的具體工藝步驟和工藝參數是步驟(1)中的丹參外植體包括其根莖、葉片、幼莖。
步驟(1)是將丹參外植體消毒，用水洗淨，再用肥皂水刷洗，在超淨工作檯上採用70％酒精表面滅菌10-20秒，然後用0.1％升汞溶液滅菌1～3分鐘，然後接種在愈傷誘導培養基上誘導愈傷得到誘導後的愈傷組織；其中愈傷誘導培養基配比為MS+6-BA1.0mg/L+NAA1.0mg/L+2，4-D1.0mg/L，蔗糖20～30g/L，瓊脂5g/L，pH5.6-5.8；培養條件為溫度為25±2℃，在黑暗條件下培養。
步驟(2)是將步驟(1)中得到的誘導出的愈傷組織從母體上分離出來後，接種到培養基上繼代培養，培養基配比為N6+BA1.0mg/L+NAA1.0mg/L+2，4-D1.0mg/L+蔗糖3％+瓊脂5g/L，pH5.6-5.8，並在培養基中添加氯化鉀100-500mg/L使愈傷組織呈鬆散、顆粒狀。
步驟(3)是將步驟(2)中獲得的鬆散、顆粒狀愈傷組織1～2克，壓碎後接種於裝有50ml液體培養基的250ml三角瓶中，於轉速為110rpm的恆溫旋轉搖床上振蕩培養，溫度為27～28℃；培養基配比為N6+BA1.0mg/L+NAA1.0mg/L+2，4-D1.0mg/L+蔗糖3％，pH5.6-5.8；一周後用新鮮的液體培養基，更換三角瓶中1/3體積的培養液，以後每周更換一次培養液，培養1個月後，過濾獲得微小細胞團塊。
步驟(4)是將步驟(3)獲得的將微小細胞團塊，轉移到培養基上培養20-40天，誘導愈傷植株的再生，愈傷誘導植株再生培養基為MS+BA1-4mg/L+NAA0.1mg/L+糖30g/l+瓊脂5g/l；經30天，微細胞團塊出現再生芽點，再生芽經分化培養長到2-4cm後，進行生根培養，獲得待檢植株；分化培養基為MS+BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+糖30g/l+瓊脂5g/l，生根培養基為1/2MS+NAA0.2mg/L+蔗糖2％，pH5.6-5.8。
以上描述中BA6-苄基氨基嘌呤，NAA萘乙酸，2，4-D2，4-二氯苯氧乙酸(下同)。
本發明所取得的技術進步在於本發明避開了熱處理的過程，直接採用體細胞誘導脫分化成為分裂細胞(愈傷)，分生細胞經狀態調控直接誘導再生，形成植株，脫除病毒。因此，這種方法克服了因常規「熱處理+莖尖培養」脫毒方法造成的熱處理使植株乾枯、死亡的問題。特別適用於丹參脫病毒，也適用於多數植物脫病毒。
具體實施例方式
以下結合實施例對本發明作進一步描述，但不作為對本發明的限定。
用微細胞團塊再生法脫除丹參病毒的方法，包括如下工藝步驟(1)愈傷組織誘導將丹參外植體(根莖、葉片、幼莖等)消毒，用水洗淨，再用肥皂水刷洗，在超淨工作檯上採用70％酒精表面滅菌10-20秒，然後用0.1％升汞溶液滅菌1～3分鐘；然後接種在愈傷誘導培養基上誘導愈傷得到誘導後的愈傷組織。其中愈傷誘導培養基配比為MS+6-BA1.0mg/L+NAA1.0mg/L+2，4-D1.0mg/L，蔗糖20～30g/L，瓊脂5g/L，pH5.6-5.8；培養條件為溫度為25±1℃，在黑暗條件下進行。
(2)愈傷組織調控是將步驟(1)中得到的誘導出的愈傷組織從母體上分離出來後，接種到培養基上繼代培養，培養基配比為N6+BA1.0mg/L+NAA1.0mg/L+2，4-D1.0mg/L+蔗糖3％+瓊脂5g/L，pH5.6-5.8，並在培養基中添加氯化鉀100-500mg/L使愈傷組織呈鬆散、顆粒狀；(3)細胞懸浮培養將步驟(2)將步驟(2)中獲得的鬆散、顆粒狀愈傷組織1～2克，壓碎後接種於裝有50ml液體培養基的250ml三角瓶中，於轉速為110rpm的恆溫旋轉搖床上振蕩培養，溫度為27～28℃；培養基配比為N6+BA1.0mg/L+NAA1.0mg/L+2，4-D1.0mg/L+蔗糖3％，pH5.6-5.8；一周後用新鮮的液體培養基，更換三角瓶中1/3體積的培養液，以後每周更換一次培養液，培養1月後，過濾獲得微小細胞團塊；(4)愈傷誘導再生植株將步驟(3)獲得的將微小細胞團塊，轉移到培養基上培養20-40天，誘導愈傷植株的再生，愈傷誘導植株再生培養基為MS+BA1-4mg/L+NAA0.1mg/L+糖30g/l+瓊脂5g/l。經30天，微細胞團塊出現再生芽點，再生芽經分化培養長到2-4cm後，進行生根培養，獲得待檢植株；分化培養基為MS+BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+糖30g/l+瓊脂5g/l，生根培養基為1/2MS+NAA0.2mg/L+蔗糖2％，pH5.6-5.8。
(5)再生植株的病毒檢測用酶鏈免疫吸附法檢測，獲得脫除了病毒的丹參植株並進行組培擴繁。
權利要求
1.用微細胞團塊再生法脫除丹參病毒的方法，其特徵在於包括如下工藝步驟(1)愈傷組織誘導將丹參外植體洗淨消毒後，接種在愈傷誘導培養基上在黑暗條件下進行誘導愈傷，得到誘導後的愈傷組織；(2)愈傷組織調控將誘導出的愈傷組織從母體上分離出來後，進行繼代培養，使愈傷組織呈鬆散、顆粒狀；(3)細胞懸浮培養將步驟(2)中獲得的鬆散、顆粒狀愈傷組織1～2克，壓碎後接種於培養基上培養，過濾獲得微小細胞團塊；(4)愈傷誘導再生植株將步驟(3)中獲得的微小細胞團塊，轉移到培養基上培養，誘導再生植株；(5)再生植株的病毒檢測用酶鏈免疫吸附法檢測，獲得脫除了病毒的丹參植株。
2.根據權利要求1所述的用微細胞團塊再生法脫除丹參病毒的方法，其特徵在於所述的步驟(1)中的丹參外植體包括其根莖、葉片、幼莖。
3.根據權利要求1所述的用微細胞團塊再生法脫除丹參病毒的方法，其特徵在於所述的步驟(1)是將丹參外植體消毒，用水洗淨，再用肥皂水刷洗，在超淨工作檯上採用70％酒精表面滅菌10-20秒，然後用0.1％升汞溶液滅菌1～3分鐘；然後接種在愈傷誘導培養基上誘導愈傷，得到誘導後的愈傷組織；其中愈傷誘導培養基配比為MS+6-BA1.0mg/L+NAA1.0mg/L+2，4-D1.0mg/L，蔗糖20～30g/L，瓊脂5g/L，PH5.6-5.8；培養條件為溫度為25±2℃，在黑暗條件下培養。
4.根據權利要求1所述的用微細胞團塊再生法脫除丹參病毒的方法，其特徵在於所述的步驟(2)是將步驟(1)中得到的誘導出的愈傷組織從母體上分離出來後，接種到培養基上繼代培養，培養基配比為N6+BA1.0mg/L+NAA1.0mg/L+2，4-D1.0mg/L+蔗糖3％+瓊脂5g/L，PH5.6-5.8，並在培養基中添加氯化鉀100-500mg/L使愈傷組織呈鬆散、顆粒狀。
5.根據權利要求1所述的用微細胞團塊再生法脫除丹參病毒的方法，其特徵在於所述的步驟(3)是將步驟(2)中獲得的鬆散、顆粒狀愈傷組織1～2克，壓碎後接種於裝有50ml液體培養基的250ml三角瓶中，於轉速為110rpm的恆溫旋轉搖床上振蕩培養，溫度為27～28℃；培養基配比為N6+BA1.0mg/L+NAA1.0mg/L+2，4-D1.0mg/L+蔗糖3％，pH5.6-5.8；一周後用新鮮的液體培養基，更換三角瓶中1/3體積的培養液，以後每周更換一次培養液，培養1月後，過濾獲得微小細胞團塊。
6.根據權利要求1所述的用微細胞團塊再生法脫除丹參病毒的方法，其特徵在於所述的步驟(4)是將步驟(3)獲得的將微小細胞團塊，轉移到培養基上培養20-40天，誘導愈傷植株的再生，愈傷誘導植株再生培養基為MS+BA1-4mg/L+NAA0.1mg/L+糖30g/l+瓊脂5g/l；經30天左右，微細胞團塊出現再生芽點，再生芽經分化培養長到2-4cm後，進行生根培養，獲得待檢植株；分化培養基為MS+BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+糖30g/l+瓊脂5g/l，生根培養基為1/2MS+NAA0.2mg/L+蔗糖2％，pH5.6-5.8。
全文摘要
本發明屬於植物的提純復壯和繁育，特別是指一種用微細胞團塊再生法脫除丹參病毒的方法。包括愈傷組織誘導、愈傷組織調控、細胞懸浮培養、愈傷誘導再生植株、再生植株的病毒檢測(酶鏈免疫吸附法)獲得脫除CMV病毒的丹參植株等工藝步驟。本發明避開了常規熱處理鈍化病毒的過程，直接採用體細胞誘導脫分化成為分裂細胞(愈傷)，分生細胞經狀態調控直接誘導再生，形成植株，脫除病毒。因此，這種方法克服了因常規「熱處理+莖尖培養」脫毒方法造成的熱處理植株乾枯、死亡的問題。特別適用於丹參脫病毒，也適用於多數植物脫病毒。
文檔編號C12N5/04GK1926964SQ20061004834
公開日2007年3月14日 申請日期2006年9月26日 優先權日2006年9月26日
發明者溫春秀, 劉銘, 吳志明, 田偉, 謝曉亮, 周巧梅 申請人:河北省農林科學院經濟作物研究所