表達新城疫病毒F基因的重組雞痘病毒活載體疫苗rFPV-1218NDF及其構建方法

2023-09-21 20:06:20

專利名稱：：表達新城疫病毒F基因的重組雞痘病毒活載體疫苗rFPV-1218NDF及其構建方法
技術領域：
：本發明涉及一種表達新城疫病毒F基因的重組雞痘病毒活載體疫苗的構建領域。
背景技術：
：雞痘病毒(FowlpoxVims，簡稱FPV)是繼痘苗病毒VV之後的一種具有獨特優越性和廣闊應用前景的表達載體，是當今分子生物學領域的研究熱點之-。禽痘病毒屬痘病毒科，禽痘病毒屬，雞痘病毒是其代表種。FPV做為表達載體有其獨特的優越性。其基因組龐大，長度約為VV的1.5倍，含較多的複製非必需區，可構建FPV多價和多聯疫苗；FPV具有自身的酶系統和調控信號，其轉錄、翻譯和裝配均發生在胞漿中，可對外源基因的表達產物進行翻譯後加工、修飾，保留其相應的生物學活性，誘導機體產生體液免疫和細胞免疫；與VV相比，FPV的宿主範圍較窄，僅感染禽類，不易散毒，對哺乳動物和人類無潛在的威脅；重組病毒的構建方法相對簡單；表達水平較高；便於對重組雞痘病毒免疫雞群和自然感染雞群進行鑑別。近十幾年來，FPV載體疫苗的研究已取得了很大進展，有多種病原體的保護性抗原基因在FPV中得以成功表達，如MDV的gB/pp38基因、NDV的F和HN基因、IBDV的VP2/VP2-3-4基因、AIV的HA/NA/NP基因、IBV的Sl基因、ALV的env基因、REV的env基因等，並在SPF雞上有很高甚至100%的保護率(BoyleDB,HeineHG.Recombinantfowlpoxvirusvaccinesforpoultry.Immunol.CellBiol，1993,71:391-397.)。但迄今為止，重組FPV活載體疫苗在國內外尚未獲得廣泛應用。究其原因，主要是重組FPV疫苗的免疫效力在很大程度上受到商品雞所攜帶的母源抗體的幹擾。我國商業雞群攜帶母源抗體的情況更為嚴重，因為在我國的養禽業中，種雞一般要多次接種針對NDV、AIV等病原體的疫苗，包括能產生高抗體滴度的油乳劑滅活疫苗。因此，我國市場上的商品雞普遍帶有相當高的母源抗體，其中ND的母源抗體HI效價平均可達28-29，這無疑給疫苗，尤其弱毒苗和活載體疫苗的早期應用和疫情監測帶來很大的困難。重組FPV受到針對FPV的母源抗體和針對外源基因表達產物的母源抗體的雙重幹擾，而且針對外源蛋白的母源抗體也會干擾其免疫效力。許多研究已經證明，針對外源蛋白的母源抗體會干擾重組FPV的免疫效力，而且母源抗體越高干擾越大。Taylor等發現，在有較高ND母源抗體的試驗雞上，共表達NDVF和HN基因的重組FPV抵抗NDV強毒攻擊的免疫保護率較在SPF雞上有所下降(TaylorJ,ChristensenL,GettigR,etal.E伍cacyofarecombinantfowlpox-basedNewcastlediseasevimsvaccinecandidateagainstvelogenicandrespiratorychallenge.AvianDis,1996,40:173-80.)。本室丁煒東、韋棟平等的試驗結果也表明，重組FPV的免疫效力因存在針對NDV或AIV的母源抗體而受到很大的影響(丁煒東，曹麗萍，張體銀等.表達新城疫病毒F和HN基因重組雞痘病毒疫苗的遺傳穩定性和免疫效力試驗.中國獸醫雜誌,2005,41:10-14.韋棟平，劉玉良，邵衛星等.共表達新城疫F基因和H9亞型禽流感病毒HA基因的重組雞痘病毒.微生物學報,2004,44:14-18.)。關於針對FPV的抗體是否影響重組FPV的免疫效力，目前尚無一致的看法。Taylor等對1日齡帶有FPV母源抗體的試驗雞免疫共表達NDVF和HN基因的重組FPV，免疫後28攻擊NDV強毒，保護率達94%-100%，表明針對FPV的母源抗體幾乎不影響重組病毒抵抗NDV攻擊的免疫效力(TaylorJ,ChristensenL,GettigR,etal.Efficacyofarecombinantfowlpox-basedNewcastlediseasevirusvaccinecandidateagainstvelogenicandrespiratorychallenge.AvianDis,1996，40:173-80.)。而喬傳玲等通過在SPF雞上預先感染FPV，然後接種重組FPV，來探討FPV抗體對重組病毒的免疫效力是否存在影響。結果表明，FPV與表達AIVHA和NA基因的重組FPV同時接種和間隔4周接種時，FPV抗體對重組疫苗的免疫效力不構成影響，對高致病性AIV的保護率為100%。而間隔時間為l、2、3周時，重組疫苗的免疫效力則受到不同程度的影響(喬傳玲，李呈軍，于康震等.禽痘病毒感染對禽流感病毒疫苗免疫效力的影響.中國預防獸醫學報，2005,27:154-156.)。在此之前，Swayne等也對此進行了研究，首先用FPV免疫12周齡雞，然後在間隔4、9、15周後分別用表達AIVHA基因的重組FPV進行免疫，免疫3周後用高致病性AIV攻擊，結果重組病毒未能提供堅強的免疫保護(SwayneDE,BeckJRandKinneyN.Failureofarecombinantfowlpoxvirusvaccinecontaininganavianinfluenzahemagglutiningenetoprovideconsistentprotectionagainstinfluenzainchickenspermmunizedwithafowlpoxvaccine.AvianDis，2000,44:132-137.)。目前，克服母源抗體的幹擾作用主要有DNA疫苗免疫、共表達細胞因子、黏膜免疫以及利用新的佐劑和載體釋放系統等幾種途徑，但尚有許多理論和技術問題需要解決，沒有從根本上解決重組FPV受母源抗體幹擾這一難題。
發明內容本發明的第一個目的在於發明一種表達新城疫病毒F基因的重組雞痘病毒活載體疫苗rFPV-1218NDF，該疫苗具有較強的抵抗母源抗體幹擾的能力，從而克服重組雞痘疫苗在應用過程中受母源抗體幹擾這一難題。本發明表達新城疫病毒F基因的重組雞痘病毒活載體疫苗rFPV-1218NDF，於2007年1月12日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCCNo:1916。本發明具有較強的抵抗母源抗體幹擾的能力，從而克服重組雞痘疫苗在應用過程中受母源抗體幹擾這一難題。本發明的第二個目的在於發明一種表達新城疫病毒F基因的重組雞痘病毒活載體疫苗rFPV-1218NDF的構建方法，利用FPV表達載體pl2-18，將新城疫病毒F基因通過同源重組插入到282E4株雞痘病毒的複製非必需區FPV12-18，從而獲得了表達新城疫病毒F基因的重組雞痘病毒活載體疫苗rFPV-1218NDF。本發明與本室原來構建的以複製非必需區FPV7S為插入位點構建的相應的重組FPV相比，該疫苗在高母源抗體商品雞上具有較強的抵抗母源抗體幹擾的能力。本發明的具體技術方案如下(1)表達新城疫病毒F基因的轉移載體的構建將ZJ1株新城疫病毒(NDV)的F基因插入表達載體pl2-18，獲得表達NDVF基因的重組FPV轉移載體pl218NDF。用鹼裂解法製備轉移載體的質粒DNA並以PEG純化質粒DNA。(2)表達新城疫病毒F基因的重組雞痘病毒的構建將(1)中構建的轉移載體p1218NDF與282E4株FPV共轉染CEF。在35mm培養皿中培養CEF，使形成60%的單層後以0.1MOI的282E4株FPV感染，37。C吸附2小時後傾去上清培養基，加lml含10%小牛血清的DMEM培養基；將l嗎轉移載體溶解於的無血清DMEM培養基；取5|il轉染試劑FuGENETM6緩慢加入到lOOpl無血清DMEM培養基中，兩者混勻置室溫作用15min，然後緩緩滴加至上述CEF中，邊滴邊混勻，置37。C培養3小時後補加lml含10°/。小牛血清的DMEM培養基；12h後更換為含1%小牛血清的DMEM培養基，置37。C繼續培養；CEF產生80%病變後收穫病毒，反覆凍融3次，低速離心去除細胞碎片，上清用於重組病毒的篩選和純化。將上清稀釋液接種60mm平皿上長成緻密單層的CEF，37"C培養約72h，待出現較多病毒蝕斑後，用含有200嗎/mlX-gal的營養瓊脂覆蓋，待出現藍色蝕斑後挑取藍色蝕斑，用吸管將其吸出，轉入0.5ml細胞培養維持液中，凍融3次，低速離心去除細胞與瓊脂碎片，取上清感染次代細胞。在60mm平皿中重複進行以上步驟後，f96孔板上篩選數次，直至在X-gal存在的條件下，重組病毒在CEF上所形成的蝕斑全部呈藍色。即可得到純化的重組病毒，即282E4株重組病毒rFPV-1218NDF。重組病毒中外源基因的插入和表達可通過PCR擴增外源基因和間接免疫螢光試驗予以鑑定。(3)新構建的重組雞痘病毒rFPV-1218NDF與原有重組雞痘病毒rFPV-NllSF在有母源抗體商品雞上的免疫效力比較試驗將l日齡商品蛋雞隨機分組，25-26隻/組，進行隔離飼養。1日齡ND的HI抗體效價平均約為28。分別於5、10、15、25日齡頸部皮下接種rFPV-NllSF、rl;PV-1218NDF和野生型雞痘病毒FPV282，1(^PFU/只，同時設ND油苗對照組，0.2mi/只。免疫後28d進行滴鼻攻毒，每隻試驗雞接種10"ELD5。的F48E8株NDV強毒。觀察14d，記錄發病死亡情況。對免疫效力試驗結果進行統計分析。本發明構建的新的重組病毒rFPV-1218NDF和原有的rFPV-NllSF在免疫效力方面存在很大的差異。rFPV-1218NDF組較rFPV-NllSF組的保護率高，能夠使重組FPV更好地抵抗母源抗體的幹擾，提高重組FPV的免疫效力。亍旦這種差異不顯著，可能與樣本數太小有關由於我們的樣本太小，每個試驗組j又有25-26隻雞。因此，我們將重組病毒rFPV-1218NDF與重組病毒rFPV-NllSF分別在5、10、15和25日齡商品雞上進行的4次免疫效力試驗結果一併統計，從而將樣本擴大到每組101隻雞，然後用SPSS軟體對它們之間免疫保護率的差異性進行分析，結果表明它們的保護率之間差異極顯著，rFPV-1218NDF和rFPV-NllSF的綜合免疫保護率分別為85.9%和67.1%。這進一步確證了重組病毒rFPV-1218NDF能夠更好地抵抗母源抗體的幹擾。圖1為轉移載體pl218NDF的構建過程圖。圖2為感染重組FPV的CEF中F基因表達產物的間接免疫螢光鑑定圖。圖3為4株重組FPV在不同齡商品雞上的4次免疫效力試驗的保護率圖。具體實施例方式本發明涉及的FPV(雞痘病毒)表達載體pl2-18，於2005年6月6日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCNO:1385，其長度為10450bp，該載體以雞痘病毒新鑑定的複製非必需區FPV12-18為外源基因插入位點，是一個含有雞痘病毒複製非必需區側翼區FPV1和FPV2的表達載體，FPV1的核苷酸長度為1863bp,FPV2的核苷酸長度為1554bp。構建FPV(雞痘病毒)表達載體pl2-18的具體步驟是1、定向克隆法篩選雞痘病毒的新複製非必需區FPV12-18病毒的增殖及基因組的提取按常規方法取9-10日齡的SPF雞胚，製成CEF單層。接種282E4株(中國疫苗株)FPV，在5。/。C02，37。C的培養箱培養。待病變達80%以上棄去原培養基，細胞用PBS洗兩遍後，加入適量PBS，用吸管將細胞吹下。低速離心棄上清，用少量PBS(50ml的細胞培養瓶用200^1)懸浮。提取方法參照HighPurePCRTemplatePreparationKit說明書進行1.5ml的Eppendorf管中依次加入上述200^1樣品、200|ilBindingBuffer和40(ilProteinaseK，混勻；72。C作用lOmin後，加入lOOpl異丙醇；將上述混合物混勻後加入特定的離心管，8000rpm離心lmin，棄濾液；然後加入500^1WashingBuffer,離心，洗滌兩遍；13000rpm離心10s，去除殘餘的液體；加入200^1ElutionBuffer(70。C預熱)，8000rpmlmin離心至乾淨的Eppendorf管中，所得即為282E4株FPV基因組DNA。PCR擴增FPV複製非必需區FPV12-18的側翼區FPV1和FPV2根據己發表的美國致病株雞痘病毒FPV的基因組全序列(AF198100)設計兩對引物，引物表達式P,5，一CGTAAGACTTATCCATACCGAG—3'P25，一GTTTCTAAGATCATCATGTCCTAC—3'P35，一CTGTAGTAGTTACTACATACGCAG—3'P45，一AACAGAAATAGCTCCTCTCATAC—3，P,位於ORF077的內部，P2和Ps均位於ORF073與ORF074兩個ORF之間的間隔區，P4位於ORF071的內部。P!和P2跨幅約為1880bp，艮卩FPV1，P3和P4跨幅約為1570bp，即FPV2。兩對引物分別用於擴增雞痘病毒FPV複製非必需區各自的兩個側翼區(FPV1和FPV2)。引物中加入了便於克隆操作的限制性酶切位點和保護性鹼基。以282E4株FPV的基因組DNA為模板，用高保真PCR系統(ExpandHighFidelityPCRSystem)擴增FPV複製非必需區側翼區FPVl和FPV2並進行序列測定。2、構建載體pP12:(1)用III+loI雙酶切克隆載體pSK和上述回收的FPV2片段，37°C消化2h以後，電泳並回收約3.0kb的載體片段和約1.57kb的FPV2。然後按一定比例進行連接成pSKP2，轉化感受態大腸桿菌DH5a，挑取白色菌落提質粒並以MwdIII+硃I雙酶切(20fil體系)，37。C消化1.5h以後，加4^16xLoadingbuffer,用瓊脂糖凝膠電泳進行鑑定。陽性質粒命名為pSKP2。(2)將pSKP2和FPVl分別用SawHI、Bg/Il+SacI進行雙酶切，37。C消化2h後，電泳並回收約4.57kb的載體片段和約1.88kb的FPVl片段，按一定比例連接形成pSKPlP2，轉化宿主菌DH5a，然後挑取白色菌落提質粒並用歷Mdni+SacI雙酶切(20(!l體系)，加4^16xLoadingbuffer,用瓊脂糖凝膠電泳進行鑑定，陽性質粒命名為pSKPlP2。pSKPlP2分別以歷"dlII+loI和歷"dIll+SacI雙酶切後電泳，可見預期目的條帶FPV2和FPV1，條帶大小分別約為1.57kb禾B1.93kb(其中包括約50bp的酶切位點)，表明FPV1和FPV2己成功插入載體。(3)將pSKPlP2和pFGl175-1分別用MzeI、J^^I進行單酶切，37。C消化2h後，電泳並回收約6.45kb的載體片段和約3.80kb的Pll-丄acZ標記基因表達框，按一定比例連接構成pP12，轉化宿主菌DH5a，然後挑取藍色菌落提質粒並用5bcI進行酶切(20pl體系)，37。C消化1.5h後，加4|il6xLoadingbuffer,用瓊脂糖凝膠電泳進行鑑定。篩選P11-丄MZ標記基因表達框正向插入的陽性質粒，陽性質粒命名為pP12。3、FPV複製非必需區的篩選將純化的載體質粒pP12與282E4株FPV共轉染CEF，轉染試劑為FuGENE6TransfectionReagent,轉染及重組病毒的篩選純化按照轉染試劑說明書進行。在35mm培養皿中培養CEF，使形成60%的單層後以0.1MOI的282E4株FPV感染，37。C吸附2小時後傾去上清培養基，力Qlml含10%小牛血清的DMEM培養基；將l嗎載體質粒pP12溶解於50(il的無血清DMEM培養基；取5^1轉染試劑FuGENETM6緩慢加入到100|il無血清DMEM培養基中，兩者混勻置室溫作用15min，然後緩緩滴加至上述CEF中，邊滴邊混勻，置37。C培養3小時後補加lml含10%小牛血清的DMEM培養基；12h後更換為含1%小牛血清的DMEM培養基，置37。C繼續培養；CEF產生80%病變後收穫病毒，反覆凍融3次，低速離心去除細胞碎片，上清用於重組病毒的篩選和純化。將上清稀釋液接種60mm平皿上長成緻密單層的CEF，37。C培養約72h，待出現較多病毒蝕斑後，用含有200嗎/mlX-gal的營養瓊脂覆蓋，待出現藍色蝕斑後挑取藍色蝕斑，見圖3，用吸管將其吸出，轉入0.5ml細胞培養維持液中，凍融3次，低速離心去除細胞與瓊脂碎片，取上清感染次代細胞。在60mm平皿中重複進行以上步驟後，於96孔板上篩選數次，直至在X-gal存在的條件下，重組病毒在CEF上所形成的蝕斑全部呈藍色。即可得到純化的重組病毒。重組病毒rFPV-1218NDF的獲得表明，預先假定的複製非必需區均為真正的FPV複製非必需區，命名為FPV12-18。4、複製非必需區的遺傳穩定性試驗重組雞痘病毒接種CEF，在5。/。C02,37t:的培養箱培養，2-3天後待病變達80%以上後收穫，反覆凍融3次，用於下次擴增，連續傳10代。空斑計數後保存於-70。C冰箱備用。分別取重組病毒的O、5、10代以10—3、10—4、10—5、10—6稀釋，接種生長在24孔板上單層次代CEF，100pl/L。待出現單個蝕斑後，覆蓋含200)ig/mlX-gal的瓊脂，37°C，C02箱中培養1-2天觀察蝕斑純度。結果發現所有病毒蝕斑均呈藍色。用PBS吹下擴增的三個代次重組雞痘病毒的單層細胞，以HighPurePCRTemplatePreparationKit(寶靈曼公司)提取核酸模板DNA。按常規方法針對/」CZ基因部分片段進行PCR並測序，檢測外源基因在重組FPV傳代過程中是否發生變異，結果序列沒有發生任何變異。以上試驗表明，重組病毒基因組中的丄"CZ基因能夠穩定遺傳和表達，同時也證明了篩選的FPV複製非必需區FPV12-18具有良好的遺傳穩定性。5、雞痘病毒表達載體pl2-18的構建將pNllS用7/z'"dIll+SmaI進行雙酶切，37。C消化2h後，電泳並回收約200bp的含MCS的Ps啟動子，與同時用歷"dni+5VwaI雙酶切的載體pP12按一定比例連接構建雞痘病毒表達載體pl2-18，將該載體轉化宿主菌DH5a，然後挑取藍色菌落提質粒，並用Z/^dI雙酶切(20(^1體系)，加4(_il6xLoadingbuffer,用瓊脂糖凝膠電泳進行鑑定，陽性質粒分別命名為pl2-18。經測序，雞痘病毒表達載體pl2-18的長度為10450bp，該載體以雞痘病毒新鑑定的複製非必需區FPV12-18為外源基因插入位點，是一個含有雞痘病毒複製非必需區側翼區FPV1和FPV2的表達載體。一、表達新城疫病毒F基因的轉移載體的構建質粒pTF用化/1雙酶切，回收約1.7kb的ZJ1株NDV的F基因片段，與經6flmH1+1雙酶切的表達載體pl2-18進行連接，轉化宿主菌DH5a，然後挑取藍色菌落提質粒，並用/Z/"din酶切(20)!l體系)，加4^16xLoadingbuffer,用瓊脂糖凝膠電泳進行鑑定，陽性質粒可見約1.9kb的條帶。陽性質粒即轉移載體命名為pl218NDF，其具體構建過程見圖l。用鹼裂解法製備轉移載體的質粒DNA並以PEG純化質粒DNA。二、表達新城疫病毒F基因的重組雞痘病毒的構建將純化的載體質粒pl218NDF與282E4株FPV共轉染CEF，轉染試劑為FuGENE6TransfectionReagent,轉染及重組病毒的篩選純化按照轉染試劑說明書進行。在35mm培養皿中培養CEF，使形成60%的單層後以0.1MOI的282E4株FPV感染，37。C吸附2小時後傾去上清培養基，力卩lml含10%小牛血清的DMEM培養基；將l嗎轉移載體溶解於50pl的無血清DMEM培養基；取5^1轉染試劑FuGENETM6緩慢加入到100jil無血清DMEM培養基中，兩者混勻置室溫作用15min，然後緩緩滴加至上述CEF中，邊滴邊混勻，置37°C培養3小時後補加lml含10%小牛血清的DMEM培養基；12h後更換為含1%小牛血清的DMEM培養基，置37。C繼續培養；CEF產生80%病變後收穫病毒，反覆凍融3次，低速離心去除細胞碎片，上清用於重組病毒的篩選和純化。將上清稀釋液接種60mm平皿上長成緻密單層的CEF，37。C培養約72h，待出現較多病毒蝕斑後，用含有200^ig/mlX-gal的營養瓊脂覆蓋，待出現藍色蝕斑後挑取藍色蝕斑，用吸管將其吸出，轉入0.5ml細胞培養維持液中，凍融3次，低速離心去除細胞與瓊脂碎片，取上清感染次代細胞。在60mm平皿中重複進行以上步驟後，於96孔板上篩選數次，直至在X-gal存在的條件下，重組病毒在CEF上所形成的蝕斑全部呈藍色。即可得到純化的重組病毒，即282E4株重組病毒rFPV-1218NDF。感染表達NDVF基因的重組病毒和陽性對照rFPV-F或rFPV-HN的CEF胞漿和胞膜區呈特異性黃綠色螢光，而感染陰性對照親本282E4株FPV的CEF則未呈現特異性螢光著色，表明重組FPV中的F基因已獲得表達。重組病毒rFPV-1218NDF及其陽性對照rFPV-F、陰性對照野生型282E4株FPV的螢光照片見圖2。圖2中，A圖為感染rl2LSF的CEF;B圖為感染rFPV-F的CEF，C圖為感染野生型282E4株FPV的CEF。重組病毒的O、5、10代接種24孔板上的單層次代CEF，待出現單個蝕斑後，覆蓋含200Hg/mlX-gal的瓊脂，發現所有病毒蝕斑均呈藍色。而間接免疫螢光試驗發現所有病毒蝕斑均呈現特異性螢光，陰性對照組無特異性螢光。對5、IO代重組病毒中的F基因進行PCR，結果均可以擴增出1.7Kb的目的條帶，與預期值相符。測序結果顯示，所測序列沒有發生任何變異。以上試驗表明，重組病毒基因組中的F基因均能夠穩定地遺傳和表達。三、新構建的重組雞痘病毒rFPV-1218NDF與原有的重組雞痘病毒rFPV-NllSF在有母源抗體商品雞上的免疫效力比較試驗將重組病毒rFPV-NllSF與重組病毒rFPV-1218NDF分別在5、10、15和25日齡的存在不同水平母源抗體的商品雞上進行免疫效力試驗。將l日齡商品蛋雞隨機分組，25-26隻/組，進行隔離飼養。1日齡ND的HI抗體效價平均約為28。分別於5、10、15、25日齡頸部皮下接種rFPV-NllSF、rFPV-1218NDF和野生型雞痘病毒FPV282，10》FU/只，同時設ND油苗對照組，0.2ml/只。免疫後28d進行滴鼻攻毒，每隻試驗雞接種105ELDso的F48E8株NDV強毒。觀察14d，記錄發病死亡情況。5日齡商品雞商品雞5日齡時的ND母源抗體相當高，其平均HI效價達至1J2(6飼'4)。由表1可見，重組病毒rFPV-NllSF和rFPV-1218NDF的免疫保護率之間存在很大的差異，分別為43.8%和75.0%;ND油苗的保護率為100%。rFPV-N11SF組與ND油苗組的保護率之間存在顯著差異，而rFPV-1218NDF組與ND油苗組的保護率之間無顯著差異。表1重組FPV在5日齡商品雞上的免疫郊〔力試驗結果tableseeoriginaldocumentpage12NDHi效價=平均HI效價(log2x)士標準差；FPV旭:282E4株野生型雞痘病毒免疫保護率=(攻毒對照組死亡率一疫苗免疫組死亡率)/攻毒對照組死亡率xl00。/。10日齡商品雞商品雞10日齡時ND母源抗體的平均HI效價為2(5.0±0.6)。由表2可見，重組病毒rFPV-NllSF和rFPV-1218NDF的免疫保護率之間也存在很大的差異，分別為50.0%和70.8%，ND油苗的保護率為83.3%。表2重組FPV在10日齡商品雞上的免疫效力試驗結果tableseeoriginaldocumentpage12NDHI效價=平均HI效價(log2x)土標準差；FPV282:282E4株野生型雞痘病毒免疫保護率=(攻毒對照組死亡率一疫苗免疫組死亡率)/攻毒對照組死亡率><100%15日齡商品雞商品雞15日齡時ND母源抗體的平均HI效價為2(4，4)。由表3可見，rFPV-NllSF和rFPV-1218NDF組的保護率均較各自5、10日齡免疫的保護率均有一定的提高，其中rFPV-1218NDF組的保護率達到了95%，比rFPV-NllSF組略高；重組FPV組和ND油苗組的保護率之間沒有顯著差異。表3重組FPV在15日齡商品雞上的免疫效力試驗結果tableseeoriginaldocumentpage13NDHI效價=平均HI效價(log2x)土標準差；FPV282:282E4株野生型雞痘病毒免疫保護率=(攻毒對照組死亡率一疫苗免疫組死亡率)/攻毒對照組死亡率xl00。/。25日齡商品雞商品雞25日齡時ND的母源抗體已經很低，平均HI效價下降到2aQ±a4)。由表4可見，重組FPV組較其5和15日齡免疫的保護率明顯上升，rFPV-NllSF組為88%，rFPV-1218NDF組則與油苗組一樣達到100%，各免疫組之間差異不大。表4重組FPV在25日齡商品雞上的免疫效力試驗結果tableseeoriginaldocumentpage13NDHI效價=平均HI效價(log2x)±標準差；FPV282:282E4株野生型雞痘病毒免疫保護率=(攻毒對照組死亡率一疫苗免疫組死亡率)/攻毒對照組死亡率x100%綜上所述，商品雞上普遍存在的母源抗體對重組FPV的免疫效力存在很大的影響；在5、10、15、25日齡的帶有不同水平母源抗體的商品雞上，rFPV-1218NDF禾nrFPV-NllSF在免疫效力方面存在很大的差異。rFPV-1218NDF組較rFPV-NllSF組的保護率高，表明rFPV-1218NDF能夠更好地抵抗母源抗體的幹擾。但這種差異不顯著，可能與樣本數太小有關。因此，我們將以重組病毒rFPV-1218NDF與重組病毒rFPV-NllSF分別在5、10、15和25日齡商品雞上進行的4次免疫效力試驗結果一併統計(見表5和圖3)，從而將樣本擴大到每組101隻雞，然後用SPSS軟體對它們之間免疫保護率的差異性進行分析，結果表明它們的保護率之間差異極顯著，這進一步確證了rFPV-1218NDF較rFPV-NllSF能夠更好地抵抗母源抗體的幹擾。表5重細FPV在不同齡商品雞上的4次免疫效力試驗結果complextableseeoriginaldocumentpage14a、b差異極顯著(PO.01);FPV282:282E4株野生型雞痘病毒免疫保護率=(攻毒對照組死亡率一疫苗免疫組死亡率)/攻毒對照組死亡率x100%圖3中，l為rFPV-NllSF，2為rFPV-1218NDF，3為ND油苗。cgtaagacttatccataccgaggtttctaagatcatcatgtcctacctgtagtagttactacatacgcag犯c紹犯ategctcctctcatec權利要求1、表達新城疫病毒F基因的重組雞痘病毒活載體疫苗rFPV-1218NDF，其特徵在於其保藏號CGMCCNo1916。2、如權利要求1所述表達新城疫病毒F基因的重組雞痘病毒活載體疫苗rFPV-1218NDF的構建方法，其特徵在於利用FPV表達載體pl2-18，將新城疫病毒F基因通過同源重組插入到282E4株雞痘病毒的複製非必需區FPV12-18，從而獲得表達新城疫病毒F基因的重組雞痘病毒活載體疫苗rFPV-1218NDF。3、根據權利要求2所述表達新城疫病毒F基因的重組雞痘病毒活載體疫苗rFPV-1218NDF的構建方法，其特徵在於包括以下步驟(1)表達新城疫病毒F基因的轉移載體的構建將NDV的F基因插入表達載體pl2-18，獲得表達NDV的F基因的重組FPV轉移載體pl218NDF;用鹼裂解法製備轉移載體的質粒DNA並以PEG純化質粒DNA。(2)表達新城疫病毒F基因的重組雞痘病毒的構建將(1)中構建的轉移載體pl218NDF與282E4株FPV共轉染CEF:在35mm培養皿中培養CEF，使形成60%的單層後以0.1MOI的282E4株FPV感染，37"C吸附2小時後傾去上清培養基，加lml含10%小牛血清的DMEM培養基；將l嗎轉移載體溶解於5(Hil的無血清DMEM培養基；取5^1轉染試劑FuGENETM6緩慢加入到10(^1無血清DMEM培養基中，兩者混勻置室溫作用15min，然後緩緩滴加至上述CEF中，邊滴邊混勻，置37。C培養3小時後補加lml含10%小牛血清的DMEM培養基；12h後更換為含1%小牛血清的DMEM培養基，置37'C繼續培養；CEF產生80。/。病變後收穫病毒，反覆凍融3次，低速離心去除細胞碎片，上清用於重組病毒的篩選和純化；將上清稀釋液接種60mm平皿上長成緻密單層的CEF，37。C培養約72h，待出現較多病毒蝕斑後，用含有200)ig/mlX-gal的營養瓊脂覆蓋，待出現藍色蝕斑後挑取藍色蝕斑，用吸管將其吸出，轉入0.5ml細胞培養維持液中，凍融3次，低速離心去除細胞與瓊脂碎片，取上清感染次代細胞。在60mm平皿中重複進行以上步驟後，於96孔板上篩選三至十次，直至在X-gal存在的條件下，重組病毒在CEF上所形成的蝕斑全部呈藍色，即得純化的重組病毒，即282E4株重組病毒rFPV-1218NDF。全文摘要表達新城疫病毒F基因的重組雞痘病毒活載體疫苗rFPV-1218NDF及其構建方法，涉及疫苗的構建領域。利用FPV表達載體p12-18，將新城疫病毒F基因通過同源重組插入到282E4株雞痘病毒的複製非必需區FPV12-18，從而獲得了表達新城疫病毒F基因的重組雞痘病毒活載體疫苗rFPV-1218NDF。本發明疫苗在高母源抗體商品雞上具有較強的抵抗母源抗體幹擾的能力。文檔編號A61P31/12GK101096685SQ20071002268公開日2008年1月2日申請日期2007年5月25日優先權日2007年5月25日發明者劉武傑,劉秀梵,蕾孫,陳素娟申請人:揚州大學