一種小分子羊胎素的提取方法及在護膚品領域的運用的製作方法
2023-09-21 20:15:10 5
一種小分子羊胎素的提取方法及在護膚品領域的運用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了屬於生物【技術領域】的一種小分子羊胎素的提取方法及在護膚品領域的運用。其提取方法為採用同期發情獲得大量的同期懷孕羊，並在懷孕85-100天時手術法取出胎羊，取軀體勻漿，反覆凍融裂解細胞，高溫變性、消毒、並沉澱雜蛋白，高速離心後採用30KD超濾去掉大分子雜蛋白及細菌、內源性病毒等有毒有害成分及雜質，獲得純淨的小分子羊胎素產品並以1KD的超濾組件對小分子羊胎素產品進行超濾濃縮。本發明的小分子羊胎素可廣泛的用於護膚品、美容產品、創傷癒合產品、保健品、科學研究等領域。本發明的方法為羊胎素的生產提供了一個重要的新途徑，並首次鑑定了小分子羊胎素的組成成分，並為科學使用羊胎素提供了理論依據。
【專利說明】一種小分子羊胎素的提取方法及在護膚品領域的運用
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物【技術領域】，具體涉及一種小分子羊胎素的提取方法及在護膚品領域的運用。
【背景技術】
[0002]羊胎素，包含了羊胎盤素(the Extract of Sheep's Placental)和羊胚胎素(theExtract of Goat's Embryo)兩個不同的產品。
[0003]羊胎盤素是羊胎盤內的一種具有生物活性的物質，經提取出來後廣泛用於各種化妝品、藥品及健康食品中。
[0004]羊胚胎素則是存在於胎羊體內，經提取後也是廣泛用於各種化妝品、藥品及健康食品中。
[0005]從羊胚胎中提取活性物質要比從胎盤中提取活性物質困難得多，也珍貴得多，活性物質的成分也大不相同。羊胚胎素能夠激活人體老化細胞、促進細胞再生與分裂。
[0006]1912年瑞士科學家卡爾教授首次發現羊胚胎細胞中有一種能使細胞恢復活力的物質，這種活性物質可以促使細胞分裂次數的增加，能迫使已衰退或老化的細胞重新活化或被淘汰，從而使機能衰退的器官恢復旺盛活力。卡爾教授因此而獲得諾貝爾獎。該物質即為上所述的羊胚胎素。
[0007]1931年，瑞士保羅尼翰醫生首次將從小羊胚胎中提取的一種活性物質注射到一名甲狀旁腺受損的臨危病人體內，並成功挽救了其生命，這就是羊胚胎素細胞活化療法的最初起源，它的發現對人類在抗衰老領域的醫學發展有著裡程碑式的意義。亦即羊胚胎素的初次運用。
[0008]目前市場上羊胎素產品主要來源於上述羊胎盤、羊胚胎兩個方面，並以羊胎盤粉、羊胚胎粉、羊胎盤提取物凍乾粉、羊胚胎提取物凍乾粉等不同的形式用於保健品、護膚品、藥品等領域。各種產品的生產方法五花八門，生產方法專利也很多，但這些方法大多不切合實際，不夠科學嚴謹，難以正式生產形成生產力。
[0009] 申請人:長期對羊胎素的提取方法進行研究，開發出一個實用的，科學的，嚴謹的，高效的羊胚胎素的提取方法，並獲得一種小分子羊胎素。
[0010]本發明所述羊胎素為羊胚胎提取物，是通過生物技術方法，從85-100天胎羊中提取的一類生物活性物質，該階段的胎羊中含有最大量的多種抗衰老因子、表皮生長因子、組織修復因子等，能促進表皮分化更新，使機體延緩衰老，增加皮膚彈性，使皮膚美白光滑，還能改善睡眠、增強免疫力、抗疲勞、防輻射等功能，克服了目前羊胎提取物存在免疫原性高、生物活性差、專一性弱、效果不明顯等缺點，使其具有更強的適應性，不易過敏，更好的抗衰老、促進細胞生長和組織修復的功能。
[0011]目前羊胚胎提取物的提取工藝方法比較多，要麼比較複雜要麼過於粗放，不能用於實際運用。複雜的如:申請號98112918.8，一種羊胎素針劑的製造方法，在製作過程中加入丙酮、乙醇、三氯乙酸、硫酸銨等化學物質，在實際生產以及產品實用中會面臨很多問題。簡單的方法很多，有的純粹是打著羊胎素的名實際生產的是羊胎粉，如申請號:98101188.8，一種製作凍幹羊胎素的方法；申請號:98115761.0,羊胎素凍乾粉及其生產方法。有的甚至在提取的較純的羊胎素中添加了大量的胰酶或者胃蛋白酶酶切的蛋白肽段，而這些肽段是很複雜的混合物，限制了羊胎素的使用範圍以及影響使用效果，如申請號:200610085611.6，從羊胚胎中提取活化小分子羊胎素的方法及其用途。
【發明內容】
[0012]本發明的目的在於提供一種小分子羊胎素的提取方法，確切地說是一種小分子羊胚胎素，是從85-100天胎齡的羊胚胎細胞中提取出來的一種具有極高生物活性的營養物質，能夠提高人體細胞的分裂速度，活化人體細胞，加速老化細胞的分解排除。
[0013]本發明的目的還在於提供上述小分子羊胎素在護膚品領域的應用。
[0014]一種小分子羊胎素的提取方法，按照如下步驟進行:
[0015](I)挑選身體健康、年齡在2-3歲、發情周期正常的經產母羊作為待孕羊，所有羊均已經檢疫、防疫和藥浴等處理，並在飼料中補充青飼料、維生素和微量元素；
[0016](2)在待孕羊在黃體期7-14d時肌注氯前列烯醇，30h後開始觀察發情，當觀察到發情後12小時進行人工採精和輸精，發情後24可復配一次，35天後進行B超檢查，確定懷孕情況；
[0017](3)待胎羊長到85-100天時，手術法取出胎羊，置於高溫滅菌的容器內，用無菌生理鹽水洗淨，去除眼球、大腦、肝、肺、心、腸和胃；
[0018](4)用無菌生理鹽水清洗，浙幹水分，稱重，用消毒過的剪刀把胎羊剪碎，放入滅菌過的勻漿機內勻漿；
[0019](5)加入生理鹽水與胎羊碎塊進行勻漿，勻漿液加入生理鹽水稀釋，生理鹽水的總量是胎羊質量的2-4倍，勻漿稀釋液經不鏽鋼濾網過濾，上層50目，中層100目，下層200目；
[0020](6)勻漿濾過液置於消毒過的鋼化玻璃託盤放置_30°C冰箱，冰凍過夜，或儲存；
[0021](7)取出凍存的勻漿濾過液室溫解凍，至完全凍融，轉入無菌離心容器內，3000-5000rpm,離心8-12分鐘，棄沉澱；
[0022](8)上清轉入無菌耐熱容器，置於60-80°C水浴，60-80°C保溫20_40分鐘，充分殺滅胎羊可能從母體帶入的病毒以及變性雜蛋白；
[0023](9)迅速放入-30°C冰箱冷卻至-1-1 °C，或凍存；
[0024](10)轉移液體至滅菌的離心容器，3000-5000rpm,離心20-40分鐘，棄沉澱；
[0025](11)上清轉入滅菌容器，使用切向流超濾系統，根據上清的體積使用不同的系統，超濾；
[0026](12)濾膜超濾後分成兩部分，濃縮液大於30KD的雜蛋白，棄用；濾過液為小於30KD的小分子蛋白；使用切向流超濾系統對濾過液進行超濾濃縮，得到濃縮液及濾過液，對濃縮液進行0.22ug過濾除菌，_80°C凍存。
[0027]步驟(11)所述切向流超濾系統為Centramate超濾系統及T系列膜包，30KD孔徑。
[0028]步驟(12)所述切向流超濾系統為Centramate超濾系統及T系列膜包，30KD孔徑，使用IKD膜包。
[0029]所述小分子羊胎素顏色為淡黃色，濃度越濃顏色越深，最大紫外吸收值為252nm ；PH為6.7-7.4 ；SDS-PAGE電泳條帶為15KD ;純度95% ;產率為lg/100g胎羊體重。
[0030]上述小分子羊胎素在護膚品領域的應用，用於製備除皺紋增加皮膚的光潔度及細膩度的凍乾粉，所述凍乾粉由以下重量份數的物質組成:小分子羊胎素3-8份，甘露醇3-7份，海藻糖3-7份，透明質酸0.01-1份，水80-90份。
[0031]上述小分子羊胎素在護膚品領域的應用，用於製備除皺紋增加皮膚的光潔度及細膩度的溶液，所述溶液由以下重量份數的物質組成:小分子羊胎素4-8份，甘露醇3-7份，海藻糖3-7份，水80-90份。
[0032]本發明的有益效果:
[0033]本發明採用物理方法分多級對原材料進行純化，全程沒有有機試劑或者其他化學物質的介入，且在低溫下完成提取，不但保持了提取物的純淨，且最大限度的保留了羊胎中的活性物質，安全、環保、低能耗，易於標準化、規模化生產。
[0034]本發明採用同期發情技術以及外科手術法開刀獲取胎羊，既得到大量的同批次胎羊又保證了胎羊原料的無菌、新鮮，手術後的母羊還可以繼續懷孕，生產新的胎羊，提高了母羊的使用率，減少了成本。
[0035]本發明採用分級提取、優化利用的技術方案。先提取了一種小分子天然活性小分子羊胎素後，又對大分子羊胎素進行木瓜蛋白酶酶切，得到大量具有生物活性的小分子多肽及游離胺基酸。既提高了產品的生產效率，保證了原料的最大限度利用及產品的最大使用效果；既保持了小分子羊胎素的天然活性，又避免了大分子羊胎素所具有的免疫原性等問題。
[0036]本發明採用了先進的切向流超濾技術，物理方法截取了小於30K的天然活性小分子羊胎素及酶切後的小分子多肽；同時使用切向流超濾技術濃縮，攔截並濃縮了具有天然活性的、主要分子量為1-30K的小分子羊胎素及酶切多肽。
[0037]本發明採用了超聲輔助酶切技術，對大於30K的大分子羊胎素蛋白進行快速、低溫水解，避免了傳統蛋白質酶解的溫度高、時間長的弊端。
[0038]本發明製得小分子羊胎素在理化性質參數及紫外吸收光譜圖譜等優於相類似產品的羊胎素，並經清除羥自由基、超氧自由基實驗、細胞培養實驗、自願者試驗，皆證明其有很高的清除自由基、促進細胞生長的活性以及去除皺紋、美化皮膚的作用。
[0039]本發明製得的小分子羊胎素用途廣泛，適用於工業大生產。原料來源、原料處理、生產效率、生產工藝、產品效果都有傳統方法不可比擬的優勢，容易建廠投產，並且低能耗，低排放，符合低碳環保要求。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0040]圖1為本發明提取的小分子羊胎素電泳圖。
[0041]圖2為使用本發明小分子羊胎素前後對照圖。
[0042]圖3為使用本發明小分子羊胎素前後對照圖。
【具體實施方式】
[0043]下面結合附圖和具體實施例對本發明做進一步說明。
[0044]實施例1
[0045]一種小分子羊胎素的提取方法，按照如下步驟進行:
[0046](I)挑選身體健康、年齡在2-3歲、發情周期正常的經產母羊作為待孕羊，所有羊均已經檢疫、防疫和藥浴等處理，並在飼料中補充青飼料、維生素和微量元素；
[0047](2)在待孕羊在黃體期7-14d時肌注氯前列烯醇，30h後開始觀察發情，當觀察到發情後12小時進行人工採精和輸精，發情後24可復配一次，35天後進行B超檢查，確定懷孕情況；
[0048](3)待胎羊長到85-100天時，手術法取出胎羊，置於高溫滅菌的容器內，用無菌生理鹽水洗淨，去除眼球、大腦、肝、肺、心、腸和胃；
[0049](4)用無菌生理鹽水清洗，浙幹水分，稱重，用消毒過的剪刀把胎羊剪碎，放入滅菌過的勻漿機內勻漿；
[0050](5)加入生理鹽水與胎羊碎塊進行勻漿，勻漿液加入生理鹽水稀釋，生理鹽水的總量是胎羊質量的3倍，勻漿稀釋液經三層不鏽鋼濾網過濾，上層50目，中層100目，下層200目；
[0051](6)勻漿濾過液置於消毒過的鋼化玻璃託盤放置_30°C冰箱，冰凍過夜，或儲存；
[0052](7)取出凍存的勻漿濾過液室溫解凍，至完全凍融，轉入無菌離心容器內，4000rpm,離心10分鐘，棄沉澱；
[0053](8)上清轉入無菌耐熱容器，置於70°C水浴，70°C保溫30分鐘，充分殺滅胎羊可能從母體帶入的病毒以及變性雜蛋白；
[0054](9)迅速放入-30°C冰箱冷卻至-1-1 °C，或凍存；
[0055](10)轉移液體至滅菌的離心容器，4000rpm,離心30分鐘，棄沉澱；
[0056](11)上清轉入滅菌容器，使用切向流超濾系統，根據上清的體積使用不同的系統，超濾；
[0057](12)濾膜超濾後分成兩部分，濃縮液大於30KD的雜蛋白，棄用；濾過液為小於30KD的小分子蛋白；使用切向流超濾系統對濾過液進行超濾濃縮，得到濃縮液及濾過液，對濃縮液進行0.22ug過濾除菌，_80°C凍存。
[0058]步驟(11)所述切向流超濾系統為Centramate超濾系統及T系列膜包,30KD孔徑。
[0059]步驟(12)所述切向流超濾系統為Centramate超濾系統及T系列膜包,30KD孔徑，使用IKD膜包。
[0060]所述小分子羊胎素顏色為淡黃色，濃度越濃顏色越深，最大紫外吸收值為252nm ；PH為6.7-7.4 ；SDS-PAGE電泳條帶為15KD ;純度95% ;產率為lg/100g胎羊體重。其電泳圖如圖1所示。
[0061]實施例2
[0062](I)通過手術方法解剖母羊，得到無菌的胎羊，置於無菌容器內，用生理鹽水洗淨，去除眼球、大腦、肝、肺、心、腸和胃。
[0063](2)用無菌生理鹽水清洗，浙幹水分，稱重。
[0064](3)加入無菌純水與胎羊碎塊進行勻漿，勻漿液加入純水稀釋，純水的質量是胎羊質量的3倍，勻漿稀釋液經三層不鏽鋼濾網過濾，上層20目，中層50目，下層100目。
[0065](4)勻漿濾過液置於無菌容器放置_30°C冰箱，冰凍過夜，或儲存。
[0066](5)取出凍存的勻漿濾過液室溫解凍，轉入無菌耐熱容器，置於70°C水浴，70°C保溫30分鐘。
[0067](6)迅速冷卻，-30攝氏度凍存。
[0068](7)解凍，轉移液體至離心容器，4000rpm, 10分鐘，棄沉澱。
[0069](8)上清轉入無菌容器,使用pall公司切向流超濾系統,30k孔徑,超濾。
[0070](9) 30K濾膜超濾後分成兩部分，一部分是大於30K的大蛋白，一部分小於30k的小分子多肽，對大於30KD的組分離心，4000轉離心20分鐘，去沉澱；用木瓜蛋白酶進行超聲輔助酶切，95-98攝氏度保溫溶液3?5分鐘以中止酶解反應，靜止10分鐘並快速降溫低於10攝氏度。
[0071](10)對上述水解液離心，4000rpm，20分鐘，去除酶切後產生的沉澱。保留上清，上清液經30KD超濾膜超濾，收集小於30KD的組分；再使用pall公司切向流超濾系統，IkD孔徑，對小於30KD的組分濃縮,採用核酸蛋白測定儀(Eppendorf B1Photometer Plus)測定其濃度值，蛋白濃度模式，280nm檢測，統一濃度。編號為:A2，SDS-PAGE電泳檢測，主條帶為12K大小的小分子多肽。A2即為優化小分子羊胎素原液，備用。
[0072](11)對第9步超濾小於30K的組分進一步提取純化,使用pall公司切向流超濾系統，IkD孔徑，超濾，超濾後得到兩個組分，濃縮液為小於30K超濾組分的高濃縮產物，採用核酸蛋白測定儀(Eppendorf B1Photometer Plus)測定其濃度值，蛋白濃度模式，280nm檢測，統一濃度，編號為Al，即為天然活性的小分子多肽原液，SDS-PAGE電泳主要分子量在12KD左右，透過液其分子量小於IKD，SDS-PAGE電泳不能檢出條帶。
[0073](12)把A1、A2作為原料分別凍存。需生產成品時解凍，按生產需要量取一定體積的原料，稱取甘露醇，按質量百分比5%終濃度稱取；稱取海藻糖，按質量百分比5%終濃度稱取，二者加入Al或A2溶解(最終質量百分為6% ),定容,用0.22um濾器過濾，採用核酸蛋白測定儀(Eppendorf B1Photometer Plus)測定其濃度值,蛋白濃度模式,280nm檢測，備用。
[0074](13)另外稱取無菌透明質酸鈉，加入適量無菌PBS溶解，使其濃度為1%，取適量1%的透明質酸溶液加入上述已加輔料(甘露醇、海藻糖)的羊胎素液，使透明質酸在溶液裡的終濃度為0.05%，超淨工作檯上分裝，分裝體積Iml/管。凍幹機凍幹，使用時加入3ml的無菌溶解用水溶解，直接塗抹於臉部等需要美容護膚的部位。
[0075](14)對A1、A2原料按照第(12)、(13)步的步驟加工成成品，分別獲得產品I及產品2，兩種產品皆具有具有高效去除羥自由基、超氧自由基的活性。
[0076]Al，分子量小於30KD的天然活性小分子多肽及小蛋白，主要分子量經SDS-PAGE檢測主要在12KD左右，具有清除羥自由基、超氧自由基、促進細胞生長的活性以及去除皺紋、美化皮膚的作用，質譜鑑定出有54中蛋白的多肽片段或小蛋白。
[0077]A2，分子量小於30KD的活性小分子多肽，經SDS-PAGE檢測其分子量主要在12KD
左右，具有清除輕自由基、超氧自由基活性。
[0078]本品經100名志願者使用，發現能夠明顯的去除皺紋，增加皮膚的光潔度及細膩度。使用效果見圖2-3 (該志願者為女性，65歲，藝術家，使用Al產品)。
【權利要求】
1.一種小分子羊胎素的提取方法，其特徵在於，按照如下步驟進行: (1)挑選身體健康、年齡在2-3歲、發情周期正常的經產母羊作為待孕羊，所有羊均已經檢疫、防疫和藥浴等處理，並在飼料中補充青飼料、維生素和微量元素； (2)在待孕羊在黃體期7-14(1時肌注氯前列烯醇，30卜後開始觀察發情，當觀察到發情後12小時進行人工採精和輸精，發情後24可復配一次，35天後進行8超檢查，確定懷孕情況； (3)待胎羊長到85-100天時，手術法取出胎羊，置於高溫滅菌的容器內，用無菌生理鹽水洗淨，去除眼球、大腦、肝、肺、心、腸和胃； (4)用無菌生理鹽水清洗，浙幹水分，稱重，用消毒過的剪刀把胎羊剪碎，放入滅菌過的勻漿機內勻漿； (5)加入生理鹽水與胎羊碎塊進行勻漿，勻漿液加入生理鹽水稀釋，生理鹽水的總量是胎羊質量的2-4倍，勻漿稀釋液經不鏽鋼濾網過濾，上層50目，中層100目，下層200目； (6)勻眾濾過液置於消毒過的鋼化玻璃託盤放置-30-(:冰箱，冰凍過夜，或儲存； (7)取出凍存的勻漿濾過液室溫解凍，至完全凍融，轉入無菌離心容器內，3000-5000^111,離心8-12分鐘，棄沉澱； (8)上清轉入無菌耐熱容器，置於60-801水浴，60-801保溫20-40分鐘，充分殺滅胎羊可能從母體帶入的病毒以及變性雜蛋白； (9)迅速放入-301冰箱冷卻至或凍存； (10)轉移液體至滅菌的離心容器，3000-500011)111，離心20-40分鐘，棄沉澱； (11)上清轉入滅菌容器，使用切向流超濾系統，根據上清的體積使用不同的系統，超濾； (12)濾膜超濾後分成兩部分，濃縮液大於301(0的雜蛋白，棄用；濾過液為小於301(0的小分子蛋白；使用切向流超濾系統對濾過液進行超濾濃縮，得到濃縮液及濾過液，對濃縮液進行0.22118過濾除菌，-801凍存。
2.根據權利要求1所述小分子羊胎素的提取方法，其特徵在於，步驟(11)所述切向流超濾系統為06111:1^111211:6超濾系統及I系列膜包，301(0孔徑。
3.根據權利要求1所述小分子羊胎素的提取方法，其特徵在於，步驟(12)所述切向流超濾系統為&11廿肅社6超濾系統及I系列膜包，30X0孔徑，使用11(0膜包。
4.根據權利要求1所述小分子羊胎素的提取方法，其特徵在於，所述小分子羊胎素顏色為淡黃色，濃度越濃顏色越深，最大紫外吸收值為252=111 ；？！！為6.7-7.4 ；808~？^62電泳條帶為151(0 ；純度95% ；產率為18/1008胎羊體重。
5.權利要求1所述小分子羊胎素在護膚品領域的應用，其特徵在於，用於製備除皺紋增加皮膚的光潔度及細膩度的凍乾粉，所述凍乾粉由以下重量份數的物質組成:小分子羊胎素3-8份，甘露醇3-7份，海藻糖3-7份，透明質酸0.01-1份，水80-90份。
6.權利要求1所述小分子羊胎素在護膚品領域的應用，其特徵在於，用於製備除皺紋增加皮膚的光潔度及細膩度的溶液，所述溶液由以下重量份數的物質組成:小分子羊胎素4-8份，甘露醇3-7份，海藻糖3-7份，水80-90份。
【文檔編號】A61K8/02GK104382825SQ201410685145
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年11月26日 優先權日:2014年11月26日
【發明者】曾凡一, 黃淑幀 申請人:上海滔滔轉基因工程股份有限公司