抗微生物的膠原構建體的製作方法

2023-09-21 20:40:15 2

專利名稱：抗微生物的膠原構建體的製作方法
技術領域：
本發明屬於再生醫學和組織工程學領域。本發明涉及從所加工的組織材料或基 質製備的生物工程化的構建體，該組織材料或基質是動物來源的。本發明的生物工程化 的構建體是採用保持所加工的組織基質的生物相容性、細胞相容性、強度和生物重塑性 能的方法製備的。為該生物工程化的構建體賦予抗微生物性能，該構建體用於移植、植 入、組織修復、創傷修復和重塑，或者用於哺乳動物宿主中的其他用途。
背景技術：
簡介再生醫學和組織工程學領域將工程化方法和生命科學原理相結合起來，以便了 解正常及病理狀態下的哺乳動物組織中結構與功能之間的關係。再生醫學和組織工程化 的目標是開發並最終應用生物代用品來保存、維持或改進組織的功能。膠原是機體中最主要的結構蛋白質，約佔機體總蛋白質的三分之一。膠原構成 皮膚、腱、骨和牙齒的有機物質的大部分，而且在大多數其他機體結構中作為纖維性內 含物存在。膠原的一些性能包括高抗張強度；部分地由於螺旋結構模擬潛在抗原決定簇 而產生的低抗原性；和低延展性、低半透性和低溶解性。此外，膠原是細胞附著的天然 物質。這些和其他性能使得膠原成為組織工程化和製造可植入的生物相容性代用品和生 物重塑假體的合適材料。已經對從被移植哺乳動物組織中獲得膠原組織和組織構造的方法以及用這些組 織和組織構造構建假體的方法進行了廣泛研究，以用於創傷癒合、外科手術修復以及組 織或器官的替代。研究人員的持續目標在於開發生物工程化的構建體，該構建體可成功 地用於提高患者所接受的衛生保健的標準。發明概述生物來源的膠原材料如腸黏膜下層可用於組織的修復或替換，並持續被開發和 改進。給新的生物工程化的、可生物重塑的構建體賦予抗微生物性能，以提高它們在 再生醫學中的優良性能，再生醫學包括創傷癒合、組織的修復和替換。公開了處理豬 空腸近端的機械方法和化學方法，製備來源於腸黏膜下層的單一的、非細胞的腸膠原層 (ICL)，用該ICL製備具有抗微生物性能的薄片，用於治療、修復和替代。該加工去除 細胞和細胞碎片，而保留天然膠原組織基質的結構。用經加工的組織基質薄片製備具有 期望規格的單層和多層的層壓的、交聯構建體。單層創傷敷料產品、層壓的多層補片用 於軟組織修復以及用作血管移植物的管狀構建體的功效已經被研究。經加工的、腸道來 源的組織材料提供必需的物理支持，而產生最少的粘連，並且能夠整合到周圍天然組織 中，並被宿主細胞滲透。體內生物重塑不包括這些構建體的機械整合。該植入物的固有 性質和功能性能是十分重要的參數，如彈性係數、縫合保持力和極性抗張強度，通過改 變層數和交聯條件等方式，使這些條件適合特定需求。將抗微生物性能引入到這些構建 體中，控制或降低使用這些構建體的處理部位的細菌活性。本發明的目的在於提供一種具有抗微生物性能的生物工程化的膠原構建體，其 包括源於如小腸黏膜下層的組織來源的片狀的純化膠原組織基質層，或者經加工的、源於小腸黏膜下層的腸道膠原層，它們均被抗微生物劑處理過。當用本發明的生物工程 化的膠原構建體作為創傷敷料處理哺乳動物患者的傷口時，將該構建體應用於創面床上 以基本上覆蓋該傷口，給患者自身的皮膚組織提供一個溼潤的環境，以促進皮膚組織再 生，同時該構建體中的抗微生物劑控制或降低傷口中的細菌活性。構建體具有生物相容 性是指該構建體不具有細胞毒性，不會引起皮膚脫敏以及不會引起原發性皮膚炎症。在一個具體實施方案中，創傷敷料包括厚度約0.05mn到約0.07mm的經加工的 腸道膠原片和一種抗微生物劑，該膠原片來源於小腸黏膜下層。鑑於該純化的組織基 質的片狀幾何學特點，可以將它們疊加，然後將各層化學粘合在一起，得到多層的構建 體。因此，其他的具體實施方案是包含雙層或更多層的純化組織基質的構建體，純化組 織基質被粘合在一起而且經過抗微生物劑的處理。本發明的構建體可以是有網孔的、被 穿孔的或有窗的，以更適合創面床的大小，更好地排洩傷口滲出物，或者為了適應上述 兩種需求。本發明的另一個目的在於處理需要護理和處置的傷口，特別是需要抗微生物劑 介入和保護的傷口，該傷口包括如下創傷類型中的任何一種部分和完全厚度傷口、壓 迫性潰瘍、靜脈潰瘍、糖尿病潰瘍、慢性血管潰瘍、隧道/地雷傷口、外科手術傷口、 用於自體移植的供體部位傷口、Moh氏外科手術後傷口、雷射手術後傷口、傷口開裂、 外傷傷口擦傷、破裂、二級燒傷、皮膚撕裂或者流液型傷口。本發明的另一個目的在於提供用於處理和修復軟組織和器官的外科手術修復裝 置，如補片或者網膜，其包括雙層或更多層加工的、源於小腸黏膜下層的腸道膠原，其 層數可以在2到10之間，將這些腸道膠原粘合和交聯在一起，形成具有生物相容性和可 生物重塑的多層構建體，當將構建體植入到受損或患病的軟組織時，同時發生可控制的 生物降解和足夠的活細胞替代，使得最初的植入假體被患者中的活細胞重塑。本發明的 另一個目的是提供處理需要修復和抗微生物劑介入的受損或患病的軟組織的方法，包括 植入一種假體，該假體包括包含兩層或多層疊加的、化學粘合的加工的、源於與抗微生 物劑接觸的小腸黏膜下層的腸道膠原，當將該假體植入受損的或患病的軟組織時，同時 發生可控制的生物降解和適當的活細胞替代，使得最初的植入假體被患者中的活細胞重 塑。例如，需要修復的受損的或患病的軟組織是腹壁和胸壁缺陷、肌肉翻轉加固、直腸 和陰道下垂、骨盆底重建、疝氣、縫合線加固和重建過程。發明詳述本發明涉及生物工程化的膠原構建體(例如，假體、移植物)，包括片狀的純化 的膠原組織基質層，該基質層是經加工的組織材料，來源於天然組織並被抗微生物劑處 理過，例如經加工的、源於小腸黏膜下層的腸道膠原層。生物工程化的膠原構建體可以 是單層的加工的組織基質，或者是多層疊加的、粘合的加工的組織基質。當用本發明的 生物工程化的膠原構建體處理哺乳動物受試者的傷口時，將該構建體應用於創面床上以 基本上覆蓋該傷口，給患者自身的皮膚組織提供一個溼潤的環境以促進皮膚組織再生， 同時抗菌成分控制或降低傷口中和傷口周圍的細菌活性。當本發明的生物工程化的膠原 構建體作為外科手術裝置時，將其植入到哺乳動物受試者的植入部位，起到功能修復、 增強或替代機體部分或組織結構的作用。抗微生物劑通過阻止細菌在構建體上附著和增 殖，控制或降低傷口中或植入部位的細菌活性。本發明的抗菌構建體具有生物相容性是指該構建體不具有細胞毒性，不會引起皮膚脫敏以及不會引起原發性皮膚炎症。本發明的假體也是「可生物重塑的」，是指發生可控制的生物降解，同時伴隨 宿主或患者的細胞提供內源性的新基質來重塑和替代，以產生新組織。因此，當在本發 明的假體中摻入抗微生物劑並用作替代組織時，具有多種性能。第一，作為機體部分的 替代品或者傷口的覆蓋物。第二，當作為機體部分的替代品時，起到作為宿主細胞向內 生長的重塑模板的作用。第三，提供針對處理部位的局部抗微生物活性。本發明的假體材料是加工的、源於哺乳動物膠原組織的純化的膠原組織基質， 可將其自身或與經過其他加工的、純化組織基質粘合在一起，並使其具有抗微生物性 能，形成可用於移植或植入到需要處理的受試者機體的某個部位上的假體本發明包括用加工的組織材料製備組織工程化假體的方法，該方法無需用粘合 劑、縫合線或者釘子來將各層粘合在一起，而且能夠保持該假體的生物重塑性。術語
「加工的組織基質」和「加工的組織材料」是指從動物，尤其是哺乳動物中獲得的天然 正常細胞組織，以機械方式清除掉附隨組織，並且以化學方式清除掉細胞、細胞碎片， 基本上不含有非膠原的細胞外基質成分。加工的組織基質基本上不含有並純化除去了非 膠原成分，保留了其天然的基質結構、組織、強度和形狀。用於製備本發明的生物工程 化的移植物的加工的組織材料成分來源於包含膠原的動物組織，這種膠原組織的來源包 括但是不限於腸道、真皮、筋膜、包心膜、硬腦膜、胎盤和其他包含膠原組織基質的 平面的或成面的構造組織。這些組織的結構和幾何學特點使得它們能夠容易地被清潔、 操作和裝配，用於製備本發明的生物工程化的移植物。根據本發明，技術人員能夠在其 他動物來源中確定、獲得和處理具有類似平面結構、幾何學特點和基質組成的其他合適 組織來源。用於製備本發明的生物工程化的移植物的一種這種加工的組織基質成分是源於 小腸黏膜下層的腸道膠原層。小腸的合適來源是哺乳動物生物體，如人、奶牛、豬、綿 羊、狗山羊或者馬，而豬的小腸是容易獲得的來源。本發明的假體是採用經加工的腸道膠原層(有時稱作為「腸道膠原層」或 "ICL")來製備的，該腸道膠原層是經加工的、源於豬小腸黏膜下層的組織材料。在獲
取這種腸道膠原層的一種方法中，從哺乳動物中收集小腸，粗略地將附屬的腸繫膜組織 從小腸上分離。例如在與香腸包裝機中的那些輥子類似的對向輥子之間，通過以機械方 式擠壓未被加工的腸道材料，除去肌層(被膜肌肉)和黏膜(被膜黏膜)。由於小腸的被 膜黏膜下層比周圍組織更硬，輥子將較為柔軟的成分從黏膜下層中擠壓掉，得到以機械 方式清潔的組織基質。在後面的實施例中，用刮腸機對豬小腸進行機械清潔，然後在一 系列溶液中進行化學清潔，得到經加工的組織基質。這種經過機械清潔和化學清潔的源 於小腸黏膜下層的腸道膠原層在此被稱作為「ICL」，是用於製備本發明的抗菌構建體的 一類經加工的組織基質或材料。從組成上看，經加工的ICL組織材料是非細胞的I型端肽膠原，約為93%乾燥重 量，具有少於約5%乾燥重量的糖蛋白、粘多糖、蛋白多糖、脂質、非膠原蛋白和核酸如 DNA和RNA，基本上不含有細胞和細胞碎片。經加工的ICL組織材料大量保留了其基 質結構和強度。重要的是，經過清潔操作，部分保留了該組織基質的生物相容性和生物 重塑性，不含有對膠原的生物重塑性起副作用的清潔劑殘留。因此，如同該組織在清潔操作中未被酶處理一樣，膠原分子保留了其端肽區。為了獲得經加工的組織基質，確定了適當的動物和組織來源。對組織進行機械 處理和化學處理，除去附屬組織和非膠原成分，得到加工的組織基質。作為一個例子， ICL是用於生產本發明的生物工程化的移植物假體的一類經加工的組織基質。遵照下文 描述的方法來處理組織，生成經加工的組織基質，用於製作包含ICL和抗微生物劑的生 物工程化的移植物假體。為了獲得豬ICL，用豬小腸黏膜下層作為本發明的生物工程化移植物假體的起始 材料。收集豬小腸，除去附屬組織，然後用刮腸機進行機械清潔，結合機械作用和用水 洗滌，從被膜黏膜下層上強行地除去脂肪、肌肉和黏膜層。機械作用被描述成是當完整 的腸子在一系列輥子之間通過時，從被膜黏膜下層上擠壓並去掉相繼的各層。小腸黏膜 下層比周圍組織硬，輥子從黏膜下層上將較軟的成分擠壓掉。技術人員能夠確定本領域 中的其他機械清潔手段，包括其他物理操作，例如刮擦、擠壓、壓縮和摩擦。進行機械 清潔，使得僅保留腸道的黏膜下層，形成一種經機械清潔的腸道。在機械清潔後進行化學清潔處理，優選在室溫下的無菌環境中進行，從經機械 清潔的腸道上除去細胞和基質成分。從腸道內腔的縱向切開經機械清潔的腸道，然後切 成長度約15cm到50cm的切片。稱重後，將材料放到容器中，溶液與腸道材料的比例 為100 1 ν/ν。在最優選的化學清潔處理中，如Abraham的美國專利US5,993,844和 US6,599,690中公開的方法，這些文獻的公開內容在此被引入，在鹼性條件下，如加入氫 氧化鈉(NaOH)，將膠原組織與有效量的螯合劑，例如乙二胺四乙酸鈉(EDTA)接觸；接 著與有效量的含鹽的酸，例如含氯化鈉的鹽酸(HCl)接觸；隨後與有效量的緩衝液，如 IM氯化鈉(NaCl)/IOmM磷酸緩衝生理鹽水(PBS)接觸；最後用水進行洗滌。每個處 理步驟優選使用旋轉的或搖動的平臺，以提高化學溶液和洗滌溶液的作用。經過清潔， 獲得經加工的腸道膠原層，或經機械和化學清潔加工的、源於小腸黏膜下層的組織基質 ICL0在洗滌後，從清潔容器中取出ICL，輕輕擠壓或擦拭，除去多餘的水分。此時， 在被製備成假體之前，將ICL在-80°C下冷凍保存，在4°C的無菌磷酸溶液中保存，或者 進行乾燥。如果進行乾燥保存，將ICL薄片在一個平面上壓平，如放在平板，優選多孔 的平板上或膜，如聚碳酸酯膜上，用解剖刀除去材料內腔反面的任何淋巴附屬物，在室 溫和溼潤的條件下，在層流淨化罩中乾燥ICL薄片。ICL是一種平面的薄片結構，可用作為單層材料，或者被製作成作為假體的各種 類型的構建體，假體形狀最終取決於其特定用途。為了形成本發明的多層假體，用一種 方法將ICL進行層壓處理，使得在保留加工的基質材料的生物相容性和生物重塑性的同 時，還保留其作為一種替代組織的強度和結構特徵。加工的、源於組織的組織基質保持 了天然組織基質的結構完整性，也就是說，起始材料的膠原基質結構仍然基本上是完整 的，並保持其物理性能，使得在植入時它具有許多固有的和功能的特點。在製備多層的 ICL層壓製品時，將ICL薄片疊加以與其他薄片接觸。無論是各層直接相互疊加在一起， 還是部分接觸或重疊來形成更為複雜的結構，接觸的部分是粘合的區域，各層在此相互 接觸。在作為機體部分的替代品的臨床應用中，包括植入過程中和最初的康復階段，完 整構建體中的粘合區域應能夠經受得起縫合和拉伸。在患者細胞定居並接著生物重塑假 體來形成新組織之前，粘合區域還應該保持足夠的強度。
加工的組織基質用作單層假體，或者被製備成平面的、管狀的或複雜形狀的多 層粘合假體。當本發明的假體包含雙層或多層的經加工的組織基質時，將各層用化學交 聯劑交聯來使其粘合在一起。當用化學交聯方法將多層加工的組織基質粘合在一起時， 可以改變化學交聯程度，調整假體上的生物重塑速度，該速度是假體被重吸收並被宿主 細胞和組織替代的速度。換句話說，在本發明假體中的交聯程度越高，該假體被生物重 塑的速度越慢；相反，交聯程度越低，生物重塑的速度越快。外科手術指標規定假體的 生物重塑的範圍和/或速度。例如，當用單層構建體作為創傷敷料時，該假體可以是經 過化學交聯或未經過化學交聯的。例如，作為外科手術修復補片或網膜，假體是交聯程 度低的多層構建體，使得該假體將較快地被生物重塑。例如，作為支持超級易動膀胱以 防止小便失禁的膀胱吊索，該假體是高度交聯的多層構建體，使得該構建體不被很快地 生物重塑，也就是說，該假體基本上保持同樣的構造，使得其被植入的時間更長。當呈現片狀時，膠原基質或構建體通常具有兩個相反的大面積表面。為了用 抗微生物劑處理加工的膠原基質，應用抗微生物劑時，將抗微生物劑與加工的膠原基質 的兩面接觸，或結合到兩面上。可替代地，利用加工的膠原基質的纖維狀和吸收性能， 將抗微生物劑應用到經加工的膠原材料的內部，應用到經加工的纖維狀組織基質的空隙 中，例如將膠原基質浸沒到含有抗微生物劑的溶液中，溶液通過吸收滲透到基質中。將 抗微生物劑呈遞到多層構建體內部的另一種方法為處理單層的經加工的組織基質，然後 將各層疊加並粘合在一起。對於多層構造而言，這些方法包括以任何順序實施用抗微 生物劑處理基質薄片，將基質薄片疊加形成多層並用交聯劑交聯該構建體的製備步驟包 括如下步驟用抗微生物劑處理基質薄片，將基質薄片疊加形成多層，然後用交聯劑進 行交聯；用抗微生物劑處理基質薄片，用交聯劑進行交聯，然後將基質薄片疊加形成多 層；用交聯劑進行交聯，用抗微生物劑處理基質薄片，然後將基質薄片疊加形成多層； 用交聯劑進行交聯，將基質薄片疊加形成多層，然後用抗微生物劑處理基質薄片；將基 質薄片疊加形成多層，用交聯劑進行交聯，然後用抗微生物劑處理基質薄片；或者將基 質薄片疊加形成多層，用抗微生物劑處理基質薄片，然後用交聯劑進行交聯。在有些情 形下，在包被抗微生物劑之後對基質進行交聯可能不實用，因為有些抗微生物劑會被交 聯劑洗掉。可以將未經處理和經處理的片層以不同排列疊加在一起，得到局部含有抗微生 物劑的假體。用於製備這種多層構造的方法包括將經抗微生物劑處理的組織基質片層和 未經處理的基質片疊加在一起，形成多層構建體，並將各層交聯。例如，至少疊加兩個 基質片層，交聯並進行抗菌處理，得到經處理的基質構建體，然後將一層或多層未經處 理的基質薄片疊加到經處理的基質構建體的上層表面或下層表面或者上下層表面上，接 著對該構建體進行交聯處理，得到組合的構建體。可替代地，至少疊加兩層未經處理的 基質薄片，交聯形成未經處理的基質構建體，然後將一個或多個經處理的基質薄片疊加 到未經處理的基質構建體的上表面或下表面或者上、下表面上，接著對該構建體進行交 聯處理，得到組合的基質構建體。在另一個實施例中，交替疊加經處理的和未經處理的 基質薄片，然後交聯形成組合的構建體。在另一個實施例中，交替地或以其他順序疊加 用兩種不同的抗微生物劑處理的基質薄片，生成一種組合的構建體。在另一個實施例 中，利用ICL材料的面，可以設定經處理的和未經處理的薄片之間的方向，或者薄片在組合的基質構建體中朝向經處理的或未經處理的基質構建體的方向。為了僅處理假體中所選擇的部分或區域，通過遮蓋不處理的表面部分，從而阻 止抗微生物劑與材料接觸，而表面的其他區域可以被處理，從而使得材料的部分表面可 以被抗微生物劑處理。將抗微生物劑定位於膠原基質上的另一種方法為將膠原材料部分 浸沒在溶液槽或溶液池中，使得膠原基質僅部分與抗微生物劑接觸，而其他部分未進行 抗菌處理。將抗微生物劑定位於膠原基質上的還有一種方法是將抗微生物劑噴灑或推進 到材料的一個表面上，而不對反面進行處理。將單層和多層的構建體用抗微生物劑處理，使該構建體具有抗微生物性能。將 整個或者部分構建體與抗微生物劑接觸，將至少一種抗微生物劑應用於到本發明的構建 體上。優選的抗微生物劑包括銀基抗微生物劑和基於化學品的抗微生物劑。組合物中還 含有抗生素。可以用組合試劑來處理膠原材料，提供廣譜的抗微生物活性，例如，銀基 抗微生物劑和基於化學品的抗微生物劑；基於化學品的抗微生物劑和抗生素；銀基抗微 生物劑和抗生素；或者三種試劑的組合。可以選擇銀基抗微生物劑，以賦予包含經加工的組織基質的假體以抗微生物性 能。通過幾種形式將銀應用於膠原構建體中。銀基抗微生物劑包括銀或含銀化合物，這 些化合物具有抗微生物活性，並且與膠原構建體和患者相容。純銀也被稱作為元素銀或 貴金屬銀，相對無活性，在常溫下不與水或者氧氣發生反應，而且不溶於弱酸和弱鹼。也可以使用銀離子。一般認為，離子形式的銀尚且不能產生抗微生物性能，其 抗微生物的可能性小於其他抗微生物劑。雖然不期望受任何理論的約束，離子形式的銀 通過直接影響細胞和細胞壁的呼吸和運輸以及繁殖，來有效地抵抗細菌、酵母和真菌以 及細胞外的病毒。還可以使用其他形式的銀，包括但是不限於氧化銀；硝酸銀；磺 胺嘧啶銀(silver sulfazidine)(磺胺嘧啶銀⑴包含一種不溶的聚合物化合物，其作為抗微 生物劑和抗真菌劑時緩慢地釋放銀離子，可局部用於處理嚴重的燒傷，防止細菌感染)； 咪唑銀；磷酸鉀銀(arglaes) (AgKaP04)；膠態微粒銀；晶體銀，例如銀納米晶體，也被 稱作為「納米晶體銀」，這是給傷口或植入物部位遞送並持續釋放銀陽離子及其自由基 的另一種方法。按照數種不同的方法製備納米晶體銀(「納米銀」)組合物。一種方法為脈衝 等離子體方法，產生具有規則的晶格結構的納米晶體，該晶格結構缺乏原子雜亂但是具 有高保真度的均勻分布和形態學。脈衝等離子體方法利用兩個導電的加料棒。將這兩個 棒插入到充滿大氣壓力下的受控氣體的反應室中，氣體最可能是惰性氣體如氬。將棒與 高壓、脈衝放電電源連接。通過加料棒從脈衝電源快速釋放電壓，來合成納米材料。高 壓放電使得原材料變成高溫、高壓的金屬等離子體。由於利用了獨特的氣體動力學，等 離子體迅速擴張到周圍氣體中，產生均勻的納米顆粒氣相懸浮液。用封閉的環狀系統連 續收集生成的納米顆粒。根據操作的參數，該方法製備的納米晶體銀顆粒的直徑為lOnm 到lOOnm。通常選擇在15nm到40nm之間，或者在20nm到25nm之間的顆粒用於本發 明中。製備納米銀組合物的其他方法包括Burrell的美國專利US6,719,987中描述的那些 方法。這些方法產生具有特徵在於的原子雜亂的晶格的晶體。在Burrell的方法中，在 氣相中生成將要被沉澱的材料，例如通過蒸發或濺射生成，並將其輸送到一個溫度受控制的大空間中。材料的原子與工作氣體環境中的原子碰撞，損失能量並迅速地從汽相冷 凝到冰冷的底物上，例如液氮冷卻的指狀物上。通過限制擴散的條件產生原子雜亂，使 得在材料中保留了足夠的原子雜亂。在-io°c到100°C的低底物溫度下；使用高於標準 值的工作氣壓；小於約30度的入射角；較高的產生高於正常原子流量的沉澱速度來沉澱 銀。通過所謂」摻雜」的方法或者通過在反應室中摻入反應氣體(即氧氣)，在金屬基 質中存在不同原子或分子來達到原子雜亂的目的。按照該方法，氧氣是工藝氣體中的組 成部分。可以將基於化學品的抗微生物劑應用於膠原構建體中，以使構建體具備抗微生 物性能。不作為窮舉，基於化學品的抗微生物劑可選自如下聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽 (PHMB)；葡萄糖酸氯己定；二氨基聚雙胍，如US6,316,669中描述的那些，該文獻的 公開內容在此被引入；蜂蜜；苯扎氯銨；三氯生(2，4，4'-三氯-2'-羥基二苯基 醚)；以及甲矽烷基季銨鹽(十八碳烷基二甲基三甲氧基甲矽烷基丙基氯化銨)。除了抗微生物劑外，膠原構建體還包含一種抗生素。抗生素是由一種由微生物 產生的物質，其殺死其他微生物或抑制其他微生物的生長。通常，抗生素是低分子量的 (非蛋白質)分子，作為次級代謝產物產生的，主要由土壤中的微生物產生。大部分的 這種微生物形成某類孢子或其他潛伏細胞，一般認為在抗生素的生成與孢子形成之間存 在某些聯繫。其中，最有名的抗生素生產者是青黴菌屬和頭孢菌屬，它們是包括青黴素 和相關化合物在內的日內醯胺類抗生素的主要來源。在細菌中，放射菌屬，特別是鏈黴 菌，產生多種類型的抗生素，包括氨基糖苷，如鏈黴素，大環內酯物，如紅黴素和四環 素。形成內生孢子的桿菌生產多肽類抗生素，例如多粘菌素和桿菌肽。對於一定範圍內 的微生物來說，抗生素具有殺滅作用，即「殺死」作用，或者具有靜止作用，是指一種 「抑制」作用。抗生素的作用範圍是指受其影響的細菌或其他微生物的範圍。抗生素有
效抵抗原核生物，殺死或者抑制大範圍的革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌，被稱作為「廣 譜」；那些主要抵抗革蘭氏陽性細菌或革蘭氏陰性細菌的被稱作為「窄譜」；而那些有 效抵抗單一生物體或疾病的是「限譜」。優選使用的抗生素化合物是廣譜抗生素。將抗 生素化合物以組合方式提供給膠原構建體，例如以窄譜的革蘭氏陽性化合物與窄譜的革 蘭氏陰性化合物的組合形式；但是，廣譜、窄譜和限譜的抗生素的任何組合都是可被使 用的。用於本發明中的抗生素包括內醯胺(青黴素和頭孢菌素)，例如青黴素 G，頭孢菌素；半合成的青黴素(還包括克拉維酸(clavulanicacid))，例如氨苄青黴素、 羥氨苄青黴素以及甲氧苯青黴素；單環內醯胺(monobactam)，例如氨曲南(aztreonam)； 羧基青黴烯(carboxypenem)，例如亞胺培南(imipenem)；氨基糖苷，例如鏈黴素；慶 大黴素；糖肽，例如萬古黴素；林肯黴素，例如氯潔黴素；大環內酯，例如紅黴素；多 肽，例如多粘菌素；桿菌肽；多烯，例如兩性黴素；制黴菌素；利福黴素，例如利福 平；四環素，例如四環素；半合成的四環素，例如強力黴素；和氯黴素。經加工的組織基質單獨作為一個單層被用於單層假體中，或者用於製作具有雙 層或多層的假體。如果用作單層，將抗微生物劑與經加工的組織基質接觸，使基質具有 抗微生物性能。在與抗微生物劑接觸之前或之後，將經加工的組織基質交聯，控制該材 料的生物重塑和生物降解的速度。換句話說，單層的抗微生物構建體為單層並用抗微生物劑處理過；用交聯劑交聯的單層，然後用抗微生物劑處理；用抗微生物劑處理單 層，然後用交聯劑交聯。使用ICL製備包含雙層或多層經加工的組織基質的多層假體的方法已經被公 開。本發明的一個具體實施方案涉及扁平的片狀假體以及製備和使用該片狀假體的 方法，該假體由雙層或多層粘合併交聯在一起的ICL組成，作為能夠被患者的細胞生物 重塑的可移植生物材料。鑑於ICL的扁平的片狀結構，該假體容易被製作來包含任意層 數，優選2 10層，更預選2 6層，層數取決於該構建體的最終特定用途所需的強度 和大小。ICL具有沿著大體相同方向排列的結構基質纖維。進行層疊時，可以改變各層 方向以調節經加工的組織片層中的總體組織纖維方向。將薄片層疊，使得它們的纖維相 互平行或者以不同的角度定向。也可以將片疊加來形成一種構建體，其具有跨越該假體 區域的連續的數層。可替代地，由於疊加排列的最終尺寸受到腸道圓周的限制，可以將 各層以拼貼的方式交叉排列而得到一種片狀構建體，其表面積大於原始材料尺寸，但是 跨越假體區域沒有連續的層。可以引入複雜的結構特徵，例如在片層之間穿過或者橫越 片層的管道或通道，形成管道結構或網絡結構。在包括ICL的多層構建體的製作中，當以滅菌的ICL材料開始時，優選採用無
菌環境和消毒工具來保證構建體的無菌性。為了製備多層的ICL構建體，將第一個無菌 的剛性支持部件，如剛性聚碳酸酯薄片放置在層流室的無菌場中。如果經過機械和化學 的清潔處理，ICL薄片仍處於未水合狀態，可在水溶液中，例如在水或者磷酸緩衝生理鹽 水中對它們進行水合處理。用無菌吸水布擦拭ICL薄片，從該材料上吸掉多餘水分。如 果還不行，對ICL材料進行修整，從內腔反面的漿膜表面上除去任何的淋巴附屬物。將 第一個經修整的ICL薄片放置在聚碳酸酯薄片上，用手捋平聚碳酸酯薄片以除去任何氣 泡、摺疊和皺褶。將第二個經修整的ICL薄片放置在第一個薄片上，再用手捋平聚碳酸 酯薄片以除去任何氣泡、摺疊和皺褶。重複操作直到獲得用於特定用途的期望層數，優 選2 10層。天然的管狀ICL具有面的特徵在天然狀態下朝向腸道內腔的內黏膜表面以及 朝向腔外的相反的外漿膜表面。已知這些表面影響假體的手術後性能的特徵，但是可以 進行調整來提高裝置的性能。目前由於使用合成裝置，產生附著，使得有必要再進行操 作來從周圍組織中除去該附著物。在具有雙層TCL的心包補片或者疝氣修復假體的製備 過程中，優選這兩個層的粘合區域處於漿膜表面之間，這是由於黏膜表面已被證明能夠 在植入後防止手術後的附著產生。在其他具體實施方案中，優選ICL補片假體的一個表 面是無粘著力的、非附著性的，而其他表面具有粘附到宿主組織上的親合力。在這種情 形下，假體具有一個黏膜表面和其他漿膜表面。在還有另一個具體實施方案中，優選相 反表面能夠產生附著力，使與之任意側面接觸的組織長在一起，因此，該假體在構建體 的兩側具有漿膜表面。如果構建體是由雙層以上的薄片組成的，植入時僅兩個外層薄片 可能與其他機體結構接觸，內層可能對手術後的附著形成並不起作用，則內層的方向較 不重要。在疊加完期望數量的ICL薄片後，通過將薄片一同脫水，在連接區域將它們粘 合，也就是說，在薄片接觸之處粘合。儘管不期望受任何理論的約束，但是脫水時水分
12從ICL基質的纖維之間被除去，引起ICL層的膠原纖維聚集在一起。可能對第一個支持部 件的裸露面進行脫水，或者在第一個支持部件和第二個支持部件之間進行脫水，例如， 在進行乾燥處理之前，將第二個聚碳酸酯薄片放置在最上層的ICL上，施加少量壓力或 不施加壓力，固定在第一個支持部件上，使所有層以扁平的平面排列在一起。為了便於 脫水，支持部件是多孔的，以便氣體和水分通過，到達脫水層。在空氣中、真空中或者 通過化學手段，對片層進行乾燥處理，化學手段如使用丙酮或醇例如乙醇或異丙醇。脫 水到室內溼度，在約10%相對溼度到約20%相對溼度之間，或更低；或者約10%到約 20%w/w的溼度，或更低。脫水是容易實施的，通過改變固定聚碳酸酯薄片的框架的角 度，直到ICL片層朝向源於層流室的氣流，在約20°C的室溫下和室內溼度下處理至少約1 小時到24小時。儘管不是必需的，但是在一種實施方案中，在交聯之前對要脫水的片層進行脫 水。將要脫水的ICL片層從多孔支持物上一同剝離下來，在水溶性再水合試劑中再水 合，優選在水中再水合，將它們轉移到含有水溶性再水合試劑中，在約4°C到約20°C的 溫度下放置至少約10到約15分鐘，對這些片層進行再水合處理，而無需將它們分離或分層。然後將疊加的ICL與交聯劑接觸，在粘合區域將被脫水的粘合片層或者被脫水 和再水合的粘合片層交聯在一起，優選使用化學交聯劑交聯，以保護ICL材料的生物重 塑性。如上提及，脫水使得鄰近的ICL層的基質中的膠原纖維聚集在一起，將那些片 層交聯在一起，在粘合片層的成分之間形成化學鍵。對粘合假體裝置進行交聯還為該裝 置提供了強度和持久性，以改進其操作性能。各種類型的交聯劑在本領域中是已知的， 並且可以被使用，例如核糖和其他糖、氧化劑和脫水加熱(DHT)方法。優選的交聯劑 是1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)。在另一種優選方法中， 如Staros，J.V., Biochem.21, 3950-3955，1982中所述，將磺基_N_羥基琥珀醯亞胺加 入EDC交聯劑中。除了化學交聯劑之外，還可以使用基於纖維蛋白的膠水或者醫藥級 的粘合劑如聚氨酯、乙酸乙烯酯或聚環氧基，將片層粘合在一起。在最優選的方法中， 將EDC溶解在水中，濃度優選在約O.lmM到約100mM之間，更優選在約l.OmM到約 10mM之間，最優選為約l.OmM。除了水，磷酸緩衝生理鹽水或者2_[N_嗎啉代]乙磺 酸(MES)緩衝液也可以被用於溶解EDC。可以將其他試劑，例如丙酮或醇添加到溶液 中，在水中至多為99%，典型地為50%，使得交聯更為一致和有效。這些試劑從層中除 去水分，使基質纖維聚集在一起，促進這些纖維之間的交聯。在交聯劑中，這些試劑與 水的比例可用於調控交聯。由於隨著時間推移，EDC會失去活性，因此EDC交聯溶液是 在使用前被立即配製的。為了將交聯劑與ICL接觸，將被脫水的、粘合的ICL層轉移到 容器如淺的盤子中，將交聯劑輕輕倒到盤子中，確保ICL片層被覆蓋並且不漂浮，在ICL 構建體的片層下或中間沒有氣泡。將容器覆蓋，在約4°C到約20°C的溫度下，ICL片層 被交聯約4到約24小時，更優選8到約16小時。通過溫度調控交聯，在較低溫度下， 反應緩慢，因而交聯更為有效；在較高溫度下，EDC更不穩定，交聯效率較低。在交聯後，倒出交聯劑並除去，將構建體與洗滌劑接觸，在盤子中進行衝洗來 除去交聯劑。優選的洗滌劑是水或者其他水溶液。優選地，將化學粘合的構建體用等體 積的無菌水衝洗三次，每次約5分鐘，進行充分衝洗。如本文所述，將構建體與抗微生物劑接觸，可以通過分別接觸或處理各個經加工的組織基質，或者通過接觸或處理多層 的中間構建體，來賦予該構建體以抗微生物性能。用抗微生物劑處理單層或者多層的加 工的組織基質的方法將隨著所用的抗微生物劑類型而改變，但是應當能夠保持經加工的 組織基質的可生物重塑性、生物力學性能和生物相容性。當選擇納米晶體銀作為抗微生物劑時，通過使膠原基質材料與納米晶體銀接 觸，將納米晶體應用於膠原基質材料中，通過將試劑懸浮在溶液中通過塗覆它，通過塗 覆加工的基質材料來應用抗微生物劑。將納米晶體銀分散在水、水溶液或者一種溶劑中 而形成分散的納米晶體銀的溶液。將ICL浸沒在裝有一定體積納米晶體銀溶液的盤子 中，使得當ICL浸沒在其中時，納米晶體銀粘附到ICL上。在浸沒過程中，攪動或攪拌 該溶液。然後從溶液中取出ICL，並將其放置在允許水或溶劑從含有結合的銀的TCL中 蒸發而產生含有納米晶體銀塗層的ICL構建體的環境下。用於給ICL塗覆含有納米晶體 銀的分散體的其他方法包括噴灑並允許溶劑從ICL中蒸發。當選擇PHMB作為抗微生物劑時，將PHMB添加到溶液中，使用在水中的 0.09%-0.5% v/v,將經加工的組織基質浸沒在溶液中，使得PHMB溶液浸透該基質。在 足以使得溶液浸透經加工的組織基質的時間之後，從溶液中取出基質並進行乾燥，使得 當溶劑蒸發時，PHMB仍保留在基質上。在製作多層、粘合的移植物假體之前或之後，對經加工的組織基質和構建體進 行處理或修飾，包括物理的或者化學的處理或修飾。對經清潔的組織基質和構建體進 行物理修飾，例如定形、通過拉伸和鬆弛進行修整、或打孔、網狀化或穿孔。在進行打 孔、網狀化或穿孔時，調整降低材料的總體張力，以便更好地適合於創面床大小，或者 更適合分泌物的流通和排出，或者對上述兩者都有利。也可以進行化學修飾，如結合生 長因子、選擇的細胞外基質成分、遺傳材料以及其他試劑，這些將對被處理的、被修復 的或者被替換的機體部分的生物重塑和修復產生影響。本領域技術人員在考慮了構建體所需的性能特徵後，確定物理修飾組織基質和 本發明的構建體的方法。使用在膜面上按圖案排列有針頭、刀片或者釘栓的模具，以一 定穿孔形式提供該構建體，該穿孔與構建體的反面相通。將構建體放置在平臺上，下壓 模具使得針頭、刀片或釘栓壓入構建體中，抵達平臺，從而穿過構建體。在產生裂縫 或網格模式的方法中，使用與在自體皮膚移植操作中通常使用的那些類似的皮膚嚙合裝 置。一種裝置是齊默爾皮膚嚙合器。用受激準分子雷射器(例如在KrF或ArF的波長下) 對構建體進行雷射鑽孔，產生穿透整個假體的微米級的孔，有助於細胞向內生長。可以 在製備假體過程中的任何時候對構建體進行打孔、穿孔或雷射鑽孔，但是優選在淨化之 前進行，或者在最後消毒後進行。對於某些指標，優選該穿孔或雷射鑽孔穿過假體的所 有片層，有助於細胞通過或液體排出。對於某些指示，優選這些孔不穿過所有片層，使 得細胞能夠接近多層構建體的內部，或者有助於構建體形成新血管。對單層構建體進行的其他物理修飾是穿孔或打孔，它們連通構建體的兩側。對 單層構建體進行的另一種物理修飾是將該構建體網狀化，這給構建體提供了排列的類似 於網孔的裂縫模式。以一種模式產生裂縫，其網孔比例類似於皮膚嚙合器產生的比例， 例如由齊默爾產生的比例。網孔比例設定在1 1.5或2 1。為了製備抗微生物性能 的單層ICL構建體，將ICL的黏膜面鋪展到光滑的聚碳酸酯薄片上，確保除去皺褶、氣泡和可見的淋巴附屬物。將ICL鋪展在聚碳酸酯薄片上，使尺寸最優化。任選地，使材料 的整個表面充分乾燥。然後將至少一種抗微生物劑應用到該材料上。任選地，通過網狀 化或者穿孔，對材料進行物理修飾，然後將其切割成一定尺寸，包裝，最後按照無菌規 範進行滅菌。在可替代的具體實施方案中，在對材料進行網狀化、穿孔或打孔的物理修 飾後，對材料進行抗微生物的處理。製備經加工的組織基質，並用抗微生物劑包被，再將構建體修整為期望的尺 寸。作為例證，可用的尺寸為約6平方英寸(約15.2cmX15.2cm)，但是可以製備成任意 大小，用於移植給患者。然後將抗微生物的加工的膠原基質包裝在容器中，該容器可被密封，用於最終 滅菌、儲藏和分發。可以將抗微生物的加工的膠原基質以乾燥或溼潤的狀態包裝在容器 中。優選的包裝材料與抗微生物的處理以及膠原基質相容，如果以溼潤狀態包裝時，與 保持產品處於溼潤狀態的試劑相容。如果將構建體用光敏的抗微生物劑處理，例如銀基 抗微生物劑，可以使用防止光線透過或者使光線濾過的包裝材料來包裝產品，以防止抗 微生物活性下降和構建體變色。最後用醫學殺菌裝置領域知曉的手段對構建體進行滅菌。優選的滅菌方法為 按照US5,460,962，將構建體與用足量的10N氫氧化鈉(NaOH)中和的無菌0.1%過乙酸 (PA)接觸，該文獻的公開內容在此將被引入。在放置在搖動平臺上的容器中，例如在1L Nalge容器中進行淨化約18士2小時。然後將構建體與三倍體積的無菌水接觸三次來進行 洗滌，每次10分鐘。在更優選的方法中，使用25-37kGy的伽馬射線照射來對ICL構建 體進行滅菌。伽馬射線照射顯著地但不是有害地降低楊氏模量、極限抗張強度以及收縮 溫度。伽馬射線照射後的機械性能仍足以在應用範圍內使用，伽馬射線被廣泛用於可植 入醫療裝置領域，是一種優選手段。每次滅菌包括放射量測定指示劑，來證明該劑量在 特定範圍內。用包裝材料以及與構建體的組分相適應的設計來包裝構建體，並且確保在 存儲過程中的無菌狀態。優選的包裝手段是一種雙層的可剝離的包裝，其中基礎包裝是 熱封的硬質泡沫塑料襯墊包裝，其由乙二醇改進的聚對苯二甲酸乙二醇酯(PETG)盤子 組成，具有一個紙面的箔蓋，該箔蓋被封裝在由聚乙烯/對苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄 片組成的二級熱封袋中。將基礎包裝和二級包裝以及其中含有的ICL構建體一同用伽馬 射線滅菌。本發明的假體可以是扁平的、管狀的，或者具有複雜的幾何結構。加工成形的 假體的形狀可由其特定用途所決定。因此，當形成本發明假體的粘合片層時，可以對模 型或者板面支持部件進行改進以提供期望的形狀。植入扁平的多層假體，修復、補充或 者替代患病的或受損的器官，例如腹壁、心包膜、疝氣和各種其他器官和結構，包括但 是不限於骨骼、骨膜、軟骨膜椎間盤、關節軟骨、真皮、腸道、韌帶和腱。此外，扁平 的多層假體可用作血管或心臟內的補片，或者作為心瓣膜的替代品。單層或多層的扁平的薄片假體被用於覆蓋受試者的傷口，形成溼氣隔離物，使 傷口部位輕鬆舒適，並且在傷口部位穩定地開始癒合時提供抗微生物的活性。扁平的薄片也可被用作為器官支持物，例如，使用薄片作為器官的吊索用於支 持下垂或者超級易動的器官，如膀胱或子宮。可以使用管狀的假體，如用於替換管狀器 官的橫截面，如血管系統、食道、氣管、腸道和輸卵管。這些器官具有基本的管狀，包括外表面和內腔表面。此外，扁平的薄片和管狀結構還可以被成形在一起而形成複雜結 構，以替換或者補充心臟或血管的瓣膜。用於製作本發明的抗微生物的構建體的ICL材料是生物相容的。按照用於醫療 裝置的生物評價的Tripartite和ISO-10993指導，對用ICL製備成的假體進行生物相容性 測試。「生物相容性」是指假體是無細胞毒性的、血液相容的、無熱原的、不含內毒素 的、非遺傳毒性的、不產生抗原的，並且不會引發皮膚敏化反應，不會引發原發性皮膚 炎症反應，不會引起急性全身性毒性，並且不會引發亞慢性毒性。將在下文中對這些生 物相容性質作更為詳細的討論。當使用名為「細胞毒性的體外L929瓊脂覆蓋測試(L929 AgarOverlay Test for Cytotoxicity In Vitro)"的測試，對在測試產品中暴露期間的L929細胞進行觀察，結果表 明用ICL製備的構建體產品無生物活性(0級)或細胞毒性。陽性對照產品(3級)和陰 性對照產品(0級)的細胞反應驗證了該系統的有效性。按照USP指南進行檢測和評價。 本發明的假體被認為是無細胞毒性的，滿足細胞毒性的體外L929瓊脂覆蓋測試的要求。按照改進的ASTM提取方法，對本發明的假體進行血液相容性測試(體外溶血 反應，使用改進的ASTM提取方法進行體外測試)。按期望實施陽性和陰性對照，在研 究條件下，裝置提取物的平均溶血指數是0%。研究結果表明本發明的假體不會引起溶 血，是血液相容性的。按照目前用於熱原性檢測的USP操作，在兔子中對本發明的假體進行熱原性測 試。在研究條件下，兔子體溫在觀察期間的總升高是在可接受的USP界限內。結果證明 本發明的假體是無熱原性的。本發明的假體不含內毒素，優選地，含量動.06EU/ml(每 cm2的產品)。內毒素是特定的熱原，是革蘭性陰性細菌的細胞壁的一部分，由細菌脫落 並汙染材料。本發明的假體不引發皮膚敏化反應。還沒有文獻報導，用於清潔豬腸道膠原的 化學藥品會引發敏化反應，或者將改變膠原而引發這種反應。對由化學清潔的ICL形成 的本發明的假體進行敏化反應測試，結果指示該假體不會引發敏化反應。本發明的假體不會引發原發性皮膚刺激反應。對化學清潔的ICL進行刺激測 試，結果表明由化學清潔的ICL形成的本發明的假體不會引發皮膚刺激反應。對用於製備本發明的假體的化學清潔的TCL進行急性系統性毒性和皮內毒性測 試，其結果證明在所檢測的假體中沒有毒性。此外，在動物植入試驗中，沒有化學清潔 的豬腸道膠原會引起急性系統性毒性的證據。對含有豬腸道膠原的本發明的假體進行亞慢性毒性測試，證實沒有裝置的亞慢 性毒性。還沒有文獻報導，用於清潔豬腸道膠原的化學藥品將會影響引起遺傳毒性的可 能性，或者將改變膠原而引發這種反應。對含有豬腸道膠原的本發明的假體進行遺傳毒 性測試，證實沒有裝置的遺傳毒性。對用於製備本發明的假體的豬腸道膠原進行化學清潔處理的目的在於通過除去 細胞、細胞殘留物以及非膠原的和非彈性的蛋白基質成分，使抗原性最小化。通過採用 化學清潔的豬腸道膠原進行植入試驗證實，含有豬腸道膠原的本發明的假體沒有裝置的 抗原性。
本發明的ICL構建體優選是無病毒活性的。在加工過程中，對兩個化學清潔程 序NaOH/EDTA鹼性螯合溶液(pH 11-12)和HCL/NaCl酸性鹽溶液(pH 0_1)滅活四種 相關病毒和模型病毒的效率進行了測試。基於源豬材料選擇模型病毒，並且用來代表廣 泛的物理化學特性(DNA病毒、RNA病毒、包膜病毒和非包膜病毒)。病毒包括狂犬病 病毒、牛病毒性腹瀉病毒、呼吸道腸道病毒_3和豬細小病毒。根據FDA和ICH指導性 文件進行試驗，包括CBER/FDA "Points to Consider in theCharacterization of Cell Lines Used to Produce Biologicals (1993) 」 ； ICH "Note for Guidance on Quality of Biotechnological Products Viral SafetyEvaluation of Biotechnology Products Derived from Cell Lines of Humanor Animal Origin」 (CPMP/1CH/295/95)； 以及 CPMP BiotechnologyWorking Party 「Note for Guidance on Virus Validation Studies TheDesign, Contribution and Interpretation of Studies Validating thelnactivation and Removal of Viruses」 (CPMP/ BWP/268/95)。試驗結果證明，對於所有四種標準病毒來說，這兩個化學清潔步驟的累 計滅活動病毒超過106。該數據表明化學清潔操作是強大而有效的過程，其保持滅活多種 病毒性物質的潛能。本發明的假體是可生物重塑的。可作為機體部分的替代品或支持物，本發明的 假體還可以作為宿主細胞向內生長的可生物重塑的基質骨架。「生物重塑」用於此是指 通過宿主細胞以約等於生物降解的速度向內生長而生成內源性結構膠原、血管形成和細 胞種群恢復，通過宿主細胞和酶使植入假體的基質成分進行重整和替換。移植物假體被 植入到受試者的所有或者基本上所有的宿主組織中，移植物假體保持其結構特徵，但是 被它們所植入的受試者重塑，並作為所修復或替換的組織的類似物。除了這些可生物重 塑的品質外，由雙層或多層經加工的組織基質製成的本發明的假體還被製備成包含期望 的生物力學特性。楊氏模量(MPa)被定義為壓力和張力之間的線性比例常數。極限抗張強度(N/ mm)是跨越假體的強度的測量值。這兩個特性是假體中的TCL的層數的函數。當用作 載重或支持裝置時，應當能夠滿足起始康復階段和整個重塑過程中的物理活動的嚴格要 求。通過切削測試，測定粘合區域的層壓強度。在外科手術植入後，重要的是在 物理壓力下不會立即分層。在動物試驗中，移植材料都沒有顯示任何的分層證據。對 於ImMEDC交聯的多層構建體來說，在植入前，兩個相對的層之間的粘著強度約為 8.1 士 2.1N/mm。收縮溫度(°C)是基質交聯程度的指示。收縮溫度越高，材料中的基質交聯程度 越高。未交聯的、經伽馬射線照射的ICL的收縮溫度約為60.5士 1.0°C。在優選的實施 方案中，對於分別在溶於50%丙酮中的ImMEDC 約100mM EDC中交聯的裝置來說， EDC交聯的假體優選具有的收縮溫度在約64.0士0.2°C到約72.5士 1.1°C之間。機械性能包括機械完整性，使得假體在生物重塑過程中防止蠕變，而且是易曲 折的和可縫合的。術語「易曲折的」是指好的操作特性，以在臨床中應用。術語「可縫合的」是指該層的機械性能，包括縫合保持力，使得當將假體縫合 到天然組織的部分上時，針和縫合材料能夠穿過假體材料。在縫合過程中，這種假體必 需不會由於因縫合而對它們施加的張力而被撕裂，在縫合線打結時它們也不會撕裂。假體的可縫合性，即假體在縫合時不會發生撕裂，它與假體材料的內在機械強度、移植物 的厚度、施加在縫合線上的張力、以及打死結的比例相關。在lOOmMEDC和50%丙酮 中高度交聯的扁平的六層假體的縫合保持力為約6.7士 1.6N。在溶於水中的ImMEDC中 交聯的雙層假體的縫合保持力為約3.7N士0.5N。由於外科醫生的縫合力為約1.8N，交聯 的扁平的雙層假體的優選較低的縫合保持力為約2N。術語「非蠕變的」用於此是指假體的生物力學特性賦予了耐久力，使得該假體 在植入後不發生超過正常限度的伸長、擴張、或者膨脹。如下文所述，植入的本發明的 假體的總伸長在可接受的限制內。宿主細胞以大於生物降解引起的植入材料降低其機械 強度的速度替換結構性膠原並重塑，本發明的假體需要能夠抵抗由植入後細胞生物重塑 所引起的伸長。儘管本發明的經加工的組織材料被疊加並粘合，但是它們是「半透性的」。半 透性使得宿主細胞向內生長，用於重塑或者沉積影響生物重塑性、細胞向內生長、防止 或促進附著或者血流的試劑和成分。假體的「無孔的」性質通過植入假體，防止將要 保留的液體流過。相反，假體應用時要求具有多孔或打孔性質，則在假體中形成孔、穿 孔、打孔、裂縫或者網孔。本發明的假體的機械完整性使得其能夠被覆蓋或摺疊，以及能夠被切割或修整 來獲得乾淨的邊緣，而無需將構建體的邊緣分層或破壞。源於小腸的被膜黏膜下層的經加工的腸道膠原薄片通常具有從約0.05mm到約 0.07_的厚度。如果所純化的組織基質具有片狀幾何結構，則將其疊加後化學粘合在一 起，提供厚度較大的多層構建體。本發明的多層粘合假體裝置的經加工的組織基質片層 源於相同的膠原材料，例如雙層或多層ICL，或者源於不同的膠原材料，例如單層或多層 ICL以及單層或多層闊筋膜。具有抗微生物性能的構建體被用於處理傷口，包括部分和完全厚度傷口、壓 迫性潰瘍、靜脈潰瘍、糖尿病潰瘍、慢性血管潰瘍、隧道傷口 /地雷傷口、外科手術傷 口(例如自體移植造成的供體部位傷口、Moh氏手術後傷口、雷射手術後傷口、傷口開 裂)、外傷傷口(例如擦傷、破口、二度燒傷、以及皮膚撕裂)以及流液型傷口。創傷敷 料是經機械和化學清潔的豬腸道膠原的單層薄片或多層構建體，包括至少一種抗微生物 劑，各個經加工的組織基質薄片的厚度為約0.05mm到約0.07mm，含有連通薄片兩側的 窗孔。該產品主要包含天然形式的I型豬膠原(約>95%)，少於約0.7%的脂質，而且 檢測不到粘多糖(約<0.6%)和DNA(約<0.1ng/iU)。豬腸道膠原基本上不含有細胞 和細胞殘留物。本發明的創傷敷料可以是交聯的或者未交聯的，如果是交聯的，則交聯 達到調控和控制生物降解、生物重塑或者宿主細胞替換敷料的程度。對創傷敷料進行物 理改變，使得液體能夠流過。創傷敷料提供溼潤的癒合環境，作為控制細菌汙染並使之 最小化的屏障，並通過覆蓋感覺神經末端來減輕患者的疼痛。抗微生物劑給傷口部位及 其周邊提供抵抗微生物汙染的有效保護。將創傷敷料應用到具有需要處理的傷口的患者。在應用前，採用標準的創傷敷 料技術對創面床進行清潔並除去疤痕組織。優選地，對傷口進行清潔，使得傷口邊緣含 有活組織。在應用本發明的敷料時，將其切割成創面床的外輪廓。如果傷口比單塊敷料 大，則使用多塊敷料，交迭地覆蓋住整個傷口。如果敷料處於乾燥狀態，則使用無菌生
18理鹽水或者其他等滲溶液使其發生再水合。敷料邊緣與完整組織接觸，然後捋平以確保 敷料與下方的創面床接觸。如果薄片下方集聚了過量的滲出物，則在薄片上剪切出小的 開口，讓滲出物排出。本發明的抗微生物的創傷敷料用作傷口與傳統的創傷敷料之間的界面，或者作 為第二種創傷敷料。可替代地，本發明的抗微生物的創傷敷料用作皮膚替代品，例如 自體移植物、同種異體移植物或經培養的皮膚構建體的覆蓋物。當用作覆蓋物時，創傷 敷料提供溼潤的傷口環境，使得源於皮膚替代品的細胞將在創面床增殖以更快地閉合傷在應用後，優選應用適當的非附著的第二敷料，以維持溼潤的傷口環境。根據 傷口位置、大小、深度和使用者的偏愛來確定最適宜的第二敷料。根據維持溼潤、清潔 的創面床的需要來更換第二敷料。敷料的更換頻率將根據所處理的傷口的類型、大小和 深度、產生的滲出物的體積以及所用敷料的類型而改變。在癒合發生時，在使用其他創 傷敷料的情形下，需要替換創傷敷料，直到實現完全癒合。本發明的其他實施方案涉及具有抗微生物性能的多層構建體。本發明的假體裝 置具有雙層或多層粘合在一起的膠原層。「粘合膠原層」用於此是指由雙層或多層相同 或不同膠原材料組成，這些片層經過一定方式處理，使得片層相互疊加在一起並且通過 自層壓和化學交聯充分地結合在一起。更特別地，假體裝置是外科手術網膜或者移植物，其被植入來加固軟組織，包 括但是不限於腹壁和胸壁缺陷、肌肉翻轉加固、直腸和陰道下垂、骨盆底重構、疝 氣、橋連筋膜缺損中的裂口、縫合線加固和重構操作。本發明的網膜或移植物包括五層 豬ICL薄片以及抗微生物劑，厚度為約0.20mm到約0.25mm。該產品主要由天然形式的 I型豬膠原(約> 95% )組成，脂質少於約0.7%，而且檢測不到粘多糖(約< 0.6% )和 DNA(約<0.1ng/iU)。豬腸道膠原基本上不含有細胞和細胞殘留物。該假體以無菌的 片狀形式被提供，大小在5X5cm到12X36cm的範圍內，以雙層的可剝離的形式包裝。 假體的變性溫度為約58士5°C;抗張強度超過15N;使用2-0編絲縫線時的縫合保持強度 超過2N;而最終的內毒素含量 95% )組成，脂質少於約0.7%，而且檢測不到粘多糖(約< 0.6% )和 DNA(約<0.1ng/iU)。豬腸道膠原基本上不含有細胞和細胞殘留物。假體的變性溫 度(DSC)超過約63°C ；抗張強度超過約15N ；使用2-0編絲縫線時的縫合保留強度超 過2N;而最終的內毒素含量95%)組成，脂質少於約0.7%，而且檢 測不到粘多糖(約< 0.6% )和DNA(約< O.lng/ u 1)。豬腸道膠原基本上不含有細胞和 細胞殘留物。假體的變性溫度(DSC)超過約63°C ；抗張強度超過約15N ；使用2-0編 絲縫線時的縫合保持強度超過2N ；而最終的內毒素含量< 0.06EU/ml (每cm2的產品)。 硬腦膜修復裝置是生物相容的和可生物重塑的，當植入到需要進行硬腦膜修復的患者中時，作為硬腦膜的替代品，隨著時間推移，它將被宿主細胞生物重塑，宿主細胞降解並 替代該裝置，使得新的宿主組織替代該裝置。例如，使用多層的ICL構建體來修復體壁結構。例如，該構建體可以被用作為 心包補片、膀胱壁補片、疝氣修復裝置(作為釋放壓力的補片或塞子)，或者用作吊索來 支持超級易動的或下垂的器官(脫肛，拱頂下垂、膀胱突出症)。多層構建體可用於處 理結締組織，例如軸轉肌(rotator cuff)或被膜修復中使用。多層構建體可用於硬腦膜修 復，修復顱骨切開術後的頭蓋缺陷或者用於修復沿著脊髓的神經管。當纖維環板層結構 破裂(即，椎間盤突出)時，該材料可用於修復纖維環板層，或者作為堵塞由椎間盤突出 造成的孔洞的塞子或者作為該孔洞的蓋子，或者同時作為塞子和蓋子。材料可用於整形 手術，例如乳房固定術，腹腔手術，以及面部整形手術(增高額頭和臉頰)。單層和多 層ICL材料可用作傷口覆蓋物或者敷料，輔助傷口修復。此外，該材料以扁平、捲曲或 者摺疊的方式被植入，用於組織填充和互補。在構建體中包括大量ICL片層，用於填充 或者強度指示。在植入前，進一步對片層進行處理，或者包裹上膠原或其他細胞外基質 成分、透明質酸、肝素、生長因子、肽或經培養的細胞。提供如下實施例來更好地闡述本發明的實施，無論如何不應將它們解釋為用來 限制本發明的保護範圍。可以預期，在組成、形狀和厚度方面對裝置進行的設計可以根 據構建體的最終指標來選擇。本領域技術人員將意識到，在不背離本發明的精神和保護 範圍的情形下，可以對在此描述的方法進行各種改進。實施例實施例1 對機械清潔的豬小腸講行化學清潔收集豬小腸，並使用Bitteriing刮腸器(Nottingham，UK)進行機械剝離，該設備
通過將機械作用與用水洗滌組合，從黏膜下層上強力除去脂肪、肌肉和黏膜片層。機械 作用被描述為當完整的腸子通過一系列的輥子時，該輥子擠壓並從黏膜下層上剝下相繼 的層。小腸的黏膜下層比周圍組織硬，輥子將較軟的成分從黏膜下層上擠壓掉。機械清 潔的結果使得僅保留腸子的黏膜下層。在無菌的室溫條件下實施剩下的操作，按照Abraham等人的PCT申請號WO 98/49969中描述的化學清潔，該文獻的公開內容在此被引入作為參考。所有化學溶液都 在室溫下使用。沿著腸道內腔的縱向方向切開腸子，然後切成15cm切片。對材料進行 稱重，並以溶液與腸道材料約100 lv/v的比例將其放置到容器中。往各個含有腸子的容器中加入約1L用0.22 y m(微米)濾器滅菌的100mM乙二 胺四乙酸鈉(EDTA)/10mM氫氧化鈉(NaOH)溶液。然後，將容器放在搖臺上，在約 200rpm下放置約18小時。搖晃後，從各容器中除去EDTA/NaOH溶液。然後，往各個容器中加入約1L用0.22iim(微米)濾器滅菌的1M鹽酸(HC1)/1M 氯化鈉(NaCl)溶液。然後，將容器放在搖臺上，在約200rpm下放置約6 8小時。搖 晃後，從各容器中除去HCl/NaCl溶液。然後，往各個容器中加入約1L用0.22iim濾器滅菌的1M氯化鈉(NaCl)/10mM 磷酸緩衝生理鹽水(PBS)。然後，將容器放在搖臺上，在約200rpm下放置約18小時。 搖晃後，從各容器中除去NaCl/PBS溶液。然後，往各個容器中加入約1L用0.22iim濾器滅菌的lOmMPBS。然後，將容器放在搖臺上，在約200rpm下放置約2小時。搖晃後，從各容器中除去磷酸緩衝的生理 鹽水。最後，往各個容器中加入約1L用0.22 ym濾器滅菌的水。然後，將容器放在搖 臺上，在約200rpm下放置約1小時。搖晃後，從各容器中除去水。將經加工的ICL樣本切割和固定，用於組織學分析。對對照和經處理的組織的 橫截面和縱切面樣本進行蘇木精-伊紅染色(H&E)以及Masson三色染色。經加工的ICL 組織樣本顯示不含有細胞和細胞碎片，而未經加工的對照樣本正常地並且如期望地存在 很多細胞。單層ICL材料可作為單層使用或者用於製備粘合的多層構建體、管狀的構建體 或者具有管狀的和扁平的幾何學特徵的複雜構建體。實施例2 製作多層ICL構津體的方法將按照實施例1的方法處理的ICL用於製備具有雙層ICL的多層構建體。將 無菌的多孔聚碳酸酯薄片(孔徑大小，生產商)放置在層流室的無菌場中。用無菌 TEXWIPES (LYM-TECH Scientific，Chicopee，MA)擦拭 ICL，從該材料上吸掉多餘
水分。從ICL材料的內腔反面除去淋巴附屬物，然後剪切成長約6英寸的切片(約 15.2cm)。將第一個經修理的ICL薄片放置在聚碳酸酯薄片上，黏膜面朝下，手工除去任 何氣泡、摺疊和皺褶。將第二個經修理的ICL薄片放置在上面，朝向第一個薄片的內腔 反面，使第二個薄片的內腔反面接觸第一個薄片的內腔反面，再手工除去氣泡、摺疊和 皺褶。將具有ICL片層的聚碳酸酯薄片以一定角度豎起，使得ICL層面對從層流室吹來 的氣流。在約20°C的室溫下，將層在腔室中乾燥約18士2小時。將乾燥的ICL層一同 從聚碳酸酯薄片上剝離下來，而不使它們分開或分層，轉移到在室溫下的水浴中，使層 水合約15分鐘。由於EDC隨著時間推移會失去活性，在交聯之前立即製備100mMEDC/50%丙 酮的化學交聯溶液。將經水合的層轉移到淺盤中，輕輕地將交聯劑倒入盤中，確保層被 覆蓋並且不漂浮，使得在構建體下方或中間沒有氣泡。將盤子蓋上，並在通風櫥中放置 約18士2小時。倒出交聯溶液並棄去。在盤中用無菌水衝洗構建體三次，每次衝洗約5 分鐘。用解剖刀和尺子，將構建體修理成期望的尺寸。按照US5,460,962，將構建體用經氫氧化鈉ION NaOH中和的無菌0.1 %過乙酸 (PA)處理而淨化，該文獻的公開內容在此被引入。將構建體放置在lLNalge容器中，在 搖臺上淨化約18士2小時。將構建體用三倍體積的無菌水洗滌10分鐘，用Minncare條 帶試驗監控PA活性，確保從構建體中除去它。然後，用真空封口機將構建體包裝在塑膠袋中，接著放在密封袋中，進行 25.0 35.0kGy伽馬射線照射。實施例3:抑菌試驗本實施例的目的在於闡述如何檢測加入到單層構建體中的抗微生物物質的有效 量，該有效量提供微生物屏障以及微生物殺滅劑。單層構建體是從由按照實施例1中公 開的方法製備的源於豬腸道黏膜下層(ICL)的經加工的組織材料製備得到的。數種抗微 生物物質被應用於ICL，將它們溶解或懸浮在如下溶液中1.0.5%硝酸銀溶液
2.1%硝酸銀溶液3.溶於異丙醇(IPA)中的1-2%納米晶體銀溶液4.溶於1XPBS中的1-2%納米晶體銀溶液5.溶於磷酸緩衝生理鹽水溶液中的1-2%聚六亞甲基雙胍(PHMB)6.溶於純淨水中的1-2%聚六亞甲基雙胍(PHMB)將化學清潔的ICL切割成4cmX 6cm的切片，將水合的或脫水的各個切片放置到 約100mL的各種溶液中過夜。從各溶液中取出經加工的ICL並乾燥。將未經加工的ICL 樣本用作對照。從各個樣本切片中剪切出圓形切片。用細菌在瓊脂平板上劃線。將樣 本放置在平板上，並培育24小時來觀察。在IPA中製備的納米晶體銀(N.S.)溶液完全分散並停留在溶液中，但是在 1XPBS中的N.S.不停留在溶液中並且在將該溶液添加到ICL之前需要搖晃。將TPA蒸 發過夜，並且TPA十分均勻地分布在水合和脫水的ICL薄片上，脫水的薄片保持較為固 定的形狀，並且更容易處置。兩種薄片都變為碳黑色。ICL朝向盤子的側面似乎不影 響ICL的包被，或者也不影響該材料產生大抑菌圈(ZOI)的效率。N.S.產品產生最佳的 ZOI，並在4天後也產生不允許細菌生長到24小時ZOI中的ZOI，如同一些其他樣本那 樣。儘管硝酸銀樣本的ZOI比N.S.小，但是比其他的大，已經報導的硝酸銀的毒性並不 必然地使得其是ICL的理想添加劑。硝酸銀的已知抗微生物性能使得可以將N.S.與硝酸 銀相比，N.S.的效率超過硝酸銀。兩種PHMB溶液似乎是相當的，但是在浸泡後ICL並不相同。PBS溶液在ICL上 留下不均勻的鹽殘留，而WFI溶液沒有使ICL具有明顯改變。兩者都產生類似的ZOL。 它們都較小，並且並不以與N.S.ZOI相同的方式產生ZOI。納米晶體銀和PHMB被發現是有效的抗微生物劑，可應用於ICL構建體，它們 在該試驗中的殺菌作用證明了這一點。實施例4 =對含有抗微生物的納米晶體銀或PHMB的膠原構建體進行的處理製備疊加的雙層ICL構建體(疊加並交聯)，然後用一種抗微生物劑處理，來生 產具有抗微生物性能的雙層構建體。按照實施例2製備12種雙層的ICL構建體，每種大小為約9cmX9cm。在制 備中，將這些ICL構建體用10mMEDC/0.1MMES[2-(N-嗎啉代)乙磺酸](Pierce， Rockford, IL)緩衝液交聯16 20小時，然後在無菌過濾水中衝洗3次，每次30分鐘。 然後，用一種抗微生物劑處理所製備的構建體。將抗微生物劑製備成溶液或分散體。將10g、l.Og、O.lg、O.Olg。O.OOlg納米 晶體銀(納米技術(Ag-20)或等價物，Austin，TX)與1L懸浮劑異丙醇(無菌過濾水 也是可接受的懸浮劑)混合，製備五種納米晶體銀分散體。將Cosmocil CQ (20% PHMB 溶液，ArchChemicals，Inc., Norwalk, CT)與 RODI/WFI 混合，來製備 0.2%、0.1%、 0.02%, 0.002% PHMB 溶液。為了用抗微生物劑包被層壓和交聯的構建體，將經水合處理的構建體放置在 9.5cmX9.5cm盤子中。將50mL各種試劑輕輕倒入盤中，將盤子放置在搖臺上。包被時 間為10秒、1小時、3小時和過夜(約18小時)。在設定的時間結束時，允許樣本在聚 碳酸酯薄片上，在生物安全層流室的無菌氣流中乾燥，乾燥達到10 20%相對溼度。
生成的構建體是層壓的、交聯的雙層TCL構建體，並用一種抗微生物劑處理 過，使該構建體具有抗微生物的性質。棚列5:龍腿制本慰，ffl〒吿丨丨 作雙層的抗微牛物構津體製備單層的ICL構建體，交聯，並用一種抗微生物劑處理，然後層壓形成雙層 構建體，來製備具有抗微生物性質的雙層加工的組織基質構建體。在用抗微生物劑處理 之後，將構建體層壓，從而將抗微生物劑摻入到經加工的組織基質的片層之間。按照實施例1製備ICL，將其鋪展在聚碳酸酯薄片上，並除去淋巴附屬物。將 薄片剪切成大小為約10cmX9cm。將各個ICL切片放在10mM EDC/0.1M MES[2_ (N-嗎 啉代)乙磺酸](Pierce，Rockford, IL)緩衝液中交聯，每26個薄片使用2升溶液，並在 設定值為4的搖臺上攪拌16-20小時，然後在至少2L無菌過濾水中洗滌三次，每次30分 鍾。將抗微生物劑配製成溶液或分散體。通過將l.Og、O.lg、O.Olg納米晶體銀 (Nanotechnologies(Ag-20)或等價物，Austin，TX)混合在1L分散劑，例如異丙醇(無菌 過濾水也是可接受的分散劑)中而製備了三種納米晶體銀分散體。將COSmOcilCQ(20% PHMB 溶液，ArchChemicals，Inc.Norwalk, CT)與 RODI/WFI 混合，製備了 0.2%、 0.1%, 0.02% PHMB 溶液。用抗微生物劑包被ICL，將薄片放置在125ml無菌的方形容器中(Nalgene)，每 個容器含有四個薄片。往各個容器中倒入lOOmL含有抗微生物劑的溶液或分散體，浸沒 該構建體。在旋轉式搖動器平臺上攪拌容器，使ICL保持浸沒3-6小時。將經抗微生物處理的ICL疊加來製備構建體。將經加工的ICL薄片平鋪到聚碳 酸酯薄片上，然後將第二個經加工的ICL薄片直接放置在上方，覆蓋在第一層上，在層 之間沒有氣泡。然後將包括構建體的聚碳酸酯薄片放在生物安全層流室的無菌氣流中， 至少乾燥12小時，達到10-20%的相對溼度。製備得到的構建體是雙層的ICL構建體，該構建體已經被交聯，並且被一種抗 微生物劑處理以具備抗微生物性能，經過層壓使得不僅在構建體的表面而且在構建體的 片層之間都摻有抗微生物劑。實施例6 對含有抗微生物的納米晶體銀的雙層膠原構建體進行處理製備(層壓並且交聯的)層壓的雙層ICL構建體，然後用一種抗微生物劑處理， 以生產具有抗微生物性能的雙層構建體。按照實施例2，製備12種雙層ICL構建體，每種大小為約35-40cmX9cm。在 製備過程中，將ICL構建體用10mM EDC/0.1M MES[2_(N_嗎啉代)乙磺酸](Pierce, Rockford, IL)緩衝液交聯16-20小時，然後在無菌過濾水中衝洗30分鐘。然後，將所 製備的構建體用一種抗微生物劑處理。將抗微生物劑製備成分散體。將10.0g、5.0g、l.Og納米晶體銀 (Nanotechnologies(Ag-20)或等價物，Austin，TX)與1L異丙醇混合來製備三種納米晶
體銀分散體，異丙醇作為納米晶體銀的分散劑(無菌過濾水也是可接受的分散劑)。為了用一種抗微生物劑包被構建體，將薄片放置在1L無菌的方形容器 (Nalgene)中，每個容器含有四個薄片。往各個容器中倒入200mL含有抗微生物劑的溶液或分散體，浸沒該構建體。將容器在旋轉式搖動器平臺上攪拌，使ICL保持浸沒3-6小 時。將已經與納米晶體銀分散體接觸的構建體在1L無菌過濾水中洗滌一次。將經抗微 生物處理的構建體平鋪在聚碳酸酯薄片上，在生物安全層流室的無菌氣流中至少乾燥12 小時，達到10-20%的相對溼度。製備得到的構建體是雙層的ICL構建體，該構建體已經被層壓和交聯，並用一 種抗微生物劑處理過而賦予其抗微生物性能。棚列7: X寸■腿射勿傭狐■測 於製作雙層的抗微牛物構津體製備交聯的單層ICL構建體，交聯並用一種抗微生物劑處理，然後層壓而形成 一種雙層構建體，來製備具有抗微生物性能的雙層構建體。在用抗微生物劑處理後，對 構建體進行層壓處理，通過包被外表面，有可能將更多的抗微生物劑摻入到構建體中， 並且抗微生物劑存在於構建體的片層之間。按照實施例1製備ICL。然後將ICL覆蓋在聚碳酸酯薄片上，35_40cm長X9cm 寬，除去淋巴附屬物。將各個薄片用10mMEDC/0.1MMES[2-(N_嗎啉代)乙磺酸] (Pierce, Rockford, IL)緩衝液交聯，每30個薄片使用3升溶液，並在設定值為4的搖臺 上攪拌16-20小時，然後在3-5L無菌過濾水中衝洗三次，每次30分鐘。將抗微生物劑製備成分散體。將lO.Og、5.0g、l.Og納米晶體銀 (Nanotechnologies(Ag-20)或等價物，Austin，TX)與1L分散劑，如異丙醇混合，還將 5.0g納米晶體銀溶於1L RODI中，來製備四種納米晶體銀分散體。為了用一種抗微生物劑包被ICL，將ICL薄片放置在250mL無菌容器(Nalgene) 中，每個容器含有四個薄片。往各個容器中倒入200mL含有抗微生物劑的溶液或分散 體，浸沒該構建體。將容器在旋轉式搖動器平臺上攪拌，使ICL保持浸沒3-6小時。將 已經與納米晶體銀分散體接觸的ICL在1L無菌過濾水中洗滌一次。將經過抗微生物處理的ICL層疊來製備雙層構建體。將經加工的ICL薄片平鋪到 聚碳酸酯薄片上，然後將第二個經加工的ICL薄片直接放置在上方，覆蓋在第一層上， 在片層之間沒有氣泡。然後將包括構建體的聚碳酸酯薄片放在生物安全層流室的無菌氣 流中，至少乾燥12小時，達到10-20%的相對溼度。所得到的構建體是雙層的ICL構建體，該構建體已經被交聯，並用一種抗微生 物劑處理以賦予其抗微生物性能，然後經過層壓使得在構建體的片層之間摻入更多抗微 生物劑。實施例8 交聯和預層壓後包被製備交聯的單層ICL構建體，並且交聯，然後用一種抗微生物劑處理，然後層 壓而形成一種雙層構建體，從而製備具有抗微生物性能的雙層構建體。在用抗微生物劑 處理後，對構建體進行層壓處理，在ICL片層之間摻入了更多的抗微生物劑。將ICL薄片覆蓋在聚碳酸酯薄片上，除去淋巴附屬物，該薄片為約35-40cm 長X9cm寬。將各個薄片用10mM EDC/0.1M MES[2_(N_嗎啉代)乙磺酸](Pierce， Rockford, IL)緩衝液交聯，每30個薄片使用3升溶液，並在設定值為4的搖臺上攪拌 16-20小時，然後在3-5L無菌過濾水中衝洗三次，每次30分鐘。將抗微生物劑配製成溶液或分散體。將5.0克納米晶體銀
25(Nanotechnologies(Ag_20)或等價物，Austin，TX)混合在1L分散劑RODI中，來製備 納米晶體銀分散體。將5.0mL Cosmocil CQ (20% PHMB溶液)與1000mL RODI/WFI混 合，製備0.1% PHMB溶液。為了用PHMB試劑包被ICL，將28-30個ICL薄片放在潔淨的5LPyrex玻璃瓶
中。加入3000mL0.1%PHMB溶液。將容器在旋轉式搖動器平臺上攪拌，使ICL保持 浸沒3-6小時。為了用納米晶體銀分散體包被ICL，將200mL分散體加入到250mL無菌容器 (Nalgene)中。將四個ICL薄片放入各個容器中並攪拌3-6小時。與納米晶體銀分散體 接觸的ICL在250mL RODI洗滌15分鐘一次，並在500mL RODI洗滌一次至少5分鐘， 直到進行層壓處理。對與PHMB溶液接觸的ICL不進行洗滌。將經抗微生物處理的ICL疊加來製備雙層構建體。將經加工的ICL薄片平鋪到 聚碳酸酯薄片上，然後將第二個加工的ICL薄片直接放置在上方，覆蓋在第一層上，在 片層之間沒有氣泡。然後將包括構建體的聚碳酸酯薄片放在生物安全層流室的無菌氣流 中，至少乾燥12小時，達到10-20%的相對溼度。製備得到的構建體是雙層的ICL構建體，該構建體已經被交聯，並且被一種抗 微生物劑處理過以賦予其抗微生物性能，經過層壓使得在構建體的片層之間摻入了更多 抗微生物劑。棚列9 荊介二#腦物髓X押氧龍■髓■■細賄(MRSA) 在部分厚度傷口樽型中增殖的影響檢測三種抗微生物敷料對部分厚度傷口的抗菌活性，該傷口寄居有甲氧苯青黴 素抗性金黃色葡萄球菌(MRSA)。由於豬皮膚與人皮膚在形態學上相似，因此使用豬作為試驗動物。豬重約 25-30kg，在開始試驗之前將豬在圈中飼養兩周。給豬隨意飼餵基礎飼料，並在豬圈中單 獨飼養(遵照USDA的要求)，控制溫度(19-21°C )和光照(12h/12h光/暗)。肌肉注 射Telaz0l(5mg/kg)、甲苯噻嗪(2mg/kg)、阿託品(0.05mg/kg)並吸入異熒烷和氧氣的混 合氣來麻醉豬。用標準的動物剪毛機剪去豬背部的毛髮。將豬背部兩側的皮膚用無抗菌 素的肥皂(Ncutrogcna )和無菌水洗滌。用無菌紗布將豬拭乾。用專業電動角質切刀 在背部皮膚上造36個部分厚度傷口(10X7X0.3mm)。然後在傷口上接種甲氧苯青黴素 抗性金黃色葡萄球菌ATCC 33593。為了製備細菌接種物，可使用直接從美國典型培養物保藏中心(ATCC)， Rockville, Maryland獲得的病原性分離物的新鮮培養物。接種物是甲氧苯青黴素抗性金 黃色葡萄球菌ATCC 33593。通過ATCC標準回收操作，收集凍幹細菌培養物。將培養 板上的過夜生長的培養物刮到5ml常規生理鹽水中，直到懸浮液的混濁度與MacFariand #8混濁度標準相同，來製備所有的接種物懸浮液。這將獲得約108的克隆形成單位/ ml(CFU/ml)的懸浮濃度。將108的懸浮液連續稀釋而製得濃度為約106CFU/ml的接種 物懸浮液。將少量接種物懸浮液覆蓋到培養液上，量化活生物體的精確濃度。用接種物 懸浮液直接接種各個傷口部位。將0.025ml (25 iU)懸浮液等分試樣添加到位於各個傷口 中央的無菌玻璃杯(直徑22mm)中。用無菌特氟倫刮刀將懸浮液在各個檢測部位上輕輕 塗抹10秒鐘，並乾燥3分鐘。在接種後10分鐘內，用聚亞胺酯膜敷料覆蓋所有接種傷
26口，24小時後開始處理，給予細菌以定居傷口的時間。再造三個傷口，進行接種以在開始處理之前獲得基線CFU/ml:接種物Log 4.24CFU/mL ；基線計數Log 5.38CFU/mL。按照如下試驗設計，對六個傷口進行各種 處理。每日監控動物受試者是否存在任何可觀察到的疼痛或不適的跡象。為了有助於使 可能的不適最小化，在整個試驗過程中使用一種止痛劑(duragesic-芬酞尼經皮系統，其 以25i!g/hr洗提)1)敷料A是按照實施例8製備的經PHMB處理的雙層構建體2)敷料B是按照實施例8製備的經雙層納米晶體銀處理的構建體3)敷料C是按照實施例8製備的經納米晶體銀處理的單層構建體4)對照(石油紗布或聚亞胺酯膜)5)陽性對照(競爭性抗微生物的敷料或者抑菌油膏)6)未經加工的、暴露於空氣的對照將除了未經處理組外的其他所有處理組用聚亞胺酯膜覆蓋(與sponsor —致)。 將處理組隨機分為1、2、3、4、5或6區。每天總共對每個處理組的三個傷口進行評價。在處理後的24小時和72小時，對各個處理組的三個傷口進行培育。在各個取 樣時間點，對部位進行定量地培育。每個部位僅培育一次。該區域被無菌玻璃杯(外 徑22mm)包圍，將玻璃杯用兩個手柄固定在適當位置上。用移液槍將1ml塗抹液加到 玻璃杯中，用無菌特氟倫刮刀塗抹該部位30秒鐘。製備一系列稀釋液，用Spiral Plater System對塗抹液進行量化，該系統將少量確定量的(40 iU)懸浮液滴加到旋轉瓊脂平板的 表面上。讓MRSA在選擇性培養液中生長，該培養液用Mueller Hinton瓊脂、4%NaCl和 eyg/ml苯唑西林配製。由於苯唑西林配製更為穩定，用它替代甲氧苯青黴素。在培育 期(24小時)後，對平板上的菌落進行計數，計算每毫升的菌落形成單位(CFU/ml)。將該試驗結果提供在表1中。結果表明雙層PHMB、雙層納米晶體銀，以及單
層納米晶體銀能夠有效地從傷口中根除細菌。
權利要求
1. 一種生物工程化的膠原構建體，其包括一層源於小腸黏膜下層的純化的膠原組 織基質，所述純化的膠原組織基質已經被一種抗微生物劑處理過，其中該構建體是生物 相容的，並且當被應用於創面床時促進組織生長。
2.權利要求1的生物工程化的膠原構建體，其中所述構建體是有網孔的、有窗的或 者被穿孔的。
3.權利要求2的生物工程化的膠原構建體，其中網孔的網孔比例是1 1.5。
4.權利要求1的生物工程化的膠原構建體，其中所述抗微生物劑選自納米晶體銀和 PHMB。
5.權利要求1的生物工程化的膠原構建體，其中採用交聯劑1-乙基-3-(3-二甲基氨 基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽將所述構建體化學粘合。
6.權利要求1的生物工程化的膠原構建體，其中所述構建體具有在約0.05mm到約 0.07mm之間的厚度。
7.權利要求1的生物工程化的膠原構建體，其中構建體是可生物重塑的。
8.生物工程化的膠原構建體，包括雙層或多層經化學粘合的用抗微生物劑處理的 加工的組織材料層，其中當將構建體植入哺乳動物患者的創面床時，構建體發生受控的 生物降解，伴隨發生足夠的活細胞替換，使得構建體被患者的活細胞重塑。
9.權利要求8的生物工程化的膠原構建體，其中構建體有網孔的、有窗的或者被穿 孔的。
10.權利要求9的生物工程化的膠原構建體，其中網孔的網孔比例是1 1.5。
11.權利要求8的生物工程化的膠原構建體，其中抗微生物劑選自納米晶體銀和 PHMB。
12.權利要求8的生物工程化的膠原構建體，其中採用交聯劑1-乙基-3-(3-二甲基 氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽將所述構建體化學粘合。
13.權利要求8的生物工程化的膠原構建體，其中構建體是生物相容的。
14.權利要求8的生物工程化的膠原構建體，其中加工的組織材料是小腸黏膜下層。
15.製備抗微生物的可生物重塑的假體的方法，該假體具有雙層或多層疊加的、粘合 的加工的組織基質層，該方法包括步驟(a)層疊兩片或多片水合的加工的組織基質層；(b)使所述的組織層脫水以將所述層粘連在一起；(C)用交聯劑交聯所述組織層以將所述層粘合在一起；(d)漂洗所述層以除去交聯劑；和(e)用一種抗微生物劑處理粘合的層；其中當將假體植入到哺乳動物患者中時，假體發生受控的生物降解，伴隨發生足夠 的活細胞替換，使得假體被患者的活細胞重塑。
16.製備抗微生物的可生物重塑的假體的方法，該假體具有雙層或多層疊加的、粘合 的源於小腸黏膜下層的加工的組織基質層，該方法包括步驟(a)層疊兩片或多片水合的加工的組織基質層；(b)使所述的組織層脫水以將所述層粘貼在一起；(c)用交聯劑交聯所述組織層以將所述層粘合在一起；(d)漂洗滌所述層以去除交聯劑；和(e)用一種抗微生物劑處理粘合的層；其中當將假體植入到哺乳動物患者中時，假體發生受控的生物降解，伴隨發生足夠 的活細胞替換，使得假體被患者的活細胞重塑。
17.製備抗微生物的創傷敷料的方法，該敷料具有單層源於小腸黏膜下層的加工的組 織基質，該方法包括步驟(a)從所述黏膜下層中純化組織基質；(b)用一種抗微生物劑處理所述組織基質，其中當創傷敷料被應用於傷口時，它維持 溼潤的傷口環境以促進傷口中的皮膚組織再生。
18.權利要求15、16或17的方法，其中創傷敷料是有網孔的、有窗的或者被穿孔的。
19.一種處理傷口的方法，包括步驟(a)清潔傷口和傷口周圍的區域；(b)應用抗微生物的創傷敷料，該敷料包括用一種抗微生物劑處理的源於小腸黏膜下 層的純化的膠原組織基質。
20.權利要求19的方法，其中抗微生物的創傷敷料是有網孔的、有窗的或者被穿孔的。
21.—種處理傷口的方法，包括步驟(a)清潔傷口和傷口周圍的區域；(b)將選自自體移植物、同種異體移植物或者培養的皮膚構建體的皮膚替換物應用到 皮膚；和(C)將包括用一種抗微生物劑處理的源於小腸黏膜下層的純化的膠原組織基質的抗微 生物的創傷敷料應用到所述的皮膚替換物。
22.權利要求21的方法，其中所述的皮膚替換物是有網孔的、有窗的或者被穿孔的。
23.權利要求21的方法，其中所述的抗微生物的創傷敷料在應用於傷口之前被網狀化。
24.權利要求21的方法，其中所述傷口選自由部分或完全厚度傷口、壓迫潰瘍、靜 脈潰瘍、糖尿病潰瘍、慢性血管潰瘍、隧道傷口、地雷傷口、外科手術傷口、用於自體 移植的供體部位傷口、Moh氏手術後傷口、雷射手術後傷口、傷口開裂、外傷傷口、擦 傷、破口、二度燒傷、皮膚撕裂以及流液型傷口組成的組。
25.修復或替換受損組織的方法，包括下列步驟在患者中植入假體，所述方法包括 雙層或多層疊加的粘合的採用一種抗微生物劑處理的膠原材料層，其中當將假體植入到 哺乳動物患者中時，假體發生受控的生物降解，伴隨發生足夠的活細胞替換，使得被植 入的假體被患者的活細胞重塑。
26.權利要求25的方法，其中所述假體包括2 5個源於小腸黏膜下層的加工的腸道 膠原薄片，所述薄片被用濃度為0.1 IOOmM的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化 二亞胺鹽酸鹽粘合和交聯在一起。
27.權利要求25的方法，其中所述假體是疝氣修復補片、股疝修復塞子、心包補片、膀胱吊索、子宮吊索、心臟內補片、心臟瓣膜替換物、血管補片、纖維環板層修復 塞子、修復纖維環板層補片、軸轉肌修復假體、硬腦膜修復補片、膀胱膨出修復裝置、 後腸腔修復裝置、陰道拱頂下垂修復吊索、整形手術植入物。
28.權利要求21的方法，其中需要修復的受損的或患病的軟組織用於處理腹壁和胸 壁的缺陷、肌肉翻轉加固、直腸和陰道下垂、骨盆底重構、疝氣、縫合線加固和重構操 作。
29.改性的腸道膠原層，其包括源於小腸黏膜下層的腸道膠原層，所述膠原層已經被 一種抗微生物劑處理過。
30.權利要求29的改性的腸道膠原層，其中所述抗微生物劑是納米晶體銀。
31.權利要求30的改性的腸道膠原層，其中納米晶體銀沒有原子雜亂。
32.權利要求29的改進的腸道膠原層，其中所述抗微生物劑是PHMB。
33.經加工的組織基質，其包括基本上不含有非膠原成分的哺乳動物細胞組織，所述 經加工的組織基質已經被一種抗微生物劑處理過。
34.權利要求33的經加工的組織基質，其中所述抗微生物劑是納米晶體銀。
35.權利要求34的經加工的組織基質，其中納米晶體銀沒有原子雜亂。
36.權利要求33的經加工的組織基質，其中所述抗微生物劑是PHMB。
全文摘要
本發明提供具有抗微生物性能的生物工程化的膠原構建體。該生物工程化的膠原構建體包含片狀的源於組織如小腸組織黏膜下層的純化的膠原組織基質層或源於小腸組織黏膜下層的加工的腸道膠原層，它們被抗微生物劑處理過。該構建體是生物相容的。本發明具有多種用途，包括創傷敷料和外科修復裝置。本發明還提供用於處理受損或患病的軟組織的方法。本發明還公開了對需要護理和治療的創傷進行處理的方法。
文檔編號A61F2/00GK102014790SQ200680047281
公開日2011年4月13日 申請日期2006年10月18日 優先權日2005年10月18日
發明者A·J·尼克森, G·A·阿布拉漢 申請人:器官發生有限公司