改進的脂解酶和其用途的製作方法
2023-09-21 15:00:15 4
專利名稱：改進的脂解酶和其用途的製作方法
技術領域：
本發明主要涉及脂解酶領域。特別是，本發明涉及用重組DNA技術改進過的脂解酶，涉及有關生產它們的方法以及其用途，特別是用於酶洗滌劑組合物中。
脂解酶是能夠將甘油三酯水解成游離脂肪酸和甘油二酯，單酸甘油酯並最終水解成甘油的酶。它們也可裂解更複雜的酯如植物中的角質層或皮膚的皮脂。脂解酶用於工業上的各種酶加工，如甘油三酯的酯交換和酯基轉移以及酯的合成。也可將它們用於洗滌劑組合物以達到改善洗滌劑產品去除脂肪特性的目的。
應用最廣泛的脂解酶是脂酶(EC3.1.1.3)。例如，EP-A-258068和EP-A-305216(均屬Novo Nordisk)都描述了用rDNA技術經異源宿主微生物生產真菌酯酶，特別是來自Thermomyces Lanuginosus/Humicola Lanuginosa的酯酶。EP-A-331376(Amano)描述了酯酶和用rDNA技術生產它們的方法及它們的用途，包括來自蔥頭假單孢菌的胺基酸序列。在WO-A-89/09263和EP-A-218272(均屬Gist-Brocades)中進一步給出了用rDNA技術生產的其它酯酶的實例。儘管有大量關於酯酶和其修飾物的公開文獻，但迄今為止，僅發現來自Humicola Lanuginosa的酯酶具有廣泛的商業應用，可作為商標名為Lipolase(TM)的洗滌產品的附加成分。
酯酶的一個特徵是它們表現出界面活性，這意味著對已形成界面或膠束的底物的酶活性比完全溶解的底物高出很多。若底物濃度高於底物的臨界膠束濃度(CMC)，則由酯解活性的突然增加反映出界面活性，並形成界面。在酶活性對底物濃度的曲線圖中，可通過實驗觀察到這種現象表現為不連續性。
已經從酯酶分子蛋白質結構構象的改變，解釋了酯酶界面活性的機制。在游離的，未結合狀態，螺旋形蓋蓋住了催化結合位點。結合到脂底物上後，代替了與蓋的結合，催化位點暴露出來。也認為螺旋蓋與脂界面相互作用，因此，使酶保持與界面的結合。
WO-A-92/05249(Novo Nordisk)公開了遺傳工程方法修飾的酯酶(特別是來自Humicola Lanuginosa的酯酶)，在脂接觸區對其進行了修飾。在該申請中，將脂接觸區定義為在活性結構中由螺旋形蓋覆蓋的表面。修飾涉及酯接觸區中一個或多個胺基酸殘基的缺失或取代，以便增加脂接觸區的靜電荷和/或降低脂接觸區的疏水性，或者以便改變脂接觸區的表面構型。通過缺失脂接觸區中的一個或多個帶負電荷的胺基酸殘基，或者用中性或更多的帶正電荷的胺基酸取代這些殘基，和/或用帶正電荷的胺基酸取代脂接觸區中的一個或多個中性胺基酸殘基，和/或缺失脂接觸區中的一個或多個親水的胺基酸殘基，或用疏水胺基酸取代這些殘基來達到上述目的。
角質酶是酶的一個亞類(EC3.1.1.50)，蠟酯水解酶。這些酶能夠降解角質(一種植物中產生的作為葉子和莖上保護性包被的酯化長鏈脂肪酸和脂肪醇網)。另外，它們具有一些脂解活性，即，它們能夠水解甘油三酯。因此，認為它們是一種特殊的酯酶。但與酯酶相反，角質酶不表現出任何基本的界面活性。
可以從許多來源，如植物(花粉)，細菌和真菌得到角質酶。由於它們的脂肪降解特性，已提出將角質酶作為酶洗滌劑組合物的成分。例如，WO-A-88/09367(Genencor)提出將一種表面活性劑和一種基本上純的細菌角質酶組合起來以配製有效的清洗組合物。公開的是含有從克蘭氏陰性菌惡臭假單孢菌ATCC53552得到的角質酶的洗滌劑組合物。然而，在最近的歐洲專利申請EP-A-476915(Clorox)中，它公開了相同的酶-將其稱為脂酶-若按常規方法使用在從織物上除去油漬方面不比其它脂酶更有效。
最近，已確定了來自茄病鐮孢的角質酶的三維結構(Martinez)等人，(1992)Nature 356，615-618)。發現該酶不具有覆蓋催化結合位點的螺旋形蓋。而活性位點絲氨基殘基似乎能為溶劑接近。這些發現看起來可證實目前關於酯酶中介面活性機制的理論。
已將來自茄病鐮孢的角質酶克隆並定序(Ettinger等人，(1987)Biochemistry 26，7883-7892)。WO-A-90/09446(Plant Genetics Systems)描述了該基因在大腸桿菌中的克隆和生產。在沒有和存在角質酶與底物間界面的兩種情況下，角質酶可有效催化含水或非水介質中酯的水解與合成。以其正常穩定性為基礎上可用這種角質酶生產清洗劑如洗衣用洗滌劑和其它專門溶解脂肪的製品，如化妝品組合物和香波。既未公開以經濟可行的途徑生產該酶的方法，也沒公開含角質酶的特定酶洗滌劑組合物。
由於該特性(即沒有界面活性)，對於本專利申請來說，我們將角質酶定義為基本上不表現界面活性的脂解酶。因此，角質酶與經典的脂酶不同，即它們沒有覆蓋催化結合位點的螺旋狀蓋。
如上文提到的，迄今為止，僅發現得自Humicola Lanuginosa的脂酶有廣泛的商業應用，可作為商標名為Lipolase(TM)的洗滌產品的附加成分。在Chemistry和Industry(1990，page 183-186)，Henrik Malmos在他的文章中提到已經知道，一般在洗滌過程中，脂酶的活性低，而且Lipolase(TM)也不例外。在乾燥過程中，若織物的水含量減少，則酶會重新得到其活性並水解脂肪油漬。在接下去的洗滌過程中，除去水解的物質。這可以解釋為什麼在第一次洗滌過程中脂酶的作用低而在接下去的過程中作用明顯。因此，仍需要在洗滌過程中表面出任何顯著活性的脂解酶。
我們已發現角質酶(特別是來自茄病鐮孢的角質酶)表現出明顯的洗滌效果。然而，還需要具有改善的洗滌用脂解酶活性的角質酶和生產所述酶的方法。
本發明的目的是提供經過修飾以提高其性能，特別是它們的洗滌用脂解活性的角質酶。
我們現已驚奇地發現，通過修飾胺基酸序列，這樣提高酶表面的疏水性，可以改善真核角質酶的特別是來自茄病鐮孢，Colletotrichum Capsici，盤長孢狀毛盤孢和Magnaporthe grisea的角質酶的脂解活性。
母體角質酶的角質酶變異體，其中已修飾過胺基酸序列，這樣就提高了酶表面的疏水性。最好是，提高酶表面的疏水性以便形成擴大的脂接觸區。
本發明涉及角質酶的變異體。按上文所討論的，可從許多來源，如植物(如花粉)，細菌和真菌獲得角質酶。為了用重組DNA技術進行修飾，在本發明中用作母體角質酶或起始物質的角質酶選自真核的角質酶。真核角質酶可從各種來源獲得，例如植物(如花粉)，或真菌。
(真核的)真菌角質酶似乎含有具有不同特異性(葉-特異性和莖-特異性)的兩個家族。具有葉-特異性的角質酶往往會有酸或中性最佳PH，而具有莖-特異性的角質酶往往會有鹼性最佳PH。具有鹼性最佳PH的角質酶更適用於鹼合成的洗滌劑組合物如重垢織物洗滌粉和液體。具有酸性至中性最佳PH的角質酶更適用於輕垢織物或漂洗調理劑，而且適用於工業用清洗產品。
在下列表Ⅰ中，列出了具有莖-特異性的四種不同角質酶，以及它們的最佳PH。
表Ⅰ具有莖-特異性的角質酶的實例 最佳PH茄病鐮孢 9玫瑰色鐮孢 10茄屬絲核菌 8.5甘藍鏈格孢(PNBase I) 9在本發明中特別優選的是從野生型茄病鐮孢(Ettinger等人，1987)得到的角質酶。若用於特定的洗滌劑組合物，則這種角質酶表現出明顯的「洗滌用」效果。
為了用重組DNA技術進行修飾，在本發明中適宜作母體角質酶或起始物質的是與來自茄病鐮孢的角質酶有高度胺基酸序列同源性的角質酶。實例是來自Colletotrichum capsici，盤長孢狀毛盤孢和Magnaporthe grisea。在
圖12中列出了這些角質酶的部分胺基酸並且可以看出有高度的同源性。
除通過修飾其基因改進茄病鐮孢外，用從茄病鐮孢得到的5′-和3′-DNA探針，編碼(前)角質酶的Colletotrichum capsici，盤長孢狀毛盤孢和Magnaporthe grisea cDNA和識別其它脂解酶中保守序列的探針可分離編碼來自其它真核生物的角質酶的遺傳信息，並且如果需要，通過聚合酶鏈反應或PCR技術(參見，例如WO-A-92/05249)，用這些探針擴增從生產角質酶的真核細胞的信使RNA′s(mRNA′s)得到的cDNA′s。按標準方法，在大腸桿菌中克隆並表達角質酶編碼基因後，在適當條件下，檢測角質酶在(脂肪)汙點除去方面的性能。用這樣的方法，可以得到許多具有改善的洗滌用性能的，上述角質酶的天然變異體。此外，這些天然產生的角質酶的序列為進一步進行茄病鐮孢角質酶的蛋白質工程提供了極好的基礎。
在有關決定「洗滌用」脂解酶活性的因素的新觀點及仔細觀察茄病鐮孢角質酶三維結構的基礎上，我們已發現許多如何提高這種角質酶性能的可能性和一般用重組DNA技術得到的角質酶。
由於角質酶基本上不同於象Lipolase(TM)那樣的脂酶，因此，角質酶底物(脂界面)間的相互作用所基於的原理也不同於可結合底物的疏水區，其蓋打開和暴露的原理(Brzozowski等人，(1991)Nature 351，491-494)。
本發明指出，可以修飾角質酶，這樣可以改善與底物的相互作用而不會在修飾的角質酶的表面上形成上述大的疏水區，使得角質酶分子開始聚集。可以通過導入疏水胺基酸象丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸，以及甲硫氨酸並降低穀氨酸、穀氨酸胺和組氨酸的水平，如果這些胺基酸的疏水側鏈不會被埋在角質酶的疏水核心中，則從而可增加疏水表面。一般不認為甲硫氨酸是疏水胺基酸。然而，若加到特定的位置上，在角質酶分子表面，甲硫氨酸可有效地起到提高疏水性的作用。
在某些情況下，發現除導入疏水胺基酸外，導入帶電荷的胺基酸也有益於避免酶的聚集。令人驚奇地是，我們發現，若加到角質酶分子的特定位置，帶正電荷的胺基酸象賴氨酸和精氨酸也能增加疏水表面面積。這限於賴氨酸和精氨酸中的亞甲基未埋在分子中的角質酶分子中的那些位置。用賴氨酸或精氨酸的優點是氨基-或亞氨基增加了暴露亞甲基並因此能夠與脂相相互作用的可能性。
通常不認為賴氨酸和精氨酸是疏水胺基酸。然而，形成這些殘基側鏈的原子含有許多可以與脂相相互作用的原子(在亞甲基部分)。事實上，賴氨酸殘基疏水部分的大小可以與纈氨酸殘基的相比。
如果導入正電荷會對角質酶的其它內在特性產生副作用，那麼通過在或靠近與脂相相互作用的角質酶分子部分的表面，導入平衡的負電荷或消除靜電荷來抵消這種副作用。
觀察活性位點周圍，茄病鐮孢角質酶表面的疏水性，發現這樣的疏水性不是最佳的。為了使其得到提高，可以用更鬆散的疏水殘基取代該區域中的特定胺基酸。
為了更好地理解脂解酶中結構和功能間的相互關係，我們仔細研究了許多所述酶的三維(3D)結構。在這些結構還未發表時，我們用分子模擬技術的方法推導出了其結構。
用X射線晶體學方法已經確定了Rhizomucor miehei脂酶的3D結構(Brady等人(1990)Nature 343，767-770，Brzozowski等人(1991)Nature 351，491-494，Derewenda等人(1992)Biochemistry 31，1532-1541)。活性位點Ser 144(屬於Ser-His-Asp蛋白酶那樣的催化三元素組)被埋在短的螺旋狀蓋下(殘基85-91)。其活性位點Ser被埋的結構在下文將被稱為酶的「關閉的」酶象。認為在油-水界面的吸附作用與螺旋狀蓋的運動有關。作為這種運動的結果，活性位點絲氨酸變成暴露的並增加了活性位點周圍的疏水區。認為「開的」構象相當於在油-水界面吸附的活性酶。
已經將真菌Rhizomucor miehei「關閉」形式的Ca-等同物寄存在Brookhaven的Protein Data Bank。用完善的計算方法生產Rhizomucor miehei脂酶的全部蛋白質等同物(骨架和側鏈)。用S.Wodak等人(1989)，Protein Engineering 2，335-345)描述的計算方法，生產Rhizomucor miehei脂酶的粗起始模型。在SYBYL分子模型化軟體包(TRIPOS associates，Inc.St.Louis，Missouri)提供了該方法。隨後，通過使用在BIOSYM分子模型化軟體包(BIOSYM，San Diego，California)中提供的能量最小化(EM)和分子動力學(MD)技術改進模型。在模型的EM和MD完善過程中，使用已知方法。同時按潛在能量功能和已知結構標準對模型作詳細的能量最優化處理。通過如氫鍵的數量和質量，氫在二級結構單體中的結合模式，肽單位的方向，主鏈二面角的值，芳香基團的相反作用角及空腔的大小等標準評估模型的質量。此外，檢查該模型不適當包埋的電荷，特別是暴露的疏水殘基和能量方面二硫鍵不適當的位置。從Ponder Richards旋轉異構體庫(Ponder等人，(1987)J.Mol.Biol 193，775-791)選擇相關的側鏈旋轉異構體。來自該庫的特定側鏈旋轉異構體的最終選擇是以上述提到的結構標準評價為基礎的。用MD將側鏈原子退火到位。有關該模型結構與已知結構特性一致性的詳細檢測及優化結構特徵的EM和MD計算使得可得到Rhizomucor miehei脂酶的可靠的全原子模型。用MD計算機模擬分析得到Rhzomucor miehei脂酶的「開」構象，其中將C10-甘油三酯對接在脂酶的活性位點。與發表的開結構構象特徵(Derewenda等人，Biochemistry(1992)31，1532-1541)作詳細的比較發現，用這種方法得到的「開」構象的計算機模型是基本相同的。
從真菌Rhizomucor miehei脂酶的已知3D結構開始，通過使用SYBYL分子模擬軟體包(TRIPOS associates Inc.St.Louis，Missouri)的COMPOSER軟體提供的法則為基礎的可對比模擬技術得到Humicola Langinosa脂酶「開」和「關閉」的3D-結構。用與上述相同的計算方法改進得到的Humicola Lanuginosa脂酶模型。
通過比較真菌Rhizomucor miehei脂酶和Humicola Lanuginosa脂酶的三維(3D)結構，鑑定與底物吸附到酶上有關的脂酶分子部分。
從茄病鐮孢角質酶的已知3D結構開始，通過使用SYBYL分子模擬軟體包(TRIPOS associates Inc.St.Louis，Missouri)的COMPOSER軟體中提供的法則為基礎的可對比模擬技術，得到盤長孢狀毛盤孢角質酶的3D-結構。用與上述相同的計算方法，改進得到的盤長孢狀毛盤孢角質酶模型。
從下列表Ⅱ中列出的脂解酶的三維結構，出乎意料地觀察到人們可以定義一個特定的載體，該載體最小面積地覆蓋茄病鐮孢角質酶116到120殘基的全部Ca-原子。該載體基本上垂直於與底物發生相互作用的表面。
從下列表Ⅱ，接著比較大量不同來源脂解酶的一級序列，來自茄病鐮孢的角質酶的胺基酸殘基116到120似乎位於具有很大程度功能同源性的區域。用脂解酶的一致序列Gly-(His/Tyr)-Ser-X-Gly可以指導排列。
表ⅡHumicola Lanuginosa 脂酶 YRVVFTGHSLGGALATVAGADLRGNGY米赫毛黴脂酶 YDVAVTGHSLGGATALLCALGLYQREE人胰脂酶 SNVHVIGHSLGAHAAGEAGRRTVGTIG鐮刀菌屬種的角質酶 ATLEAGGYSQGAALAAASIEDLDSAIR盤長孢狀毛盤孢角質酶 AAIVSGGYSQGTAVMAGSISGLSTTIK因此，我們使用覆蓋茄病鐮孢角質酶中胺基酸殘基116到120的載體以確定部分角質酶分子，其中應進行胺基酸修飾以使得到其有改善的洗滌用活性的角質酶。下列表Ⅲ給出了表Ⅱ中所示脂解酶所鄰接的胺基酸的結構。
表Ⅲ鏈 鏈 螺旋 活性位點H.lanuginosa脂酶 138-141 142 ser*146 147-159 his258米赫毛黴脂酶 136-139 (fit:140-ser*144) 145-157 his257人胰脂酶 144-147 (fit:148-ser*152) 153-165 his263鐮刀菌角質酶 112-115 (fit:116-ser*120) 121-133 his188盤長孢狀毛盤 112-115 (fit:116-ser*120) 121-133 his188孢角質酶Ser*=活性位點的絲氨酸本發明一方面是提供一種具有改善的洗滌用脂解活性的修飾過的角質酶，其中修飾胺基酸的序列以提高該酶表面的疏水性。最好是提高鄰近脂接觸區的酶表面的疏水性以形成增大的脂接觸區。
通過用選自丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸、甲硫氨酸、穀氨酸、穀氨醯胺和組氨酸的胺基酸殘基取代一個或多個胺基酸殘基，可達到提高角質酶表面疏水性的目的。優選的是纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。
發現除以這樣的方式修飾胺基酸序列有助於提高表面疏水性外，還可通過導入一個或多個賴氨酸或精氨酸殘基來導入一個或多個正電荷。
最好是，修飾的殘基位於由載體確定的分子部分，該載體最小面積覆蓋茄病鐮孢角質酶殘基116到120的全部Ca-原子，或不同角質酶相應的Ca-原子，並水平垂直於所述載體，同時含殘基117的Ca-原子，或不同角質酶相應的Ca-原子。
如上所述，已公開了茄病鐮孢角質酶的三維結構。在那種情況下，應清楚修飾將會產生在本發明範圍內的修飾物。假如還不知道特定角質酶的三維結構，然而，通過排列已知序列(見圖12)的胺基酸序列，根據脂解酶的一致序列Gly-(His/Tyr)-Ser-X-Gly，可以得到在本發明範圍內的修飾物。最好是，在該方法中也使用分子模擬技術。
按本發明生產的角質酶變異體，若用作洗滌劑或清洗組合物的成分，可在酶活性方面帶來優越性。特別是，在洗滌過程的主要環節中，發現它們有改善的洗滌用性能。洗滌過程主要環節中的洗滌用性能，是指用正常的洗滌條件(就所關心的濃度、水的硬度、溫度而言)，在歐洲型自動洗衣機的單一洗滌過程中，含酶的洗滌劑組合物能夠從弄髒的織物上除去顯著量的油汙。應注意到，在相同條件下，傳統商業上可得到的脂解酶Lipolase(TM)(來自Novo Nordisk)對油汙看起來沒有任何顯著的洗滌用效果。
用下列檢測評估酶對油汙的洗滌用效果。將棉含量低於10%的新聚酯試驗品用無酶的洗滌劑產品(如下列給出的一種)預洗滌，隨後徹底地漂洗。然後用橄欖油或另一種適宜的，可水解油汙弄髒上述未髒的布。在100ml聚苯乙烯瓶的30ml洗滌液中溫育每塊試驗品布(重約1g)。該洗滌液含有下列以每升1g的劑量給出的洗滌劑產品。在充滿水的iele TMT洗衣機中，並使用正常的30℃主要洗滌步驟將瓶子攪拌30分鐘，以3LU/ml將角質酶加到洗滌液中。對照組不含任何酶。洗衣粉有下列組分(以%重量計)乙氧化醇非離子表面活性劑 9.5硫酸鈉 38.6碳酸鈉 40.4矽酸鈉(Na2O∶Si2O＝2.4) 7.3水 4.2我們用C12-C15的乙氧化醇10.5-13EO作為非離子表面活性劑，但乙氧化醇非離子的天然物可在很寬的範圍內變化。
洗滌後，用冷水徹底地漂洗布並在帶冷空氣的滾動乾燥器中乾燥，並估算殘留的脂肪量。這可以由幾種方法完成。普通方法是在Soxhlet提取裝置中用石油醚提取布，蒸發掉溶劑並通過稱重確定殘餘的脂肪物質佔布上起初量脂肪部分的百分比。
按第二種，更靈敏的方法，用溴化了的橄欖油弄髒試驗布(Richards，S.，Morris，M.A.and Arklay，T.H.(1868)，Textile Research Journal 38，105-107)。然後將每一件試驗布在100ml聚苯乙烯瓶的30ml洗滌液中溫育。在充滿中的洗衣機中並用常規的30℃主要洗滌步驟攪拌一系列瓶子。主要洗滌後，在5秒鐘內，用冷水仔細漂洗試驗品布。漂洗後即刻將試驗布放在帶冷空氣的乾燥機中乾燥。乾燥後，用X射線螢光光譜測定法，通過測量布的溴含量來確定殘餘的脂肪量。可將脂肪清除量確定為在布上開始存在的量的百分比，如下
%汙跡去除量＝ (溴bw-溴aw)/(溴bw) ＊100%其中溴bw是指洗滌前布上的百分比溴，溴aw是洗滌後布上的百分比溴。
評估酶活性的另一種方法是按標準技術測量在460nm的反射度。
在本發明上下文中，修飾的、突變的或突變體酶或酶變異體是指經表達突變基因的突變生物生產的酶。突變基因(而不是僅含無症狀突變的突變基因)是指編碼一種酶的基因，該酶具有直接或間接得自相應母體酶序列，與相應的母體酶序列有一個或多個位置不同的胺基酸序列。母體酶指相應的未改變基因的基因產物。基因中的無症狀突變是指(歸因於密碼子-胺基酸關係中多餘度的)不會改變由該基因編碼的酶的胺基酸序列的基因多核苷酸序列中產生的改變或差異。
突變體或突變的微生物是指一種母體微生物經受涉及其酶基因突變的微生物或者由經受涉及其酶基因突變的母體微生物轉變而來的微生物。可通過(a)突變已存在於母體微生物中的相應基因(母本基因)，或(b)轉移(導入)直接或間接從其它來源得到的相應基因，並然後導入(包括基因的突變)到該微生物中使其變成突變微生物。宿主微生物是一種突變基因或其它來源的轉移基因構成其一部分的微生物。一般，它可以是與母本微生物相同或不同菌株或種源或血緣的。
特別是，本發明提供WO-A-90/09446(Plant Genetics Systems)中公開的茄病鐮孢角質酶，Colletotrichumcapsici，盤長孢狀毛盤孢和Magnaporthe grisea角質酶的突變形式。通過rDNA修飾的含經rDNA技術得到或加工的基因的微生物，可以生產這些角質酶變異體。
一旦鑑定了位於由載體確定的分子部分的胺基酸殘基，所述載體最小面積覆蓋Fusarium solanipisi角質酶殘基116到120的全部Ca-原子，或不同角質酶相應的Ca-原子，並水平垂直於所述載體且含有殘基117的Cα-原子，或不同角質酶相應的Cα-原子，人們就可以通過在一個或多個鑑定的位置導入適宜的胺基酸從而修飾胺基酸序列，例如突變N712K涉及茄病鐮孢角質酶或其同源物的序列。
上述修飾將會影響角質酶的結構，這對於專業人員是顯而易見的。顯然，優選的修飾是對活性位點周圍的靜電荷不會影響太多。本發明人已經研究了了解酶構象的必然扭曲與提高酶活性益處間平衡的必需水平，這樣可以預測並生產具有高成功率的成功的角質酶。
在下列表Ⅳ和本說明書的其它部分，用下列一個字母和三個字母的縮寫表示肽中的胺基酸和胺基酸殘基
表ⅣA=Ala=丙氨酸 V=Val=纈氨酸L=Leu=亮氨酸 I=ILe=異亮氨酸P=Pro=脯氨酸 F=Phe=苯丙氨酸W=Trp=色氨酸 M=Met=甲硫氨酸G=Gly=甘氨酸 S=Ser=絲氨酸T=Thr=蘇氨酸 C=Cys=半胱氨酸Y=Tyr=酪氨酸 N=Asn=天冬醯胺Q=Gln=穀氨醯胺 D=Asp=天冬氨酸E=Glu=穀氨酸 K=Lys=賴氨酸R=Arg=精氨酸 H=His=組氨酸在本說明書中，突變存在於蛋白質的胺基酸序列，因此，可以以下列簡化的方式通過突變位置和突變性質描述突變體蛋白質本身通過鑑定由突變影響的原胺基酸殘基;突變位點(序列號);通過鑑定代替原胺基酸殘基的取代胺基酸殘基。如果將一個額外的胺基酸插入到序列中，則用一個或多個腳註字母標明其位置，所述腳註字母附於標準序列或參考序列最後一個在前成員的序號上。
例如，將其特徵在於172位由賴氨酸取代天冬醯胺的突變體表示為Asn172Lys或N172K。將在天冬醯胺後(假設)插入的一個附加的胺基酸殘基如脯氨酸表示為Asn172Asn Pro或N172NP，另一種表示為為＊172aP，插入的殘基表示為位置號172a。將在相同位置天冬醯胺的(假設)缺失表示為Asn172＊功N172＊。星號表示在所標明位置缺失或丟失的胺基酸殘基，或者將其看成由實際缺失或僅與在該位置有一個殘基的另一個或參考序列比較引起的丟失或與之同源。
由加號將多突變分開，如，N172K+S541+A128F表示一種帶有3個取代突變的突變體蛋白質，標明在胺基酸序列分別在這三個所提及的位置上的取代。如果需要，可將下列表中所給的突變結合起來。
下面所給的表Ⅴ表示根據本發明特定有用的角質酶變異體的實例，是以茄病鐮孢角質酶的序列為基礎的。
表Ⅴ茄病鐮孢角質酶的變異體T19V、G41A、T45K、T45P、*149a、S54l、N58R、G75R、A76P、G82A、D83S、A85F、A85V、S92R、A93V、L99K、G100R、A127L、A128F、N172K、T173I、T179F、I183F、V184I、A185L、L189F、A190L、D194R、G197V、E201K。
按照本發明，優選的變異體是茄病鐮孢角質酶的A85F，N172K和E201K，以及其它角質酶相應的變異體。上述相應角質酶變異體的實例是來自盤長孢狀毛盤孢角質酶的變異體Asp172Lys或D172K。
根據本發明的另一方面，提供生產本發明角質酶變異體的方法。產生天然角質酶的微生物一般是植物病原體，並且這些微生物不太適合作為修飾角質酶基因的宿主細胞。因此，將編碼修飾的(前)角質酶的基因整合到rDNA載體中。可將該載體轉移到對於rDNA技術優選的宿主微生物中。為了達到這一目的，可以使用與WO-A-90/09446中描述的rDNA載體基本相似的rDNA載體。
產生天然角質酶的微生物不太適合發酵方法。為了提高發酵過程的產率，應將編碼改進的角質酶的基因轉移到可在廉價的培養基上快速生長並能合成和分泌大量角質酶的微生物中。根據本發明，上述適宜的rDNA修飾的宿主微生物是細胞，連同其它一道的，芽孢菌、棒狀桿菌、葡萄球菌和鏈黴菌，或低等真核生物，如啤酒酵母及有關的種，馬克斯克魯維氏酵母和相關的種，多形漢遜氏酵母和有關的種，以及麴黴菌屬的種。優選的宿主微生物是低等真核生物，由於這些微生物在發酵過程中能夠很好地生產並分泌酶並能夠使角質酶分子糖基化。糖基化作用可以影響角質酶在洗滌劑系統中的穩定性。
本發明也提供通過將修飾的真核角質酶基因(如來自茄病鐮孢的基因)導入克隆的rDNA載體而得到的遺傳工程物質，以及它們轉化新宿主細胞並在新宿主細胞中表達角質酶變異體基因的用途。
本發明也提供用rDNA技術生產或修飾的多核苷酸(它編碼上述的角質酶變異體)，含所述多核苷酸的rDNA載體，以及含所述多核苷酸和/或所述rDNA載體的rDNA修飾的微生物。本發明也提供編碼修飾的真核角質酶的相應多核苷酸，例如，一種具有編碼成熟角質酶變異體的鹼基序列的多核苷酸，在多核苷酸中，在最後的轉譯密碼子後接著終止密碼子，並且可選擇地直接在編碼成熟角質酶變異體的核苷酸序列上遊，有編碼該角質酶變異體前原-或前-序列的核苷酸序列。
在上述多核苷酸中，可以修飾得自原生物的編碼角質酶的核苷酸序列，以便將至少一個密碼子，且最好是儘可能多的密碼子加工成「無症狀」突變的主體以形成編碼相同胺基酸殘基的密碼子，並作為新宿主優選的密碼子，由此提供在上述宿主細胞中使用的，用於改善穩定性的導入基因的信使-RNA。
在編碼前-或成熟角質酶的核苷酸序列的上遊，可安放一種編碼適用於所選宿主的信號或分泌序列的核苷酸序列。因此，本發明的一個實施方案涉及將編碼角質酶變異體或其前體的核苷酸序列插入於其中的rDNA載體。
核苷酸序列可以得自例如(a)一種天然產生的核苷酸序列(如，編碼由茄病鐮孢產生的前原-或前-角質酶的原胺基酸序列);
(b)化學合成的核苷酸序列(由對於新宿主優選的密碼子組子)，和導致新宿主中穩定的信使RNA的核苷酸序列，還編碼原胺基酸序列;
(c)得自前面段落a或b中提到的，編碼茄病鐮孢角質酶的核苷酸序列之一的遺傳工程方法加工的核苷酸序列，它具有不同的胺基酸序列但在洗滌劑系統中有更好的穩定性和/或活性。
總之，在優選的宿主之一中，能直接表達編碼上述角質酶基因的核苷酸序列的rDNA載體最好含有下列組分(a)編碼成熟角質酶或前角質酶或相應的前角質酶的雙鏈(ds)DNA，其中至少已將部分前序列直接從分泌信號(對於所選的宿主細胞是優選的)的下遊除去。如果應被轉譯的基因部分未從密碼子ATG開始，則應把ATG密碼子放在前面。轉譯部分的基因應總是由適當的終止密碼子來結束;
(b)一個表達調節子(適用於所選的宿主物)，位於編碼角質酶(組分(a))的dsDNA正鏈上遊;
(c)一個終止序列(適用於所選的宿主生物)，位於編碼角質碼(組分(a))的dsDNA的正鏈上遊;
(d1)有利於整合到所選宿主基因組中的dsDNA的核苷酸序列或，(d2)適用於所選宿主的複製原點;
(e1)選擇性地(營養缺陷型)選擇標記。營養缺陷型標記可以由營養缺陷型標記的編碼區和缺損啟動子組成;
(e2)可選擇地，編碼蛋白質的dsDNA序列，所述蛋白質涉及在所選的宿主中，角質酶前體形式之一的成熟和/或分泌。
上述rDNA載體還可攜帶(如前定義的多核苷酸的上遊和/或下遊)其它可促進角質酶功能表達的序列。營養缺陷型標記可以由營養缺陷型標記的編碼區和缺損啟動子區組成。
本發明的另一實施方案是發酵生產上述各種角質酶變異體中的一種。所述發酵可以是一般的間接發酵，分批加料發酵或連續發酵。所用的方法的選擇取決於宿主菌株和優選的下遊加工方法(已知的本身)。因此，本發明也提供用於生產本文所說明的角質酶變異體的方法，包括發酵培養一種rDNA修飾的微生物的步驟，該微生物含rDNA技術加工的基因，該基因攜帶至少一個影響角質酶胺基酸序列的突變，由於使該角質酶具有與相應母體酶相比改善的活性，通過從發酵液中分離由微生物生產的角質酶，或從發酵液中分離微生物細胞來製備角質酶變異體，破碎分離的細胞，用物理或化學濃縮或純化方法從所述發酵液或所述細胞中濃縮或純化角質酶變異體。選擇優選的條件以便由微生物將角質酶變異體分泌到發酵液中，用過濾或離心除去細胞後，從發酵液中回收酶。可選擇地，然後可將角質酶變異體濃縮並純化至所需的程度。除微生物的特殊性質外，這些發酵方法本身可以是以已知的發酵技術和常規使用的發酵和下遊加工設備為基礎的。
本發明也提供用rDNA技術生產改變過的微生物的方法，該微生物能夠生產角質酶變異體，其特徵在於將導入微生物的編碼角質酶變異體的基因連接在其5′-末端以得到一個編碼(修飾的)前序列功能的基因片段作為宿主生物的信號-或-分泌序列。
根據本發明的另一方面，提供rDNA修飾的含角質酶變異體基因並能生產由所述基因編碼角質酶變異體的微生物，在rDNA修飾的微生物中，最好除去(如，由另一個結構基因代替)編碼天然角質酶的基因(如果原來存在)。
根據本發明的另一方面，提供含有本發明角質酶變異體的酶洗滌劑組合物。上述組合物由角質酶變異體和在洗滌劑系統中常用的其它組分(包括用於洗滌劑組合物和全配方洗滌劑和清洗組合物的附加成分，如已知本身種類和如在EP-A-258，068中描述的)。特別是，它們可含有5-60，最好是20-50%重的脫垢助洗劑和0.1-50%重的活性系統，依次含有0-95%重的一種或多各陰離子表面活性劑和5-100%重的一種或多種非離子表面活性劑。
上述洗滌劑組合物的其它組分可以是任何已知種類的，如GB-A-1，372，034(Unilever);US-A-3，950，277;US-A-4，011，169;EP-A-179，533(Procter Gamble);EP-A-205，208和EP-A-206，390(Unilever);JP-A-63-078000(1988)和1988.6月的Research Diclosure 29056，中所描述的，及本文提及的幾個說明書中的每一種(所有文獻均引入本文作為參考)。
可以以任何穩定的形式，即顆粒組合物酶溶液或淤漿，或與載體物質(如EP-A-258，068和Novo Nordisk Savinase(TM)和Lipolase(TM)產品中的)形式，將本發明的角質酶變異體可有效地加到洗滌劑組合物中。
可以在很寬的範圍內選擇角質酶變異體的加入量，如每克10-20，000LU，且最好是每克洗滌劑組合物50-2，000LU。
在本說明書中，LU或脂酶單位按它們在EP-A-258，068(Novo Nordisk)中所定義的。
在其它酶也可以是現存的情況下，在細節上已作必要修正時，相似考慮可以應用。同樣參見歐洲專利申請EP-A-407，225。
在蛋白酶與角質酶一起存在的上述洗滌劑組合物中，可得到更多的益處，從pl低於10的蛋白酶中選擇上述蛋白酶。EP-A-271，154(Unilever)描述了大量這樣的蛋白酶。在特定環境下，與角質酶一起使用的蛋白酶可包括文獻中所公開的如BPN′型或許多類型的枯草桿菌蛋白酶，其中一部分已用於洗滌劑用途，如EP-A-130，756或EP-A-251，446(兩者均屬Genetech);US-A-4，760，025(Genencor);EP-A-214，435(Henkel);WO-A-87/04661(Amgen);WO-A-87/05050(Genex);Thomas等人(1986/5)Nature 316，375-376和(1987)J.Mol.Biol.193，803-813;Russel等人(1987)Nature 328，496-500中描述的突變體蛋白酶。
現在用下列實施例進一步說明本發明，除另外說明外，基本上按Sambrook等人(1989)的描述完成用於操作和分析核酸物質的所有技術。
附圖圖1A合成的茄病鐮孢角質酶基因盒1與構成的寡核苷酸的核苷酸序列。在盒序列中標明了寡核苷酸鹼基轉換。小寫字母表示開放閱讀框架外的核苷酸位置。
圖1B合成的茄病鐮孢角質酶基因盒2和構成的寡核苷酸的核苷酸序列。在盒序列中標明了寡核苷酸的鹼基轉換。
圖1C合成的茄病鐮孢角質酶基因盒3和構成的寡核苷酸的核苷酸序列。在盒序列中標明了寡核苷酸的鹼基轉換圖1D編碼茄病鐮孢前-原-角質酶的合成的角質酶基因的核苷酸序列。標明了角質酶的前-序列，原-序列和成熟序列。也標明了用於克隆和寡核苷酸鹼基轉換的位點，小寫字母指開放閱讀框架外的核苷酸位置。
圖2合成的DNA片段的核苷酸序列，用於連接茄病鐮孢原-角質酶編碼序列與編碼大腸桿菌phoA前-序列衍生物的序列。標明了核糖體結合位點(RBS)和用克隆的限制酶位點。用一個字母密碼也標明可被編碼的phoA信號序列的胺基酸序列和部分角質酶基因。
圖3盒8的核苷酸序列，SacⅠ-BclⅠ片段編碼有關蔗糖酶前-序列編碼序列和成熟茄病鐮孢角質酶的融合點。
圖4通過從pUR2740缺失一個0.2kb SalⅠ-NruⅠ得到的質粒pUR2741是一個大腸桿菌-啤酒酵母穿梭載體，含有部分pBR322，從2μm質粒得到的酵母細胞中的複製原點，一個酵母leu 2D基因及在酵母ga17啟動子控制下的酵母蔗糖酶信號序列編碼區與植物α-半乳糖苷酶基因的融合。
圖5質粒pUR7219是大腸桿菌-啤酒酵母穿梭載體，含有部分pBR322，從2μm質粒中得到的酵母細胞中的複製原點，一個酵母Leu2D基因及在酵母ga17啟動子控制下的酵母蔗糖酶信號序列編碼區與編碼成熟茄病鐮孢角質酶的區域的融合。
圖6質粒pUR2740是一種大腸桿菌-啤酒酵母穿梭載體，含有部分pBR322，從2μm質粒得到的酵母細胞中的複製原點，一個酵母Leu2D基因及在酵母ga17啟動子控制下的酵母蔗糖酶信號序列編碼區與植物α-半乳糖苷酶基因的融合。
圖7盒5，6和7核苷酸序列，含有ex1A前一序列和成熟茄病鐮孢角質酶編碼序列的不同類型的接頭。
圖8通過在pUC19的SalⅠ位點插入黑色麴黴awamori變種基因組DNA的5.3kbSalⅠ片段得到的質粒pAW14B。
圖9通過用BspHⅠ-AflⅡ片段代替含有ex1A開放閱讀框架的BspHⅠ-AflⅡ片段得到的質粒pUR7280，含有茄病鐮孢前-原-角質酶編碼序列。因此，質粒pUR7280含有在黑色麴黴awamori變種啟動子和終止子控制下的茄病鐮孢前-原-角質酶基因。
圖10通過將黑色麴黴amds和黑色麴黴awamori變種pyrG選擇標記導入pUR7280而得到的質粒pUR7281。
圖11Fusarium solani pisi角質酶分子的示意12Fusarium solani pisi Colletotrichum capsici盤長孢狀毛盤孢和Magnaporthe grisea角質酶的部分胺基酸序列，表明了在3-D結構中，殘基的位置。
圖13茄病鐮孢角質酶和角質酶變異體N172K的洗滌用效果。
圖14茄病鐮孢角質酶和角質酶變異體E201K的洗滌用效果。
圖15茄病鐮孢角質酶和角質酶咳A85F的洗滌用效果。
參考資料Sambrook，J.，Fritsch，E.F.and Maniatis，T.(1989).Molecular Cloninga laboratory manual(2nd ed).Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York.ISNB 0-87969-309-6.
Fürste，J.P.，Pansegrau，W.，Frank，R.，Bl
cker，H.，Scholz，P.Bagdasarian，M.and Lanka，E.(1986).Molecular cloning of the plasmid RP4 primase region in a multi-host-range tacp expression vector.Gene 48，119-131.
Michaelis et al.(1983).J.Bacteriol 154，366-Tartof and Hobbs(1988).Gene 67，169-182.
Soliday，C.L.，Flurkey，W.H，Okita，T.W.and Kolattukudy，P.E.(1984).Cloning and structure determination of cDNA for cutinase，an enzyme involved in fungal penetration of plants.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81，3939-3943.
Noqi，Y.and Fukasawa，T.(1983).Nucleotide sequence of the transcriptional initiation region of the yeast GAL7 gene.
Nucleic Acids Res.11，8555-8568.
Taussiq，R.and Carlsson，M.(1983).Nucleotide sequence of the yeast SUC2 gene for invertase.Nucleic Acids Res.11，1943-1954.
Erhart，E and Hollenberg，C.P.(1981)Curing of Saccharomyces cerevisiae 2-μm DNA by transformation.Curr.Genet.3，83-89.Verbakel，J.A.M.V.(1991)Heterologous gene expression in the yeast Saccharomyces cerevisiae.Ph.D.thesis.Rijks Universiteit Utrecht，The Netherlands.
Maat，J.，Roza，M.，Verbakel，J.，Stam，J.，Santos da Silva，M.J.，Bosse，M.，Egmond，M.R.，Hagemans，M.L.D.，V.Gorcom，R.F.M.，Hessing，J.G.M.，v.d.Hondel，C.A.M.J.J.and v.
Rotterdam，C.(1992).Xylanases and their application in bakery.InVisser，J.，Beldman，G.，Kusters-van Someren，M.A.and Voragen，A.G.J.(Eds)，Xylans and Xylanases.
Progress in Biotechnology Volume 7，Elsevier Science Publishers，Amsterdam.ISBN 0-444-89477-2.
R6和R7各自獨立地代表氫，或任意取代的烷基、鏈烯基、炔基、環烷基、環烷基烷基、環烷氧基羰基、芳基或芳烷基;
所述方法包括a)適宜時，在稀釋劑和反應助劑存在下，將式(Ⅱ)的1H-三唑啉酮
(Ⅱ)(其中R1、R2和X的定義同前)，與式(Ⅲ)的滷代苯衍生物反應，
(Ⅲ)(其中R3、R4和R5的定義同前，Hal代表滷素);或b)適宜時，在稀釋劑和反應助劑存在下，將式(Ⅰa)的取代的三唑啉酮
(Ⅰa)(其中R1、R2、R3、R5和X的定義同前，R8代表滷素)，與式(Ⅳ)的親核試劑反應，R9-Z-H(Ⅳ)其中Z代表氧、硫或基團-N(R7)-，
實施例1;
構建編碼茄病鐮孢前-原-角質酶的合成基因。
基本上按EP-A-407225(Unilever)中的描述構建編碼茄病鐮孢前-原-角質酶的合成基因。以公開的茄病鐮孢基的核苷酸序列(Soliday等人，(1984)和WO-A90/09446，Plant Genetic Systems)為基礎，設計一個完全的合成DNA片段，它含有編碼茄病鐮孢前-原-角質酶多肽的區域。與原始的茄病鐮孢基因序列相比，通過該基因內適當的位置導入限制酶識別位點而不影響被編碼的胺基酸序列，該合成的角質酶基因含有幾個核苷酸的變化。在圖1D中展現了完整合成角質酶基因的核苷酸序列。
從合成的DNA寡核苷酸開始，通過組合三個單獨的盒，完成合成角質酶基因的構建。將每個合成DNA盒在起始端加上一個EcoRⅠ位點，在末端加一個HindⅢ位點。用Applied Biosystems 380A DNA合成儀合成寡核苷酸並用聚丙烯醯胺凝膠電泳純化。為了構建每個盒，接著用下列概述的方法。將構成一個所給定盒的等摩爾量(50pmol)寡核苷酸混合，在其5′-末端磷酸化，退火併按標準技術連接。用EcoRⅠ和HindⅢ切割所得的雙鏈DNA混合物，用瓊脂糖凝膠電泳按大小分級分離，並用電洗脫從凝膠中回收。將所得的合成DNA盒與PUC9的2.7kbEcoRⅠ-HindⅢ片段連接並轉化大腸桿菌。用適宜的寡核苷酸引物以兩個方向對大量克隆的EcoRⅠ-HindⅢ插入物作完全定序以確定合成盒的序列。用這種方法，構建pUR7207(合盒1，圖1A)，pUR7208(合盒2，圖1B)和pUR7209(含盒3，圖1C)。最後，通過將pUR7207的2.9kbEcoRⅠ-ApaⅠ片段與pUR7208的0.2kbApaⅠ-NheⅠ片段和pUR7209的0.3kbNheⅠ-HindⅢ片段結合在一起產生pUR7210，組成合成角質酶基因。該質粒含有一個編碼完整茄病鐮孢前-原-角質酶的開放閱讀框架(圖1D)。
實施例2在大腸桿菌中表達茄病鐮孢(原)角質酶用合成的角質酶基因構建大腸桿菌表達載體，其與WO-A-90/09446(Plant Genetic Systems)中描述的一種功能上相似。設計一個構建體，其中適當的大腸桿菌表達信號在編碼茄病鐮孢原-角質酶的合成基因部分之前，這些信號即，(ⅰ)一個可誘導的啟動子，(ⅱ)一個核糖體結合位點和(ⅲ)一個信號序列，該序列提供轉譯起始信密碼子並提供將原-角質酶運出胞質膜所需的信息。
設計一個合成連接子(見圖2)以便將大腸桿菌phoA信號序列(Michaelis等人，1983)的衍生物與合成角質酶基因的原序列融合。為了使信號肽的斷裂及原-角質酶的分泌達到最佳水平，所述接頭的核苷酸序列便於將該連接子核苷酸序列phoA信號序列的3個C-末端胺基酸殘基(Thr-Lys-Ala)變成Ala-Asn-Ala並將角質酶原序列的N-末端胺基酸殘基(Leu1，見圖1D)變成Ala。該構建確保將角質酶分泌到外周胞質空間(參見WO-A90/09446，Plant Genetic Systems)。
為了得到上述構建體，從pUR7210中除去含角質酶前-序列和部分原-序列的69bpEcoRⅠ-SpeⅠ片段並用合成的DNA連接子序列(EcoRⅠ-SpeⅠ片段)代替，該連接子序列提供大腸桿菌phoA前序列的衍生物以及角質酶原-序列的改變的N-末端胺基酸殘基(圖2)。將所得的質粒命名為pUR7250並將其用於0.7kbBamHⅠ-HindⅢ片段的分離，該片段含一個核糖體結合位點和與phoA信號序列編碼區融合的原-角質酶編碼區。將該片段與pMMB67EH(Fürste等人，1986)的8.9kb BamHⅠ-HindⅢ片段連接以得到pUR7220。在該質粒中將編碼原-角質酶的合成基因與phoA信號序列的改變的變體融合，並置於可誘導的tac-啟動子的控制下。
在2升含0.5升ⅨTB培養基(Tartof和Hobbs，1988)的搖瓶中生長含pUR7220的大腸桿菌菌株WK6，ⅨTB培養基由下列組成0.017MKH2PO40.017MK2HPO412g/1Bacto-胰蛋白腖24g/1Bacto-酵母提取物0.4%甘油(V/V)在劇烈的振蕩(150rpm)下，在存在100μg/ml氨苄青黴素的情況下，使培養物於25℃-30℃生長過夜至610nm處OD值為10-12。然後，將IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷)加到10μm的終濃度，並繼續溫育另一個12-16小時。當可觀察到生產的脂解活性量沒有進一步顯著增加(通過分析從培養物取出的樣品來判斷)時，通過離心收集細胞，並於0℃將其再懸於原培養體積的含20%蔗糖的緩衝液中。通過離心收集細胞，並將其再懸於原培養體積的冰冷水中，通過滲透休克溶解細胞。通過離心除去細胞碎片，用乙酸將無細胞提取物酸化至PH4.8，於4℃過夜，除去所得的沉澱。通過超濾及冷凍乾燥無細胞提取物，在該步可得到基本上沒有外源脂酶，純度大於75%的角質酶製品。另外，通過將酸化的細胞游離提取物負載到SP-sephadex，用PH8.0的緩衝液洗脫酶，濃縮鹼溶液通過一個適宜的DEAE-纖維素(Whatman DE-52)柱並直接使DEAE流到Q-sepharose HP(Pharmacia)柱，可將角質酶純化到勻質(即，純度大於95%)。用鹽梯度洗脫得到一般總產率大於75%的勻質角質酶製品。
實施例3構建編碼茄病鐮孢角質酶變異體的基因用實施例1中描述的茄病鐮孢前-原-角質酶的合成基因，構建被編碼的胺基酸序列中有改變的變異體基因。為了完成該構建，使用與實施例1中描述的基本相同的方法構建組成完全合成角質酶基因的三個盒。例如，用與實施例1中描述的相同的寡核苷酸(除覆蓋被誘變位置(即，Asn 172)的編碼三聯體的兩個寡核苷酸不同外)，通過裝配一種新型的盒3來構建編碼茄病鐮孢角質酶變異體N172K的基因。而使用兩個含突變序列的新的合成寡核苷酸，但在其它方面與它們取代的原寡核苷酸相同。特別是，通過摻入CUT13DMH變異體(含AAG代替AAT)和CUT13KMH變異體(含CTT代替ATT)代替CUT13DMH和CUT13KMH(見圖1C)，裝配含突變N172K的新盒3。基本上按實施1所述克隆並定序新盒3，並將含突變的0.3kb NheⅠ-HindⅢ DNA片段換成pUR7210中的相應片段，得到pUR7257(N172K)。用來自該質粒的0.6KSpeⅠ-HindⅢ片段代替pUR7220中相應片段，得到大腸桿菌表達質粒pUR7224(N172K)。用該大腸桿菌表達質粒轉化大腸桿菌菌株WK6。按實施例2中的描述使轉化體生長，並基本按實施例2中的描述回收並純化變異體原-角質酶。
以類似的方法，通過摻入CUT13FMH變異體(含AAG代替GAG)和CUT13MMH變異體(含CTT代替CTC)代替CUT13FMH和CUT13MMH(見圖1C)組建一種新的盒3，從而構建編碼茄病鐮孢角質酶變異體E201K的基因。
以類似的方法，通過摻入CUT12CMH變異體(含TTC代替GCT)和CUT121MH變異體(含GAA代替AGC)代替CUT12CMH和CUT121MH(見圖1B)組建新的盒2，從而構建編碼茄病鐮孢，角質酶變異體A85F的基因。
實施例4在啤酒酵母中表達茄病鐮孢角質酶為了在啤酒酵母中表達合成的茄病鐮孢角質酶基因，構建一個表達載體，其中啤酒酵母蔗糖酶(Taussig和Carlsson，1983)的前序列和強的，可誘導ga17啟動子(Nogi和Fukasawa，1983)在編碼成熟角質酶的合成基因之前。為了製備有關上述融合的合成角質酶基因，合成一個銜接頭片段，其中將有關蔗糖酶前序列的編碼區與編碼成熟角質酶N-末端的序列融合。基本上按實施例1中的描述(盒8，見圖3)，將該片段在pUC9中組合成EcoRⅠ-HindⅢ盒，得到pUR7217。將質粒pUR7210和pUR7217轉化到大腸桿菌JM110(一種沒有母本甲基酶活性的菌株)中，並將pUR7217的2.8kbBclⅠ-HindⅢ片段與pUR7210的0.6kbBclⅠ-HindⅢ片段連接，產生pUR7218，其中將編碼成熟酶肽的核苷酸序列與部分啤酒酵母蔗糖酶前序列編碼區融合。
通過分離pUR2740的8.9kb NruⅠ-SalⅠ片段，用klenow聚合酶填平SalⅠ延伸的末端，並使片段再環化，從而從pUR2740(Verbakel，1991，見圖6)製得表達載體pUR2741(見圖4)。將pUR2741的7.3kbSacⅠ-HindⅢ片段與pUR7218的0.7kbSacⅠ-HindⅢ片段連接，得到pUR7219(見圖5)。可選擇地，將啤酒酵母polⅡ終止子放在角質酶基因後，HindⅢ位點中，證明它對於角質酶基因的有效表達不是必需的。大腸桿菌-啤酒酵母穿梭質粒PUR7219含有於攜帶2μ質粒的啤酒酵母菌株(Cir+菌株)中起作用的複製原點，使得可選擇啤酒酵母leu2-菌株中高拷貝量轉化體的啟動子-缺陷性的啤酒酵母leu2基因，在強的，可誘導啤酒酵母ga17啟動子調控下的與啤酒酵母蔗糖酶前-序列相連的編碼成熟部分茄病鐮孢角質酶的合成基因。
用有關酵母細胞電穿孔的標準方法，用2μ啤酒酵母質粒和pUR7219的等摩爾混合物共轉化與菌株YT6-2-1L(Erhart和Hollenberg，1981)相同的啤酒酵母菌株SU50(a，cir，Leu2，his4，can1)。篩選亮氨酸原養型轉化體，並從許多轉化體中分離總DNA。所有轉化體似乎均含2μ質粒和pUR7219，例證為，由於同時存在2μ酵母質粒，所以若存在高拷貝數時，pUR7219所含的啟動子-缺陷型Leu2基因可僅能從功能補充Leu2缺陷型菌株。通過在完全培養基上培養40代，接著在選擇和完全固體培養基上影印培養，得到啤酒酵母菌株SU51(a，Cir+，leu2，his4，can1)。而一個轉化體穩定地含有pUR7219質粒。
使含pUR7219的啤酒酵母菌株SU51在含0.2升MM培養基的1升搖瓶中生長，MM培養基由下列組成-沒有胺基酸的酵母氮成分(YNB) 6.7g/l-組氨酸 20mg/l-葡萄糖 20g/l使培養物在劇烈振蕩(150rpm)下。於30℃生長過夜到610nm的OD值為2-4。離心收集細胞並將其再懸於2升搖瓶中的1升YPGAL培養基，YPGAL培養基有下列組成-酵母提取物 10g/l-細菌用蛋白腖 20g/l-半乳糖 50g/l並繼續再培養12-16小時。以有規律時間間隔從培養中取出樣品並離心以除去生物質。用橄欖油作為底物，通過效價滴定檢測，分析上清液的角質酶活性。對於每個樣品，將100到200μl間的濾液加到5.0ml脂酶底物(Sigma，含作為脂酶底物的橄欖油)和25.0ml緩衝液(5mM Tris-HCl pH9.0，40mM NaCl，20mM CaCl2)的攪拌混合物中。在30℃完成檢測，並使用Mettler DL25滴定儀，通過用0.05M NaOH自動滴定到pH9.0，來測量脂肪酸的釋放。得到對時間的滴定劑量曲線。從曲線的最大斜率計算樣品中所含的脂酶量。將1個單位的酶活性定義為在上述定義的條件下，1分鐘內從橄欖油釋放1μmol脂肪酸的酶量。上述測定法是本領域專業人員熟知的。
當角質酶活性不再提高時，通過離心除去細胞，用乙酸將無細胞提取物酸化至pH4.8，並按實施例1描述回收角質酶。
實施例5在啤酒酵母中表達茄病鐮孢角質酶變異體以下列方式，在啤酒酵母中表達茄病鐮孢角質酶的變異體N176k。用pUR7257(N172K)的0.5kb ApaⅠ-HindⅢ片段代替pUR7218的類似片段，得到pUR7228(N172K)，其中將含突變的該基因與編碼啤酒酵母信號序列的序列進行可操作的融合，將pUR2741的7.0kbSacⅠ-HindⅢ片段與pUR7228(N172K)的0.7kbSacⅠ-HindⅢ片段連接，得到pUR7234(N172K)。用該質粒轉化啤酒酵母菌株SU51。按實施例4中的描述培養所得的轉化體，並按實施例4和1中的描述，從培養液中回收生產的變異體酶。
按實施例3中的描述，用編碼角質酶變異體E201K的茄病鐮孢基因變異體以相同的方式在啤酒酵母中生產茄病鐮孢角質酶變異體E201K。
按實施例3中的描述，用編碼角質酶變異體A85F的茄病鐮孢角質酶基因變異體以相同的方式，在啤酒酵母中生產茄病鐮孢pisi角質酶變異體A85F。
實施例6在麴黴菌中表達茄病鐮孢角質酶為了在黑色麴黴awamori變種中表達合成的茄病鐮孢角質酶基因，構建一個表達形體，其中將編碼茄病鐮孢前-原-角質酶的合成基因置於黑色麴黴awamori變種強的，可誘導exlA啟動子(Maat等人，1992，de Graaff等人，1992)的控制下。
從質粒pAW14B開始構建前-原-角質酶表達質粒(pUR7280)，pAW14B於1990.5.31保藏在大腸桿菌菌株JM109中，寄存於Centraalbureau voor Schimmelcultures，Baarn，The Netherland，保藏號為No CBS237.90，該質粒含有在其上定位了一個0.7kb內切木聚糖酶Ⅱ(exlA)基因的約5.3kbSaLⅠ片段，及2.5kb的5′-側序列和2.3kb的3′-側序列(圖8)。在pAW14B中，用前-原角質酶編碼區代替exlA編碼區。含有ex1A基因第一密碼子(ATG)的BspHⅠ位點(5′-TCATGA-3′)和含有ex1A基因終止密碼子(TAA)的AflⅡ位點(5′-CTTAAG-3′)有利於pUR7280的構建。
按如下完成構建用BspHⅠ部分切割pAW14B(7.9kb)並從瓊脂糖凝膠中分離線性化的質粒(7.9kb)。隨後，用BsmⅠ切割分離的7.9kb片段，切割所需BspHⅠ位點下遊的少數核苷酸，以除去在其它BspHⅠ位點線性化的質粒，在瓊脂糖凝膠上分離開片段，並分離7.9kbBspHⅠ-BsmⅠ片段。用AflⅡ部分切割該片段，並分離得到的7.2kbBspHⅠ-AflⅡ片段。
將含有編碼茄病鐮孢前-原-角質酶的完整開放閱讀框架的pUR7310的0.7kb BspHⅠ-AflⅡ片段與pAW14B的7.2kbBspHⅠ-AflⅡ片段連接，得到pUR7280。隨後，可將構建的載體(pUR7280)用常規的共轉化技術轉移到黴菌(如黑色麴黴，黑色麴黴awamori變種，等)中，並然後經內切木聚糖酶啟動子的誘導而表達前-原-角質酶基因。也可以經構建的rDNA載體提供常規的選擇標記(如amds或pyrG，潮黴素，等)並用所得的rDNA載體轉化黴菌以生產所需的蛋白質。作為一個實施例，將amds和pyrG選擇標記導入表達載體，得到pUR7281(圖10)。為了達到該目的，用合成的寡核苷酸(5′-AATTGCGGCCGC-3′)通過將EcoRⅠ位點(存在於前-原-角質酶基因ATG密碼子上遊的1.2kb)變成NotⅠ位點，產生NotⅠ位點，得到pUR7282。給含有完整構巢麴黴amds基因和黑色麴黴awamori變種pyrG基因以及它們各自的啟動子和終止子的適當DNA片段提供位於側面的NotⅠ位點，並將其導入pUR7282的NotⅠ位點，得到pUR7281(圖10)。
作為在黑色麴黴awamori變種中表達合成的茄病鐮孢角質酶基因的另一種方法，構建表達載體，其中不是成熟角質酶自己的前-原-序列而是黑色麴黴awamori變種exlA的前-序列，在編碼成熟角質酶的合成基因之前。
為了製備上述融合體的合成角質酶基因，合成幾個銜接子片段，其中，以不同的方式，將exlA前-序列的編碼序列與編碼成熟角質酶N-末端的序列相連。在盒5中，這種連接是通過將exlA前-序列與角質酶的前-序列融合而完成的。在盒6中，將exlA前-序列與成熟角質酶的N-末端殘基融合。盒7與盒6相同，但為了更好地滿足裂解信號肽的需要，將被編碼的成熟角質酶多肽的N-末端殘基從原來的甘氨酸變成絲氨酸。基本按實施例1中的描述從合成的寡核苷酸組合盒5、6和7(見圖7)。用盒5代替pUR7210的0.1kb EcoRⅠ-SpeⅠ片段，得到pUR7287。分別用盒6和7代替pUR7210的0.1kbEcoRⅠ-BclⅠ片段，得到pUR7288和pUR7289，分別將0.7kb BspHⅠ-AflⅡ片段與pAW14B的7.2kb BspHⅠ-AflⅡ片段連接，得到pUR7290，pUR7291，pUR7292。
隨後，用常規的共轉化技術，將構建的rDNA載體轉移到黴菌(黑色麴黴，黑色麴黴awamori變種)中並通過誘導內切木聚糖酶Ⅱ啟動子表達前-(原)-角質酶基因。也可給構建的rDNA載體提供常規的選擇標記(如amds或pyrG，潮黴素)並可用所得的rDNA載體轉化黴菌以生產所需的蛋白質，如在有關pUR7280(見上文)的實施例中說明的那樣。
使用表達載體pUR7280，pUR7281，pUR7290，pUR7291，pUR7292的任一個(含有在黑色麴黴awamori變種exlA啟動子和終止子控制下的帶有或不帶相應的原-序列的茄病鐮孢成熟角質酶編碼區及或者角質酶信號序列或者exlA信號序列)轉化的麴黴菌株在下列條件下生長用孢子(終濃度10E6/ml)接種多個含400ml合成培養基(pH6.5)的1升搖瓶。該培養有下列組合物(AW培養基)
蔗糖 10g/lNaNO36.0g/lKCl 0.52g/lKH2PO41.52g/lMgSO4·7H2O 0.49g/l酵母提取物 1.0g/lZnSO4·7H2O 22mg/lH3BO311mg/lMnCl2·4H2O 5mg/lFeSO4·4H2O 5mg/lCaCl2·6H2O 1.7mg/lCuSO4·5H2O 1.6mg/lNaH2MoO4·2H2O 1.5mg/lNa2EDTA 50mg/l在MK X恆溫箱振蕩器中，於30℃，以200rpm溫育24小時。生長後，過濾(0.45μm濾器)收集細胞，用沒有蔗糖和酵母提取物的AW培養基(鹽溶液)洗滌兩次，再懸於50ml鹽溶液並轉移至含50ml鹽溶液的300ml搖瓶中，向該鹽溶液中加入木糖至10g/l的終濃度(誘導培養基)。按與上述相同的條件繼續培養過夜。通過miracloth過濾所得的培養物以除去生物質並基本按實施例2中的描述回收角質酶。
實施例7在麴黴菌中表達茄病鐮孢角質酶變異體。
基本上按照實施例6中描述的途徑，但現在用pUR7257(N172K)代替pUR7210構建真菌表達載體，在黑色麴黴awamori變種中生產含有突變N172K的茄病鐮孢角質酶變異體。
實施例8鑑別並分離與茄病鐮孢角質酶基因有關的基因從不同的真菌中分離編碼角質酶的基因，所述角質酶與茄病鐮孢角質酶有不同程度的同源性。使真菌培養物在500ml搖瓶中生長，該搖瓶含Hankin和Kolattukudy(1968)描述的，用0.25%葡萄糖補充的培養基，並在MKX恆溫器振蕩器(100rpm)中於28℃培養4天。此時，葡萄糖已被消耗掉，並基本按Ettinger等人的描述(1987)，通過加入角質素水解產物誘導角質酶生產。從培養物中以有規律的間隔取出樣品，並按標準技術分析脂解活性的存在(見實施例4)。正常地，誘導後約兩天後，可以證明脂解活性，此時，用標準技術過濾收集細胞。洗滌菌絲體，將其冷凍在液氮中，並按標準技術凍幹。基本按Sambrook等人的描述(1989)用硫氰酸胍法分離總細胞RNA製品，並用氯化銫密度梯度離心純化。用PolyAT束mRNA分離盒(Promga)分離polyA(+)mRNA部分。按標準技術，用茄病鐮孢角質酶基因的cDNA片段作探針，將polyA(+)mRNA部分用於Northern雜交分析以確定角質酶-有關的基因的表達。按供應商的說明用ZAP cDNA合成盒(Stratagene，La Jolla)對含有能與探針雜交的物質的mRNA製品作cDNA分析，產生的cDNA片段帶有位於poly-A區側面的XhoⅠ粘性末端並在另一末端有一個EcoRⅠ接頭。通過在λZAPⅡ載體(Stratagene，La Jolla)中以意義方法直接克隆，用獲得的cDNA片段構建表達文庫，使得表達β-半乳糖苷酶融合蛋白(Huse等人，1988)。用抗茄病鐮孢角質酶抗血清篩選這些文庫。
另外，用角質酶特異的引物(見表2)，使合成的cDNA部分經PCR-篩選。這些引物得自數種真菌角質酶基因(Ettinger等人，1987)的胺基酸序列的比較。選擇對每套引物最佳的PCR反應條件，用茄病鐮孢角質酶作對照。在相同的條件下，可以用與由茄病鐮孢角質酶的cDNA產生的PCR片段長度相似的(或遠大於之)的長度，生產具有特異PCR片段的cDNA的這些製品，用凝膠電泳純化PCR片段並從凝膠上分離。
作為另一種方法，也可將使用角質酶特異性引物的PCR篩選技術直接用於一些真菌菌株的基因組DNA，用茄病鐮孢的基因組DNA作正對照。在相同條件下，可以用與由茄病鐮孢角質酶的cDNA產生的PCR長度相似的(或遠大於之的)長度，生產具有特異PCR片段的cDNA的這些製品，用凝膠電泳法純化PCR片段並從凝膠上分離。
對於在表達文庫法或PCR篩選法(用cDNA或基因組DNA)中標為陽性的菌株以及大量其它菌株，分離高分子量的基因組DNA。基本按Ettinger等人的描述(1987)使菌株生長，並按Graaff等人的描述(1988)分離基因組DNA。用各種限制酶消化基因組DNA，用類似的cDNA插入片段(表達文庫法)或PCR片段(PCR篩選法)或茄病鐮孢角質酶基因(其它菌株)作探針，用Southern雜交分析，並構建角質酶基因的物理圖譜。經凝膠電泳將適當消化的基因組DNA按大小分級分離，並從凝膠上分離適當大小的片段，並亞克隆在pUC19中。用相應的cDNA插入片段(表達文庫)或PCR片段(PCR篩選法)篩選這些基因組文庫，得到含有角質酶基因的基因組拷貝的克隆。將這些基因以兩個方向定序。通過測定相應的cDNA序列或與其它角質酶序列(Ettinger等人，1987)比較，鑑別內含子。也可從上述比較推測成熟角質酶多肽的N-末端。用標準PCR技術，除去內含子，立即用遺傳工程方法將HindⅢ位點加到開放閱讀框架的下遊，並將啤酒酵母蔗糖酶基因(SacⅠ位點在其之前，比較盒8，圖3)前序列的編碼序列與編碼成熟角質酶N-末端的序列融合。將得到的含有(與編碼啤酒酵母蔗糖酶前-序列的序列可操作相連的)角質酶基因的SacⅠ-HindⅢ片段與pUR7241的7.3kb SacⅠ-HindⅢ片段(見圖4)相連並轉化啤酒酵母菌株SU51。基本按實施例4中的描述，表達真菌角質酶並從將其從培養液中回收。
實施例9茄病鐮孢角質酶變異體N172K的洗滌用活性將角質酶變異體N172K的除脂肪效果與野生型茄病鐮孢角質酶的作比較。在檢測中，用經溴化了的橄欖油弄髒的聚酯檢測布作為檢驗物。用X射線螢光光譜測定法，通過測量檢測布上的溴量，確定檢測布上的脂肪量。
在以下幾種實驗條件下，以3LU/ml的劑量確定野生型茄病鐮孢角質酶(WT)和N172K變異體的酶促去除汙垢量
洗滌劑產品A-C的組分(以%重量計)如下產品A
產品B
產品C
在各種洗滌條件下，有關野生型茄病鐮孢角質酶洗滌用性能(清除油汙)的增強是明顯的。圖13表示用2g/l洗滌劑產品C在30℃，27°FH，洗滌30分鐘後，各種酶濃度的洗滌用性能。
為了比較，也用Lipolase(TM)完成相同的實驗。在所有情況下，角質酶變異體N172K是最好的。
實施例12茄病鐮孢變異體E201K的洗滌用活性。
用2g/l洗滌劑產品C(見實施例11)在30℃，27°FH，洗滌30分鐘後，將各種酶濃度角質酶變異體E201K的脂肪清除效果與野生型茄病鐮孢角質酶的效果作比較。在檢測中，用由溴化了的橄欖油弄髒的聚酯檢測布作檢驗物。用X射線螢光光譜測定法通過測量檢測布上的溴量，確定檢測布上的脂肪量(見上文描述)。
所得的結果列於圖14。有關野生型茄病鐮孢角質酶洗滌用性能(油汙清除)的增強是明顯的。為了比較，用Lipolase(TM)完成相同的實驗。發現E201K角質酶變異體的性能明顯地好。
實施例13茄病鐮孢變異體A85F的洗滌用活性。
用2g/l洗滌劑產品C(見實施例11)，在30℃，27°FH洗滌30分鐘後，將各種酶濃度角質酶變異體A85F的脂肪清除效果與野生型茄病鐮孢角質酶的比較。在檢測中，用由溴化了的橄欖油弄髒的聚酯檢測衣服作檢測物。用X射線螢光光譜測定法，通過測量檢測布上的溴量，確定檢測布上的脂肪量(如上文所述)。
結果列於圖15。有關野生型茄病鐮孢角質酶洗滌用性能(油汙清除)的增強是明顯的。為了比較，同樣用Lipolase(TM)完成相同的實驗。發現A85F角質酶變異體的性能明顯好。
權利要求
1.一種母本角質酶的角質酶變異體，其中胺基酸序列已經以提高酶表面的疏水性方法進行修飾。
2.根據權利要求1的角質酶變異體，其中已提高了與脂接觸區相鄰的酶表面的疏水性以便形成擴大的脂接觸區。
3.根據前面任一權利要求的角質酶變異體，其中，通過用選自纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸的胺基酸殘基取代一個或多個胺基酸殘基，提高了疏水性。
4.根據前面任一權利要求的角質酶變異體，其中，胺基酸序列已經以除提高表面的疏水性外，還導入了一個或多個正電荷的方式進行修飾。
5.根據權利要求4的角質酶變異體，其中通過導入一個或多個賴氨酸或精氨酸殘基導入正電荷。
6.根據前面任一權利要求的角質酶變異體，其中，被取代的胺基酸殘基有短側鏈，且最好選自丙氨酸、絲氨酸或甘氨酸。
7.根據前面任一權利要求的角質酶變異體，其中，母本 角質酶是真核的角質酶。
8.根據前面任一權利要求的角質酶變異體，其中，母本酶是與抗茄病鐮孢角質酶產生的抗體發生免疫交叉反應的角質酶。
9.根據前面任一權利要求的角質酶變異體，其中，母本酶是來自茄病鐮孢的角質酶。
10.根據前面任一權利要求的角質酶變異體，由此，修飾的殘基位於由載體限定的分子部分，(所述載體至少包含茄病鐮孢角質酶殘基116到120的全部Ca-原子，或者不同角質酶的相應Ca-原子)以及定位於與所述載體垂直平面並含有殘基117的Ca-原子，或者不同角質酶相應的Ca-原子。
11.根據前面任一權利要求的角質酶變異體，其中，被修飾的殘基位於與載體垂直的第一平面(所述載體至少包括離殘基117 Ca-原子15
距離的茄病鐮孢角質酶殘基116到120Ca-原子)和與所述第一平面平行的第二平面之間的分子部分且含有殘基117的Ca-原子。
12.根據前面任一權利要求的角質酶變異體，其中，被修飾的殘基位於茄病鐮孢角質酶胺基酸序列的一個或多個下列位置，或不同角質酶的相應位置17、18、19、40、42-46、50、53、54、58、74、75、76、78、80-88、91、92、93、95、96、97、99、100、119、150-156、158、160、168、169、170、172、173、174、176、179、180-190、192、193、194、196、197、198、201。
13.根據前面任一權利要求的角質酶變異體，其中，被修飾的殘基位於茄病鐮孢角質酶胺基酸序列的一個或多個下列位置，或不同角質酶中的相應位置19、41、45、49、54、58、75、76、82、85、92、93、99、100、127、128、172、173、179、183、184、185、189、190、194、197、201。
14.根據前面任一權利要求的角質酶變異體，其中，在茄病鐮孢角質酶的胺基酸序列中，或不同角質酶中的相應位置產生一個或多個下列修飾T19V、G41A、T45K、T45P、＊l49a、S54l、N58R、G75R、A76P、G82AD83S、A85F、A85V、S92R、A93V、L99K、G100R、A127L、A128F、N172K、T173I、T179F、I183F、V184I、A185L、L189F、A190L、D194R、G197V、E201K。
15.根據前面任一權利要求的角質酶變異體，其中，在茄病鐮孢角質酶的胺基酸序列中，或不同角質酶中的相應位置產生一個或多個下列修飾A85F，N172K，E201K。
16.一種生產根據前面任一權利要求的角質酶變異體的方法，包括發酵培養rDNA改進的微生物，該微生物含用rDNA技術加工的編碼角質酶基因的變異體，通過從發酵液分離由所述微生物生產的角質酶變異體，或通過從發酵液中分離所述微生物的細胞，破碎分離的細胞，用物理或化學濃縮或純化方法，濃縮或部分純化來自所述發酵液或所述細胞的角質酶，從而完成角質酶變異體的製備。
17.一種用rDNA載體轉化的並由此能表達所述角質酶變異體的rDNA改進的微生物，所述載體攜帶編碼根據權利要求1到15的任一角質酶變異體的基因。
18.根據權利要求17一種攜帶編碼角質酶變異體的基因的rDNA改進的微生物，通過在所述基因的5′-末端與編碼具有作為宿主生物信號或分泌序列功能的(改進的)前序列的基因片段融合，而將所述基因導入該微生物。
19.根據權利要求17或18的任一rDNA改進的微生物，其中，宿主生物是真核生物，如酵母屬或克魯維氏酵母屬或漢遜氏酵母屬，或麴黴屬的真菌。
20.根據權利要求17到19的任一rDNA改進的微生物，攜帶編碼權利要求1到15的角質酶變異體的重組DNA載體，在所述微生物的一個前代細胞中，已通過編碼營養缺陷型標記的基因進行基因取代而將該微生物加工成營養缺陷型突變體。
21.一種具有編碼根據權利要求1-15任一成熟角質酶變異體的鹼基序列的多核苷酸或其功能等同物或突變體，其中，多核苷酸最好的被轉譯密碼子後接著終止密碼子，且可選擇地含有直接位於編碼該成熟酶的核苷酸序列上遊的，編碼該角質酶前-序列的核苷酸序列。
22.一種具有編碼根據權利要求1-15任一角質酶變異體的鹼基序列的多核苷酸，其中，多核苷酸最後的被轉譯密碼子後接著終止密碼子，且可選擇地含有直接位於編碼該成熟酶的核苷酸序列上遊的，編碼至少部分相應前序列的核苷酸序列，和/或適用於所選擇的宿主生物的信號-或分泌-序列。
23.一種具有編碼根據權利要求1-15任一成熟角質酶變異體的鹼基序列的多核苷酸，或其功能等同物或突變體，其中，已經修飾了得自源生物的角質酶-變異體編碼核苷酸序列，以便至少一個密碼子，且最好是儘可能多的密碼子被加工成「無症狀」突變的主體，從而形成編碼等同胺基酸殘基的密碼子並且是權利要求17到20中特定的新宿主優選的密碼子，由此，在使用時在上述宿主細胞內提供用於改進穩定性的導入基因的信使RNA。
24.權利要求21到23任一多核苷酸，其中，在編碼原-或成熟角質酶變異體的核苷酸序列上遊，有一個編碼適用於權利要求17到20中限定的任一宿主的信號或分泌序列的核苷酸序。
25.一種能直接表達編碼角質酶變異體基因的核苷酸序列的重組DNA載體，含有下有成分(a)編碼成熟角質酶變異體或前角質酶或相應的前角質酶的雙鏈(ds)DNA，其中已將至少部分前序列直接從分泌信號(對於所選的宿主細胞是優選的)的下遊除去，提供應被轉譯的部分基因不從密碼子ATG開始，一個ATG應被放在前面，且被轉譯的部分基因用一個適當的終止密碼子終止或加入上述密碼子;(b)位於編碼角質酶變異體的dsDNA(成分a)的正鏈上遊的表達調節子(適用於所選的宿主生物)，(c)位於編碼角質酶變異體的dsDNA(組分a)正鏈下遊的終止子序列(適用於所選的宿主生物);(d1)適用於所選宿主的複製原點;(e1)選擇性地含有一個(營養缺陷型)選擇標記;(e2)選擇性含有一個編碼蛋白質的dsDNA序列。所述蛋白質涉及所選宿主中角質酶前體形式之一的成熟和/或分泌。
26.根據權利要求25的重組DNA載體，也攜帶在較早限定的核苷酸的上遊和/或下遊，促進角質酶功能表達的其它序列。
27.根據權利要求25-26的任一重組DNA載體，攜帶由營養缺陷型標記的編碼區和缺陷啟動子區組成的營養缺陷型標記。
28.一種酶洗滌劑組合物含有權利要求1-15的任一角質酶變異體。
全文摘要
提供具有改善的脂解活性的真核角質酶變異體，其中修飾胺基酸序列以便提高酶表面的疏水性。特別是提供茄病鐮孢的變異體。
文檔編號C12R1/78GK1090328SQ9311991
公開日1994年8月3日 申請日期1993年12月18日 優先權日1992年12月18日
發明者M·R·艾格蒙德, H·T·W·M·范德希登, W·穆斯特斯, H·彼得斯, C·T·韋裡斯, J·迪弗力格 申請人:尤尼利弗公司