檢測木薯細菌性萎蔫病菌的環介導恆溫擴增引物及試劑盒的製作方法

2023-09-21 18:51:35 2

專利名稱：檢測木薯細菌性萎蔫病菌的環介導恆溫擴增引物及試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明屬生物檢測技術領域，具體涉及一種檢測木薯細菌性萎蔫病菌的環介導恆溫擴增引物及試劑盒。
背景技術：
木薯細菌性萎蔫病菌導致的木薯細菌性萎蔫病是木薯上最為嚴重的病害，是木薯繁育的一個重要限制因子。該病具有高風險、分布廣、可種傳的特點，是國際上的一種重要的植物檢疫對象，在我國新出臺的《中華人民共和國進境植物檢疫危險性病、蟲、雜草名錄》被列為檢疫性病害。木薯感染此病後可造成木薯產量下降12%_100%，該病害在南非被首次報導，目前在除歐洲以外的全世界的許多國家都有報導。1973年該細菌病害在Nigeria發生時當年就造成木薯產量損失75%，並導致了嚴重的恐慌。木薯細菌性萎蔫病菌主要為害部位是木薯的葉片、莖部。屬系統性分布為害整株病害。葉片染病形成溼色角斑，溼度大時其上流膠，初為白色粘液，後變為黃褐色，致植株萎蔫、流膠。莖部染病常致莖凹陷，分泌出大量膠質物，加速葉片枯 萎。塊根染病維管束變為黃褐色，根系及維管束出現幹腐，嚴重的全株死亡。病菌在老熟莖杆的皮部裡存活，主要靠帶菌的種莖進行遠距離傳播，此外雨水、昆蟲、病土及帶菌工具也可傳播。在嚴重的木薯細菌性萎蔫病的困擾下，全世界大部分易感病地區都降低了木薯的種植面積。因此需要建立一種準確、高效、快速的木薯細菌性萎蔫病菌的檢測方法，為木薯繁殖材料的檢疫工作提供技術支持。木薯細菌性萎蔫病菌的檢測技術和方法主要包括常規檢測方法和普通PCR方法，但這兩種方法均有不足之處。常規檢測法需要進行病原物的分離培養、純化和一系列的生理生化反應及致病性測定，費時費力，難以滿足植物檢疫「快速、準確」的基本要求；PCR方法雖然特異性高，檢測周期短，但其昂貴的儀器設備和較高的假陽性率，也限制了其推廣。因此，有必要提供一種更方便、快捷的檢測方法。本發明應用環介導恆溫擴增(LAMP)引物和試劑盒將恆溫擴增技術應用於木薯細菌性萎蔫病菌的快速檢測，特異性、靈敏度比普通變溫PCR方法更高，同時可以免除高昂的儀器投入，便於基層推廣使用。

發明內容
本發明的目的是提供一種檢測木薯細菌性萎蔫病菌的環介導恆溫擴增引物，以及利用該引物檢測木薯細菌性萎蔫病菌的試劑盒，從而能夠實現對木薯細菌性萎蔫病菌進行準確快速的檢測，彌補現有技術的不足。本發明一個方面涉及檢測木薯細菌性萎蔫病菌的環介導恆溫擴增引物，為一對外側引物F3、B3和一對內側引物FIP、BIP，其核苷酸序列分別為SEQ ID NO: 1-4。本發明另一個方面提供一種木薯細菌性萎蔫病菌的環介導恆溫擴增快速檢測試劑盒，包括如下的組分:(I)模板預處理反應液23 μ L:3.2 μ M引物FIP，3.2 μ M引物BIP，0.4 μ M引物F3，0.4μΜ 引物 Β3，2.5μΜ dNTP, I X Thermol Buffer2.5 μ L，添加 ddH20 至 23 μ L。引物 FIP、BIP、F3與B3的終濃度比為8:8:1:1 ;(2)溶液 I 25 μ L:1 X ThermoL Buffer2.5uL,8U/ μ L Bst DNA PoLymerase2 μ L和 ddH2020.5 μ L。其中 IXThermol Buffer 成分為:20mM Tris-HCl (ρΗ8.8，25。C), IOmMKCl, 10mM(NH4)2S04, 2mM MgS04, 0.01%Triton X-1OO0(3)陽性對照 DNA2 μ L。本發明的木薯細菌性萎蔫病菌的環介導恆溫擴增(LAMP)檢測試劑盒的操作方法:(I)待檢樣品或目標細菌DNA的提取:提取待檢樣品核酸，其中提取的樣品DNA0D260/0D280 在 1.6-2.0 範圍內，濃度在 IO-1OOng/ μ L 範圍內。(2)模板預處理:將裝有23 μ L模板預處理反應液的反應管加入2 μ L待檢模板DNA於94°C水浴5min後迅速放入59°C的水浴中45s ;然後94°C水浴25s和59°C水浴45s過程反覆進行6個循環，產物用於LAMP模板。(3)環介導恆溫擴增(LAMP)擴增條件:將上述經過處理的模板預處理溶液加入
2μ L待檢模板DNA(陽性對照加入陽性對照DNA ；陰性對照加入滅菌的去離子水)，加入25 μ L溶液I中，63°C水浴鍋中恆溫反應60min，然後80°C IOmin終止反應，降溫至4°C。(4)分析判斷反應結果:將LAMP反應的產物，用含溴化乙錠(EB)的1.5%瓊脂糖凝膠電泳。電泳成像系統拍照。如果出現梯狀特異性條帶，則待測樣品中含有木薯細菌性萎蔫病菌；若不產生梯狀特異性條帶，則待測樣品中不含有木薯細菌性萎蔫病菌。

本發明的試劑盒用於檢測植物中的木薯細菌性萎蔫病菌。本發明的試劑盒根據木薯細菌性萎蔫病菌菌株的TAL效應器蛋白質(pthBXam)保守基因序列設計引物，從而保證了檢測方法的特異性。與現有技術相比，本發明的進步在於:特異性強，靈敏度好，檢測時間短，效率高；檢測儀器簡單，只需要普通的水浴鍋，無須昂貴的PCR儀，降低了設備投入，適合口岸檢驗檢疫機構和基層實驗室推廣。


圖1:LAMP引物特異性擴增實驗結果圖中:1:木薯細菌性萎蔫病菌(Xanthomonas axonopodis pv.manihotis)標準菌株(ATCC菌株編號:51302) ；2:木薯細菌性萎蔫病菌標準菌株(ATCC菌株編號:51302)；
3:地經草黃單胞菌模榔致病變種(Xanthomonas axonopodis pv.arecae)菌株(ACCC菌株編號:03534) ；4:油菜黃單胞菌油菜致病變種(Xanthomonas campestris pv.campestris)菌株(ACCC菌株編號:10491) ；5:油菜黃單胞菌禾草致病變種(Xanthomonas campestrispv.cerealis)菌株(ACCC 菌株編號:14146);6:水稻白葉枯病菌(Xanthomonas campestrispv.0ryzae)菌株(ACCC 菌株編號:11602) ；7:風信子黃腐病菌(Xanthomonas hyacinthi)標準菌株(ATCC菌株編號:12612) ;8:地毯草黃單胞菌萬年青致病變種(Xanthomonasaxonopodis pv.dieffenbachiae)標準菌株(ATCC 菌株編號:23379);9:陰性對照；10:空白對照；M:DL2000DNA Marker。以無菌水作為空白對照，以滅菌的去離子水代替模板的反應溶液作為陰性對照。該實驗的目的是為了驗證該發明中LAMP引物的特異性。圖2:待檢木薯樣品的木薯細菌性萎蔫病菌LAMP擴增實驗結果
圖中:1-5:木薯細菌性萎蔫病菌標準菌株(ATCC51302) ;6_8:待檢樣品A，B，C(受木薯萎蔫病菌侵染的葉片)；9-14:待檢樣品D，E，F，G，H，I (未受木薯萎蔫病菌侵染的葉片);15:陰性對照；16:空白對照；M:DL2000DNA Marker。以無菌水作為空白對照，以滅菌的去離子水代替模板的反應溶液作為陰性對照。該實驗的目的是為了檢測本發明的引物和試劑盒能否對待測木薯樣品實施準確檢測。圖3 =LAMP引物特異性擴增實驗結果圖中，M:DL2000DNA marker ;1 8的木薯細菌性萎蔫病菌(Xanthomonasaxonopodis pv.manihotis)菌株(ATCC 菌株編號:51302)濃度分別為:10°> 10 \ 10 2> 10 3、10_4、10_5、10_6、10_7 ；9:陰性對照；10:空白對照。以無菌水作為空白對照，以滅菌的去離子水代替模板的反應溶液作為陰性對照。
具體實施例方式實施例1:木薯細菌性萎蔫病菌的LAMP引物特異性擴增實驗1、引物的設計與合成LAMP引物的設計主要是針對靶基因的四個不同的區域，基於靶基因3'端的以及5'端的4個不同的位點設計4個引物。利用設計的特異引物並依靠高活性鏈置換DNA聚合酶，使得鏈置換DNA合成在不停地自我循環。本發明選用TAL效應器蛋白質(pthBXam)上的同源保守序列來設計LAMP引物。申請人在長期的研究中發現TAL效應器蛋白質(pthBXam)保守基因是木薯細菌性萎蔫病菌的特異序列之一，通過多個不同來源的序列進行保守性分析，通過長期特異性試驗篩選出特異性最好的一組LAMP引物，其序列分別為: F3 5' -CAGAACATCCCGACGCTG-3' (SEQ ID NO:1)B3 5' -GCCCTGTGGCCGTTGA-3' (SEQ ID NO:2)FIP 5' -AGCGCGACCGCTTAAGTCAAG-GTTCCGGCTTACATCCCCA-3' (SEQ ID NO:3)BIP 5' -GGCATTGCCGGCGATCACT-TCGAGCTTCGGAAAGGACCA-3' (SEQ ID NO:4) 2、供試材料DNA模板的提取將供試各菌株接於NA固體培養基上，25°C培養直至長出單菌落，挑取單菌落接種於NA液體培養基中，25°C，140r/min進行震蕩培養，36-48小時測定菌液的0D600，菌液0D600達到I後，吸取Iml菌液，12000r/min離心Imin,收集沉澱,根據Tiangen細菌DNA提取試劑盒說明書進行供試菌株總DNA的提取。其中供試材料包括:1:木薯細菌性萎蔫病菌(Xanthomonas axonopodispv.manihotis)標準菌株(ATCC菌株編號:51302) ;2:木薯細菌性萎蔫病菌標準菌株(ATCC菌株編號:51302) ;3:地毯草黃單胞菌檳榔致病變種(Xanthomonas axonopodispv.arecae)菌株(ACCC菌株編號:03534) ；4:油菜黃單胞菌油菜致病變種(Xanthomonascampestris pv.campestris)菌株(ACCC菌株編號:10491) ；5:油菜黃單胞菌禾草致病變種(Xanthomonas campestris pv.cerealis)菌株(ACCC 菌株編號:14146) ；6:水稻白葉枯病菌(Xanthomonas campestris pv.0ryzae)菌株(ACCC 菌株編號:11602) ;7:風信子黃腐病菌(Xanthomonas hyacinthi)標準菌株(ATCC菌株編號:12612) ；8:地毯草黃單胞菌萬年青致病變種(Xanthomonas axonopodis pv.dieffenbachiae)標準菌株(ATCC 菌株編號:23379)。以無菌水作為空白對照，以滅菌的去離子水代替模板的反應溶液作為陰性對照。其中木薯細菌性萎蔫病菌標準菌株、風信子黃腐病菌標準菌株、地毯草黃單胞菌萬年青致病變種均購買自ATCC，地毯草黃單胞菌檳榔致病變種、油菜黃單胞菌油菜致病變種、油菜黃單胞菌禾草致病變種、水稻白葉枯病菌均購於中國農業微生物菌種保藏中心(ACCC)。3、LAMP反應體系反應體系為50 μ 1，其中包含:(1)模板預處理反應液23 μ 1:3.2μΜ引物FIP，
3.2μΜ引物ΒΙΡ，0.4μΜ引物F3，0.4μΜ 引物Β3，2.5μΜ dNTP, I X Thermo IBuf fer2.5 μ 1，添加(1冊20至23111。引物卩1卩、81卩、卩3與83的終濃度比為8:8:1:1。(2)溶液 I 25 μ I:1 XThermol Buffer (2.5ul) ,8U/y I Bst DNA 聚合酶(2ul)，和ddH20(20.5μ I)。其中 IXThermol Buffer 成分為:20mM Tris-HCl (ρΗ8.8，25。C), IOmMKCl, 10mM(NH4)2S04, 2mM MgS04, 0.01%TritonX_100。(3)模板 2 μ I。4、LAMP 擴增將裝有23 μ L模板預處理反應液的反應管加入2 μ L待檢模板DNA於94°C水浴5min後迅速放入59°C的水浴中45s ;然後94°C水浴25s和59°C水浴45s，過程反覆進行6個循環。將上述經過處理的模板預處理混合溶液25yL加入25yL溶液I中，63°C水浴鍋中恆溫反應60min，然後80°C IOmin終止反應，降溫至4°C。5、結果判斷核酸擴增完成後，在反應管中加入6 X Loading buffer，取產物10 μ L加入凝膠板的樣品孔中，用含溴化乙錠(EB)的1.5%瓊脂糖凝膠電泳40分鐘，電泳成像系統拍照。結果參見圖1。其中1、2為木薯細菌性萎蔫病菌標準菌株，均能出現梯狀特異性條帶。其他同屬的近緣細菌都沒有梯狀特異性條帶出現。結果表明本發明引物對木薯細菌性萎蔫病菌的特異性強，可以準確鑑定木薯細菌性萎蔫病菌。實施例2:待檢木薯樣品的木薯細菌性萎蔫病菌LAMP擴增實驗1、引物的設計與合成(同具體實施方式
例I)2、待測樣品總核酸提取將Ig待檢木薯樣品葉片放入滅菌研缽中，加入液氮用研杵研成粉狀，取粉末移入1.5mL離心管中，加入1000 μ L抽提取緩衝液，在65°C水浴孵育30min ;室溫14000g離心15min ;取上清液加入等體積的三氯甲烷和異戊醇(24:1)混合溶液，混勻，放置15min，14000g離心15min ;取上清液加入0.6倍的異丙醇混勻，14000g離心30min ;棄上清液，用70%乙醇洗滌兩次，無水乙醇洗滌兩次，並倒置離心管Imin ;加入100 μ L的TE緩衝液(lmmol/L Tris-HCl, pH8.0 ；0.lmmol/L EDTA)懸浮總核酸，置於 _20°C下保存備用。本實驗供試材料包括:1-5:木薯細菌性萎蔫病菌標準菌株(ATCC菌株編號:51302) ；6-8:待檢樣品A，B，C (受木薯萎蔫病菌侵染的葉片)；9_14:待檢樣品D，E，F，G，H，I (未受木薯萎蔫病菌侵染的葉片)。以無菌水作為空白對照，以滅菌的去離子水代替模板的反應溶液作為陰性對照。3、LAMP反應體系(同具體實施方式
例I)4、LAMP擴增(同具體實施方式
例I)5、結果判斷 核酸擴增完成後，在反應管中加入6 X Loading buffer，取產物10 μ L加入凝膠板的樣品孔中，用含溴化乙錠(EB)的1.5%瓊脂糖凝膠電泳40分鐘，電泳成像系統拍照。結果參見圖2。其中1-8均能出現梯狀特異性條帶；9-16均未出現梯狀特異性條帶。結果表明本發明的引物和試劑盒能夠對待測木薯樣品實施準確檢測，沒有出現假陰性和假陽性。實施例3:木薯細菌性萎蔫病菌的LAMP引物靈敏性擴增實驗1、引物的設計與合成(同具體實施方式
例I)2、木薯細菌性萎蔫病菌菌株DNA模板的提取將木薯細菌性萎蔫病菌標準菌株(ATCC菌株編號:51302)接於NA固體培養基上，25°C培養直至長出單菌落，挑取單菌落接種於NA液體培養基中，25°C，140r/min進行震蕩培養，36-48小時測定菌液的0D600，菌液0D600達到I後，吸取Iml菌液，12000r/min離心Imin,收集沉澱,根據Tiangen細菌DNA提取試劑盒說明書進行菌株總DNA的提取。將得到的DNA利用Eppendorf核酸蛋白儀測定濃度，濃度IOOng/ μ I。然後對獲得的DNA進行10倍系列稀釋，用不同的稀釋度做模板進行LAMP擴增，以檢測其靈敏度。3、LAMP反應體系(同具體實施方式
例I)4、LAMP擴增(同具體實施方式
例I)5、結果判斷·核酸擴增完成後，在反應管中加入6 X Loading buffer，取產物10 μ L加入凝膠板的樣品孔中，用含溴化乙錠(EB)的1.5%瓊脂糖凝膠電泳40分鐘，電泳成像系統拍照。結果參見圖3。隨著模板濃度的降低，梯狀特異性條帶逐漸變淡，至稀釋度10_7時沒有擴增產物。結果表明本發明的引物和試劑盒檢測木薯細菌性萎蔫病菌的最大稀釋度為10_6。根據DNA的濃度計算得出，本LAMP方法的檢測限為0.2pgDNA,完全能夠滿足靈敏度檢測的要求。
權利要求
1.一種檢測木薯細菌性萎蔫病菌的環介導恆溫擴增引物，所述的引物為F3、B3、FIP和BIP，其核苷酸序列分別為SEQ ID N0:l-4。
2.一種木薯細菌性萎蔫病菌的環介導恆溫擴增檢測試劑盒，所述的試劑盒所使用的引物為權利要求1所述的引物。
3.如權利要求2所述環介導恆溫擴增檢測試劑盒，包括如下組分: (1)模板預處理反應液23μL:3.2μΜ引物FIP，3.2μΜ引物ΒΙΡ，0.4μΜ引物F3，0.4μΜ 引物 Β3，2.5μΜ dNTP, I X ThermolBuffer2.5 μ L,添加 ddH20 至 23 μ L ;其中引物FIP、BIP、F3與Β3的終濃度比為8:8:1:1 ； (2)溶液I 25 μ L:1 XThermoL Buffer2.5uL,8U/ μ L Bst DNAPoLymerase2 μ L和 ddH2020.5 μ L ;其中 IXThermol Buffer 成分為:20mM Tris-HCl, IOmMKCl, 10mM(NH4)2S04, 2mM MgS04, 0.01%Triton X-1OO ； (3)陽性對照DNA。
4.權利要求3所述的木薯細菌性萎蔫病菌的環介導恆溫擴增檢測試劑盒的操作方法: (1)待測樣品總核酸提取:將Ig待檢木薯樣品葉片放入滅菌研缽中，加入液氮用研杵研成粉狀，取粉末移入1.5mL離心管中，加入1000 μ L抽提取緩衝液，在65°C水浴孵育30min ;室溫14000g離心15min ;取上清液加入等體積的三氯甲燒和異戍醇混合溶液,混勻，放置15min, 14000g離心15min ;取上清液加入0.6倍的異丙醇混勻，14000g離心30min ;棄上清液，用70%乙醇洗滌兩次，無水乙醇洗滌兩次，並倒置離心管Imin ;加入100 μ L的TE緩衝液懸浮總核酸，置於-20°C下保存備用； (2)模板預處理:將裝有23μ L模板預處理反應液的反應管加入2 μ L待檢模板DNA於94°C水浴5min後迅速放入59°C的水浴中45s ;然後94°C水浴25s和59°C水浴45s過程反覆進行6個循環，產物用於LAMP擴增模板； (3)環介導恆溫擴增擴增條件:將上述經過處理的模板預處理溶液25μL加入25μ L溶液I中，63°C水浴鍋中恆溫反應60min，然後80°C IOmin終止反應，降溫至4°C ； (4)分析判斷反應結果:將LAMP反應的產物，用含溴化乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電泳成像系統拍照；如果出現梯狀特異性條帶，則待測樣品中含有木薯細菌性萎蔫病菌；若不產生梯狀特異性條 帶，則待測樣品中不含有木薯細菌性萎蔫病菌。
5.權利要求2或權利要求3所述的試劑盒用於檢測植物中的木薯細菌性萎蔫病菌。
全文摘要
本發明涉及檢測木薯細菌性萎蔫病菌的環介導恆溫擴增引物及試劑盒。所述的引物由一對外引物和一對內引物組成，核苷酸序列分別為SEQ ID NO1-4。試劑盒內有模板預處理反應液、恆溫擴增反應液Ⅰ，陽性對照DNA模板。檢測木薯細菌性萎蔫病菌的方法包括待檢樣品總核酸提取、模板預處理、LAMP恆溫擴增、擴增核酸電泳檢測。本發明的試劑盒根據木薯細菌性萎蔫病菌菌株的TAL效應器蛋白質(pthBXam)保守基因序列設計引物，保證了檢測方法的特異性。與現有技術相比，本發明的進步在於特異性強，靈敏度好，檢測時間短，效率高；檢測儀器簡單，只需要普通的水浴鍋，無須昂貴的PCR儀，降低了設備投入，適合口岸檢驗檢疫機構和基層實驗室推廣。
文檔編號C12Q1/68GK103255228SQ20131022574
公開日2013年8月21日 申請日期2013年6月7日 優先權日2012年6月8日
發明者封立平, 倪新, 尼秀媚, 粟智平, 魏曉棠, 邵秀玲, 厲豔, 吳興海, 王英超, 欒晶 申請人:山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心