免疫球蛋白糖基化模式分析的製作方法

2023-09-09 21:18:40

專利名稱：免疫球蛋白糖基化模式分析的製作方法
免疫球蛋白糖基化模式分析本發明涉及確定免疫球蛋白Fc片段糖基化模式的方法。還展示了確定Fab糖基化的免疫球蛋白的糖基化模式的方法，以及產生免疫球蛋白Fab2片段的方法。
背景技術：
近年來製藥工業領域在尤其以酶、抗體和細胞因子例如促紅細胞生成素、幹擾素、 纖溶酶原激活物等為基礎的產品方面取得巨大成功，並且全世界對蛋白質治療劑的需求逐年增加。治療性單克隆抗體(mAbs，monoclonal antibodies)在蛋白質治療中是重要一類。它們被稱為單克隆，因為相對於多克隆抗體，它們是由衍生自單一抗體形成細胞的免疫細胞(細胞克隆)分泌的。單克隆抗體的特徵在於它們每個僅針對免疫原性物質的一個表位，並且因此在治療疾病中可以非常特異地應用。蛋白質治療的實例是Roche(FS) 生產的單克隆抗體曲妥珠單抗(trastuzumab)(商品名赫賽汀(Here印tin))、達利珠單抗 (daclizumab)(商品名賽尼哌(Zenapax))和利妥昔單抗(商品名=MabThera)，它們已經成功地用於尤其治療乳腺癌(曲妥珠單抗)、器官排斥反應(達利珠單抗)和治療非霍奇金淋巴瘤(利妥昔單抗)。治療性單克隆抗體是通過複雜的生物技術方法獲得的。降解產物可以在它們的生產、配製和貯存過程中產生，這常常是由於例如氧化和脫醯胺反應以及蛋白酶剪切過程引起的(Yan，B.等人，J. Chromatog.A 1164(2007) 153-161)。除了它的作用之外，生物製藥產品的質量，即純度、完整性、聚集狀態和糖基化模式也是很重要的。從人病原體化膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)中獲得的半胱氨酸內切蛋白酶IdeS (免疫球蛋白降解酶S)，其也稱為Mac-I或sib_38，是半胱氨酸蛋白酶，其特異性切割G型免疫球蛋白(IgG)抗體的重鏈。IgG是迄今為止唯一已知的IdeS底物 (Vincents, B.等人，Biochem. 43 (2004) 15540-15549) IdeS 由 339 個胺基酸組成，包括含四個胺基酸的信號肽(von Pawel-Rammingen, U.等人，EMBO J. 21 (2002) 1607-1615) IdeS於包含在識別序列(LL)GGP中的236和237位胺基酸(Gly-Gly)之間切割人IgG 亞類IgGl、IgG3和IgG4。人IgG2在識別基序PVAGP中的丙氨酸和甘氨酸間被切割。 IgG2a、IgG2b和IgG3型鼠抗體以及兔IgG (LLGGPS)也被切割(例如參見，Vincents, B.,等人』 Biochem. 43 (2004) 15540-15549 ；Wenig, K. ， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(2004)17371-17376)。Hess 等人(Hess, J. K.等人，J. Microbiol. Meth. 70 (2007) 284-291)報導了質譜方法，其藉助SELDI-T0F質譜法測定IdeS的酶活性。在US2007/0237784中報導了從化膿鏈球菌中分離的並且具有IgG半胱氨酸蛋白酶活性的多肽。在EP 1458861A中報導了形成抗體的Fc或Fab片段的方法。在WO 2006/131347中報導了來自A組鏈球菌的IdeS蛋白酶。例如多肽的糖基化譜是許多重組產生的治療性多肽的重要性質。糖基化的多肽也稱為糖蛋白，其介導真核生物(例如人)和一些原核生物中的許多重要功能，包括催化、信號傳導、細胞-細胞溝通、免疫系統的活性、以及分子識別和關聯。在真核生物中，它們佔非胞質蛋白的大多數(Lis, H.等人，Eur. J.BiOChem.218(1993)l-27)。寡糖的形成/與蛋白質的連接是共翻譯和翻譯後修飾，並且因此不是基因控制的。寡糖的生物合成是涉及幾種酶的多步驟過程，所述酶彼此競爭底物。因此，糖基化多肽包括寡糖的微不均一陣列，導致產生了一組含有相同胺基酸骨架的不同的糖形。共價結合的寡糖影響相應多肽的物理穩定性、摺疊、對蛋白酶攻擊的抗性、與免疫系統的相互作用、生物活性以及藥物代謝動力學。此外，一些糖形可以是抗原性的，促使管理機構需要分析重組糖基化多肽的寡糖結構(例如，參見Paulson，J. C. ,Trends Biochem. Sci. 14(1989)272-276 Jenkins, N.，等人，Nature Biotechnol. 14(1998)975-981)。例如已報導糖基化多肽的末端唾液酸化增加血清半壽期，以及含有具末端半乳糖殘基的寡糖結構的糖基化多肽顯示出增加的從循環的清除率(Smith，P.L.，等人，J.Biol. Chem. 268(1993)795-802)。免疫球蛋白與其他重組多肽在它們的糖基化模式方面不同。免疫球蛋白G(IgG) 例如是分子量為約150kDa的對稱、多功能糖基化多肽，其由兩個相同的負責抗原結合的 Fab片段和負責效應子功能的Fc片段組成。在IgG分子中糖基化傾向於在Asn-297處高度保守，所述Asn-297包埋在Fc重鏈的CH2結構域之間，形成與CH2中胺基酸殘基的廣泛接觸 (Sutton 和 Phillips, Biochem. Soc. Trans. 11 (1983) 130-132)。Asn-297 連接的寡糖結構被不均一地加工，使得IgG以多種糖形存在。變化存在於Asn-297殘基佔據的位點(大不均一性)，或由糖基化位點處的寡糖結構變化(微不均一性)，例如參見Jenkins，N.，等人， Nature Biotechnol. 14(1996)975-981 具有脈衝電流測定的高性能陰離子交換色譜(HPAEC)和基質輔助的雷射解吸電離飛行時間質譜法(MALDI-T0F MS)已用於分析糖基化多肽的碳水化合物部分(例如參見，Fukuda, Μ.,(編輯)Glycobiology APractical Approach, IRL Press, Oxford ； Morelle, W.禾口 Michalsky， J. C. ， Curr.Pharmaceut. Design 11 (2005)2615—2645)。 Hoffstetter-Kuhn 等(Electrophoresis 17(1996)418-422)使用毛細管電泳和 MALDI-T0F MS分析，從而在用N-糖苷酶F (PNG酶F)去糖基化後剖析寡糖介導的單克隆抗體的不均一性。由於糖基化對重組糖基化多肽功能特性的重要性，以及充分定義的且一致的產物生產方法的必要性，在發酵過程中對重組產生的糖基化多肽的糖基化模式的在線或離線 (ad-line)分析是高度期望的。Papac等人(Glycobiol. 8 (1998) 445-454)報導了包括將糖基化多肽固定在聚偏(二)氟乙烯膜上、酶消化和MALDI-T0F MS分析糖基化譜的方法。 Bailey, Μ.等人，J. Chromat. 826 (2005) 177-187中報導了重組產生的mAb的分析和分子表徵，其包括多個色譜步驟。由哺乳動物細胞產生的免疫球蛋白含有2-3%質量的碳水化合物(Taniguchi， Τ.，等人，Biochem. 24 (1985) 5551-5557)。例如在G類免疫球蛋白(IgG)中，這等價於在小鼠源的 IgG 中 2. 3 個糖殘基(Mizuochi，T.，等人，Arch. Biochem. Biophys. 257(1987)387-394) 以及在人源 IgG 中 2. 8 個糖殘基(Parekh, R. B.，等人，Nature 316 (1985)452-457)，其中一般兩個位於Fc-區Asn-297處，以及其他的位於可變區(Saba，J. Α.，等人，Anal. Biochem. 305(2002) 16-31)。例如對於G類免疫球蛋白(IgG)，結合或可結合寡糖至胺基酸骨架上的不同的N糖基化位點是已知的。在IgG的Fc-區中，可將寡糖殘基在胺基酸殘基四7(其為天冬氨酸， 表示為Asnj97)處通過N糖基化引入。Youings等人顯示，15-20%的多克隆IgG分子中，其他的 N 糖基化位點位於 Fab-區(Youings, A.，等人，Biochem. J.，314 (1996) 621-630 ；還參見，例如 Endo, T.，等人，Mol. Immunol. 32 (1995) 931-940)由於不同質的(即不對稱)的寡糖加工，存在免疫球蛋白的多種糖結構同等型 (Patel，T. P.，等人，Biochem. J. 285(1992)839-845 ；Yu-Ip, C. C.，等人，Arch. Biochem. Biophys. 308(1994)387-399 ；Lund, J.，等人，Immunol. 30(1993)741-748)。同時，寡糖的結構和分布均是高度可重複的(即，非隨機的)且位點特異性的(Dwek，R.A.，等人， J. Anat. 187(1995)279-292)免疫球蛋白的一些特徵與Fc-區的糖基化直接相關(例如參見，Dwek, R. A.，等人，J. Anat. 187(1995)279-292 ；Lund, J.，等人，J Immunol. 157 (1996) 4963-4969 和 FASEB J. 9(1995) 115-119 ；Wright, Α.，和 Morrison, S. L.，J. Immunol. 160(1998)3393-3402)， 例如諸如熱穩定性和溶解性(West，C. Μ.，Mol. Cell. Biochem. 72 (1986) 3-20)、抗原性 (Turco, S. J.，Arch. Biochem. Biophys. 205 (1980) 330—339)、免疫原性(Bradshaw, J. P.， 等人，Biochim. Biophys. Acta 847(1985)344-351 ；Feizi, Τ.，和 Childs，R. Α.，Biochem. J. 245(1987) 1-11 ；Schauer, R.，Adv. Exp. Med. Biol. 2 (1988) 47-72)、清除率 / 循環半壽期(Ashwell, G.，禾口 Harford，J.，Ann. Rev. Biochem. 51 (1982)531—554 ；McFarlane, I. G.，Clin. Sci. 64(1983) 127—135 ；Baenziger, J. U.，Am. J. Path. 121 (1985)382—391 ； Chan, V. T.，和 Wolf, G.，Biochem. J. 247(1987)53-62 ；Wright, A.，等人，Glycobiology 10 (2000) 1347-1355 ；Rifai, A.，等人，J. Exp. Med. 191 (2000) 2171-2182 ；Zukier, L. S.， 等人，Cancer Res. 58(1998)3905-3908)以及生物比活性(Jefferis, R.，和 Lund, J.， 在 Antibody Engineering 中， 由 Capra, J. D.編輯，Chem. Immunol. Basel, Karger, 65(1997)111-128)。Lim, Α.，等 Anal. Biochem. 375 (2008) 163-172 中報導了具有兩個 N 連接的糖基化位點的治療性重組單克隆抗體的糖基化分析，其應用與雜合四極飛行時間質譜儀連用的液相色譜法。Nandakumar，K. S.和 Holmdahl，R.，Trends. Immunol. 29(2008) 173-178 報導了通過注射酶從而在體內切割或修飾IgG的可能性。鏈球菌蛋白酶Ides調節細菌 IgGFc結合，並且產生具有啟動多形核白細胞能力的1/2FC片段，這在SSderberg，j. j.和 vonPawel-Rammingen,U. ,Mol. Immunol. 45(2008)3347-3353 中得以報導。Bennet,K. L.，等人，Anal. Biochem. 245(1997) 17-27報導了通過電噴霧電離質譜法監測單克隆抗體的木瓜蛋白酶消化。發明概述本發明一個方面是確定人IgGl(huIgGl)或IgG2(huIgG》或IgG4(huIgG4)亞類免疫球蛋白或鼠IgGhOiiuIgG2a)或IgG^ (muIgG2b)或IgG3(muIgG3)亞類免疫球蛋白的糖基化模式或位點特異性糖基化模式的方法，其包括以下步驟a)用酶IdeS消化免疫球蛋白；b)通過反相高效液相色譜法分離a)中獲得的免疫球蛋白片段；c)對b)中獲得的分離的免疫球蛋白片段進行質譜分析；以及d)從C)中獲得的質譜數據確定免疫球蛋白的糖基化模式。在一個實施方案中，根據本發明的方法包括以下步驟b)和C)b)通過尺寸排阻色譜法對免疫球蛋白片段脫鹽；
c)將脫鹽的片段直接用於質譜分析。在一個其他實施方案中，根據本發明的方法包括步驟a)a)通過用酶IdeS進行酶消化將免疫球蛋白切割為片段，並用羧肽酶B處理免疫球蛋白片段。在另一實施方案中，根據本發明的方法在步驟a)之後及步驟b)之前包括步驟 ab)，其為ab)用甲酸和還原劑處理步驟a)的經消化的免疫球蛋白。發明詳述本發明涉及通過應用酶IdeS和質譜分析，確定人IgGl (hulgGI)或IgG2(huIgG2) 或 IgG4(huIgG4)亞類免疫球蛋白或鼠 IgGh(muIgGh)或 IgG2b (muIgG2b)或 IgG3(muIgG3)亞類免疫球蛋白的糖基化模式的方法。已發現使用IdeS提供了高度可重複的切割，甚至在非還原條件下也如此。此外， 可在質譜分析中省略添加TFA(三氟乙酸)，即可在不存在三氟乙酸的情況下進行質譜分析。而且，IdeS的使用是不受限的，例如，其可用於在溶液中消化免疫球蛋白。ESI-MS技術通常在完整免疫球蛋白或免疫球蛋白重鏈的水平上進行，並且對大蛋白質提供較低的質譜解析。木瓜蛋白酶消化的免疫球蛋白的ESI-MS分析是受限的，這是因為該酶的低特異性以及其活化需要半胱氨酸，這導致形成副產物，即幹擾數據分析的人工產物，例如通過還原反應產生。在肽作圖技術中，不得不進行相對複雜的樣本製備，並且定量分析很困難，這尤其是因為鹽加合物的形成。一般地，所有的色譜方法需要物質標記，某些聚糖的共洗脫難以避免。此外，區分在Fc片段以及在1 片段中糖基化的免疫球蛋白的糖基化模式是不可能的。「多肽」是由胺基酸組成的聚合物，所述胺基酸由肽鍵連接在一起。其可以是通過酶解或合成產生的。含有小於20個胺基酸的多肽也稱為「肽」。「蛋白質」是大分子，其含有兩個或多個多肽，或者它是包含超過100個胺基酸的多肽。多肽也可以含有非肽組分，例如諸如碳水化合物。非肽修飾物是通過表達該多肽的細胞引入的，並且因此取決於細胞類型。在本申請中，多肽是通過它們的胺基酸序列來定義的。修飾物(諸如碳水化合物)沒有明確描述，但可能總是存在。本申請中同義應用的術語「抗體」和「免疫球蛋白」表示含有至少兩條輕多肽鏈 (輕鏈，LC)和兩條重多肽鏈(重鏈，HC)的分子。每條輕鏈和重鏈包含可變區(通常是鏈的氨基端)，其含有結合抗原的結合結構域。每條重鏈和輕鏈包含恆定區(通常是鏈的羧基端)，其介導抗體與不同受體結合。輕鏈通常包含可變結構域\和恆定結構域Q。重鏈通常包含可變結構域Vh和恆定區，恆定區又包含結構域CH1、鉸鏈區、Ch2、CH3和任選的 Ch4。抗體可以以多種形式存在，例如Fv、Fab和F(ab)2以及單鏈(scFv)(例如Huston, J. S.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(1988)5879-5883 ；Bird, R. Ε.等人，Science 242(1988)423-426 ；和 Hood，L. Ε.等人，Immunology, Benjamin N. Y.，第 2 版(1984)以及 Hunkapi 1 Ier，Τ.和Hood，L.，Nature 323(1986) 15-16)。取決於重鏈恆定區的胺基酸序列， 將免疫球蛋白分為多個類IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。這些類中的一些進一步細分為亞類 (同種型)，例如IgG分為IgGU IgG2、IgG3和IgG4 ；或者IgA分為IgAl和IgA2。取決於抗體所屬的類，將重鏈恆定區稱為α (IgA)、δ (IgD)、ε (IgE), γ (IgG)和μ (IgM)。
通用色譜方法是本領域技術人員已知的，例如Chromatography (色譜)， 第 5 版，A 部 fundamentals and Techniques (原理與技術)，Heftmann, E.(編輯)， Elsevier Science Publishing Company, New York, (1992) ；Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences (生物科學中的高等色譜禾口電遷移方法)，Deyl, Z.(編輯)，Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands, (1998) ；Chromatography Today (今曰色譜)，Poole, D. F.禾口 Poole，S. K.，Elsevier Science Publishing Company, New York, (1991) ；Scopes, Protein Purification Principles and Practice (蛋白質純化原理與實踐)(1982) ；Sambrook, J.等人(編輯)，Molecular Cloning =ALaboratory Manual (分子克隆實驗室手冊)，第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N. Y. ,1989 ；5 Current Protocols inMolecular Biology (分子生物學最新方法)，Ausubel，F. M.等人(編輯)，JohnWiley & Sons, Inc. , New York。免疫球蛋白降解酶IdeS是在GP(Q基序高特異性切割IgG的半胱氨酸蛋白酶，已發現其可與LC-MS (與質譜聯用的液相色譜法)聯用，用於免疫球蛋白的詳細的位點特異性糖基化模式表徵。已發現在2小時消化過程中，IdeS切割抗體，產生兩個HC-Fc片段，也稱為HC-Fc 片段(包含免疫球蛋白重鏈的C-端部分)，以及Fab2片段，也稱為Fab2片段(包含免疫球蛋白重鏈和免疫球蛋白輕鏈的N-端部分)。這一方法尤其適用於分析在Fc片段中糖基化的或在Fc片段及Fab2片段中糖基化的免疫球蛋白的糖基化模式。對於次級糖基化位點的分析，可還原IdeS消化產物。還可能用這一方法分析降解產物。酶處理後，使該樣品進行 LC-MS分析，所述分析包括反相高效液相色譜(RP-HPLC)和在QTOF儀器(四極飛行時間質譜儀)上的在線MS分析。根據本發明的方法例如可用於產品批次表徵、監測下遊加工步驟以及監測發酵過程，甚至無需樣本提純(clean-up)。免疫球蛋白的CH2結構域N-端區域的GP (S)基序對用IdeS的消化是必需的。本文所使用的術語HC-Fc片段是指通過IdeS消化得到的免疫球蛋白重鏈的C-端片段，以及術語Fab2片段是指通過IdeS消化得到的免疫球蛋白的N-端片段，其包括完整的輕鏈。因此，在一個實施方案中，根據本發明的方法是用於表徵嵌合或人源化IgGdP IgGl、IgG2或 IgG4亞類的人或人源化免疫球蛋白或其變體，以及用於鼠IgG的某些亞類，即IgGh、IgG2b 或IgG3亞類的鼠免疫球蛋白或其變體。在一個實施方案中，在稍鹼性PH進行消化2小時。 為分析Fab2片段的糖基化模式，在一個實施方案中應用TCEP在酸性條件下進行額外的還原步驟，進行半小時。隨後如下文以及實施例中所述使樣本進行LC-MS分析。已發現，與在完整的免疫球蛋白重鏈或甚至完整的免疫球蛋白水平的糖基化模式分析相反，該方法具有更高的質量精確度、解析度和敏感度的優點。與其他酶例如木瓜蛋白酶或受限的LysC消化相比較，IdeS顯示出具有獨特的切割位點的優點，並且因此是高度特異的以及以類似的效率切割不同的亞類。不存在過度切割的風險，並且酶的活化不需要半胱氨酸。為分析降解產物，還原IdeS消化產物以產生三種抗體片段全長免疫球蛋白輕鏈、 兩個重鏈Fab片段(HC Fab片段)和重鏈Fc片段(HC Fc片段)。可通過色譜層析分離該三個種類，並逐個分析。這一方法是確定免疫球蛋白的Fc片段或Fab片段中是否存在/發生了降解(諸如氧化、脫醯胺作用或片段化)的簡單快速方法。某些降解反應，例如諸如氧化，導致保留時間的輕微移動，並且因此可用於快速監測來自製劑的樣本，以及通過應用UV 吸收檢測進行穩定性研究，這也是本發明的一個方面。在一個實施方案中，根據本發明的方法包括用尺寸排阻色譜法脫鹽的步驟，以及直接質譜法分析脫鹽分子混合物。免疫球蛋白的特異性切割單克隆免疫球蛋白是非常大的蛋白質，並且由於它們重鏈的糖結構，它們是非常不均一的(微不均一性)。對於降解產物的形成和/或修飾物，為了檢查免疫球蛋白的糖基化模式，在糖結構分析前將它們切割成更小的片段，這是有利的。二硫鍵的切割免疫球蛋白分子中存在的所有二硫鍵均可通過還原來切割。在還原過程中獲得免疫球蛋白的游離的重鏈和輕鏈。三(2-羧基乙基)_膦(TCEP)是常用的還原劑，因為免疫球蛋白所有的二硫鍵在短時間內完全被切割，並且還原在整個PH範圍內均可發生(參見例如 Hau，J. C.和 Hau，C. Y.，Anal. Biochem. 220 (1994) 5-10)。在一個實施方案中，pH 範圍從 1.5至8. 5。二硫蘇糖醇(DTT)也具有快速切割二硫鍵的特徵。但是，DTT還原在酸性環境中進行很差。為了完全分離重鏈和輕鏈，變性步驟通常是必要的。變性還使得二硫基更易受影響。在一個實施方案中，變性可以例如藉助胍/鹽酸或甲酸來進行。酶切割木瓜蛋白酶是一種半胱氨酸蛋白酶，其相對非特異地切割精氨酸(R)、賴氨酸 (K)、穀氨酸(E)、組氨酸(H)、甘氨酸(G)和酪氨酸⑴之後的肽鍵。如果溫育期間足夠或太長，木瓜蛋白酶消化導致免疫球蛋白的完全水解。但是，免疫球蛋白可以通過受限的蛋白水解相對選擇性地在它們的鉸鏈區被切割(Lottspeich，F.和Engels，J. W.，Bioanalytik SpektrumAkademischer Verlag，Munich，第二版 0006)201-214)。切割發生在將兩條重鏈連接在一起的二硫鍵的N-端側。二硫鍵在該過程中是得到保留的，從而獲得三個片段O 個Fab片段、1個Fc片段)。兩個N-端片段稱為抗原結合片段(Fab片段，Fab，抗原結合片段)，C-端片段稱為結晶片段(Fe片段，Fe,結晶片段)。每個Fab片段包含完整的輕鏈和氨基端的半個重鏈。Fc片段包含兩個仍然通過二硫鍵連接在一起的羧基端的半個重鏈。IdeS (化膿鏈球菌的免疫球蛋白G-降解酶)是細胞半胱氨酸蛋白酶，其可以從致病細菌化膿鏈球菌中分離。該酶直接在序列GP (SVFLFP)(即GP ( 基序)前高特異性切割人IgG。該序列位於將兩條重鏈(HC)連接在一起的二硫鍵的C-端側。切割產生兩條重鏈的 C-末端QfHC-Fc片段)和一個FalD2片段，所述？油2片段包含通過二硫鍵連接的輕鏈和重鏈的Fab 片段(圖 1) (von Pavel-Rammingen, U.等人，EMBO Journal 21(2002) 1607-1615)。 如果將免疫球蛋白通過IdeS切割獲得的片段在消化之後用DTT或TCEP還原，那麼獲得抗體的兩條輕鏈OLC)和兩條重鏈的N-端片段QHC Fab片段)，而不是Fab2片段。重鏈的 C-末端(HC-Fc)不受還原的影響。用於免疫球蛋白切割的通常使用的木瓜蛋白酶切割鉸鏈區的N-端。因此，木瓜蛋白酶消化必須還原，並在質譜的相同的m/z範圍內出現所有三個Ab片段(Fe、LC和HC Fab) ο本發明的一個方面是確定IgGl或IgG2或IgG4亞類的人或人源化免疫球蛋白、或 186加或化6213或IgG3亞類的鼠免疫球蛋白、或其變體的糖基化模式的方法，其包括以下步驟
a)通過用酶IdeS處理消化免疫球蛋白；b)通過反相高效液相色譜法分離通過酶消化獲得的免疫球蛋白的酶切割片段；c)對步驟b)中獲得的分離的免疫球蛋白片段進行質譜分析；以及d)從步驟C)中獲得的質譜數據確定免疫球蛋白的糖基化模式。已發現，通過使用特異性切割酶IdeS代替例如使用LysC或木瓜蛋白酶的限制性蛋白水解，可獲得確定的免疫球蛋白片段，其非常適於確定免疫球蛋白的糖基化模式。本申請中使用的術語「糖基化模式」是指與免疫球蛋白中一個或多個特定胺基酸殘基連接的作為一個整體的寡糖。由於細胞糖基化的不均一性，重組產生的免疫球蛋白不僅包含在特定胺基酸殘基上的單個、確定的N-或0-連接的寡糖，而是多肽的混合物，每一個多肽具有相同的胺基酸序列但在特定的胺基酸位置包含不同組成的寡糖。因此，上述術語表示與重組產生的免疫球蛋白的一個或多個特定胺基酸位置連接的一組寡糖，即連接的寡糖的不均一性。本申請所使用的術語「寡糖」是指包含兩個或多個共價連接的單糖單位的聚糖。在根據本發明的一個方法中，在第一個步驟中用酶IdeS消化/切割待確定其糖基化模式的免疫球蛋白為HC Fc片段和FalD2片段。如果需要確定Fal^2片段中糖基化位點的糖基化模式，在根據本發明方法的一個實施方案中，用還原劑還原免疫球蛋白二硫鍵。在酶切割和任選地還原步驟後，酸化溶液以誘導兩個重鏈Fc片段的解離。在一個實施方案中， 在還原免疫球蛋白二硫鍵相同的步驟中進行酸化。通過反相HPLC(RP-HPLC)分離獲得的片段。為確定糖基化模式，使含有免疫球蛋白的解離的重鏈Fc片段和任選的Fab2-或Fab片段的樣本進行質譜(MQ分析。應用MS分析的結果，確定免疫球蛋白的糖基化模式。在一個實施方案中，在除RP-HPLC之外的分開的步驟中進行MS分析(離線)。在另一實施方案中，在RP-HPLC之後直接進行MS分析(在線)，即將RP-HPLC的洗脫液直接引入MS設備中。在離線方法中，Fc糖基化模式確定包括SEC (尺寸排阻色譜法)脫鹽步驟，以及將樣本直接輸注至質譜儀。這一方法極快，能夠高通量，並且得益於在免疫球蛋白HC Fc片段的水平分析寡糖的高解析度、精確度和敏感性。糖基化HC Fc片段在質譜中出現在800至 2000的m/z範圍內(例如參見圖2)，而Fab2片段由於其雙倍重量而出現在1900至3000m/ ζ範圍內(例如參見圖3)。因此免疫球蛋白的這兩個片段可通過質譜分離，這是有助於數據解釋的效果。因此，本發明的一個方面是確定IgGl或IgG2或IgG4亞類的人或人源化免疫球蛋白、或IgGh或IgG2b或IgG3亞類的鼠免疫球蛋白、或其變體的糖基化模式的方法，其包括以下步驟a)通過用酶IdeS處理消化免疫球蛋白；b)通過尺寸排阻色譜法對通過酶消化獲得的免疫球蛋白酶切割片段脫鹽；c)對步驟b)中獲得的分離的免疫球蛋白片段進行質譜分析；以及d)從步驟C)中獲得的質譜數據確定免疫球蛋白的糖基化模式。在一個實施方案中，根據本發明的方法包括作為步驟a)的以下步驟a)通過用酶IdeS和用羧肽酶B處理，從而消化免疫球蛋白，在這一實施方案中，通過酶IdeS切割免疫球蛋白，以獲得HC Fc片段和Fab2片段， 並且在相同的步驟中移除免疫球蛋白重鏈的C-端賴氨酸，以減少免疫球蛋白的不均一性，即獲得更均一的樣本，而不影響糖基化模式。本申請中使用的術語"Fab2片段」是指通過用酶IdeS酶切割獲得的免疫球蛋白的 N端部分。本申請中使用的術語「HC Fc片段」是指通過用酶IdeS酶切割獲得的免疫球蛋白重鏈的C端部分。這一片段包含兩個沒有共價連接的多肽，即，每一個重鏈的C端片段。 由於酶IdeS在與木瓜蛋白酶和胃蛋白酶不同的位置上、且僅在免疫球蛋白的單個位點切割免疫球蛋白，因此僅獲得兩個但明確定義的免疫球蛋白片段。在另一實施方案中，該方法在步驟a)之後及步驟b)之前包括步驟al)，其為al)用甲酸處理通過步驟a)的酶消化獲得的酶切割的免疫球蛋白片段。在這一實施方案中，通過酶IdeS切割從免疫球蛋白獲得的包含彼此不共價連接的多肽的Fc片段被分離為兩個pFc片段。本申請中使用的術語「pFc片段」是指用酶IdeS 酶切割後從免疫球蛋白重鏈獲得的單個C端多肽。在另一實施方案中，根據本發明的方法的步驟al)是al)用甲酸和還原劑處理通過步驟a)的酶消化獲得的酶切割的免疫球蛋白片段。在這一實施方案中，通過還原連接的二硫鍵，將用酶IdeS酶切割免疫球蛋白後獲得的Fab2片段進一步分離為兩個Fab片段。在一個實施方案中，在添加還原劑的同時添加甲酸。在另一實施方案中，所述還原劑是TCEP溶液。在這一實施方案中，甲酸和TCEP溶液均在溫育之前添加，因此兩個成分均在單步驟中存在。根據本發明的方法包括將含有待確定其糖基化模式的免疫球蛋白的樣品與不同的酶和試劑溫育。這些化合物和試劑用於將樣品中包含的免疫球蛋白轉化為確定的片段。 在該方法的一個實施方案中，IgG-特異性半胱氨酸蛋白酶IdeS是獲自化膿鏈球菌或齒垢密螺旋體的IdeS。在進一步優選的實施方案中，IgG-特異性半胱氨酸蛋白酶具有胺基酸序列SEQ ID N0:1。在一個實施方案中，用IgG-特異性半胱氨酸蛋白酶的酶切割在pH範圍 WpH 5. 5至8. 5之間進行。在一個實施方案中，酶切割在pH範圍從pH 7.0至8.0之間。 還發現IgG-特異性半胱氨酸蛋白酶與免疫球蛋白分子的摩爾比應該在1 25至1 2500 之間，在另一實施方案中，在1 25至1 100之間。在根據本發明的方法的一個實施方案中，將反相高效液相色譜法或尺寸排阻色譜的洗脫液直接輸注至質譜儀。若在根據本發明的方法中，必須確定免疫球蛋白Fab片段中的糖基化模式，則該方法包括以下步驟a)通過用酶IdeS處理消化免疫球蛋白；b)用甲酸和還原劑處理步驟a)的酶切割的免疫球蛋白；c)通過反相高效液相色譜法分離獲得的所述免疫球蛋白的片段和/或通過尺寸排阻色譜法對獲得的片段脫鹽；d)通過直接輸注至質譜儀，對步驟C)中獲得的分離的免疫球蛋白片段進行質譜分析；以及e)從步驟d)中獲得的質譜數據確定免疫球蛋白的糖基化模式。本發明的另一個方面是確定IgGl或IgG2或IgG4亞類的重組產生的人或人源化免疫球蛋白、或IgGh或IgG2b或IgG3亞類的鼠免疫球蛋白的糖基化模式的方法，其包括以下步驟
a)提供重組產生的免疫球蛋白樣本；b)通過用酶IdeS處理消化免疫球蛋白；c)用甲酸和還原劑處理步驟b)的酶切割的免疫球蛋白；d)通過反相高效液相色譜法分離獲得的所述免疫球蛋白的片段和/或通過尺寸排阻色譜法對獲得的片段脫鹽；e)通過直接輸注至質譜儀，對步驟d)中獲得的分離的免疫球蛋白片段進行質譜分析；以及f)從步驟e)中獲得的質譜數據確定免疫球蛋白的糖基化模式。本發明的另一方面是用於產生IgGl或IgG2或IgG4亞類的人或人源化免疫球蛋白、或IgGh或IgG2b或IgG3亞類的鼠免疫球蛋白的Fab2片段或Fab片段的方法，其包括以下步驟a)提供從其中獲得Fab2片段或Fab片段的免疫球蛋白；b)通過用酶IdeS消化而切割所述免疫球蛋白；c)若欲產生Fab片段，則用甲酸和還原劑處理步驟b)的所述酶切割的免疫球蛋白；d)通過使用A蛋白色譜或尺寸排阻樹脂的色譜法產生所述Fab2片段或所述Fab 片段。為純化重組產生的異種免疫球蛋白，通常採用不同柱色譜步驟的組合。在一個實施方案中，在A蛋白親和色譜之後採用一個或兩個其他的色譜分離步驟，例如離子交換色譜步驟。最終的純化步驟也稱為「精製步驟」，用於移除痕量雜質和汙染物，例如聚集的免疫球蛋白、殘餘HCP(宿主細胞蛋白)、DNA(宿主細胞核酸)、病毒和/或內毒素。對於這一精製步驟，通常在流通模式中使用陰離子交換色譜材料。已很好地建立了不同的方法並廣泛應用於蛋白質回收和純化，諸如應用微生物蛋白質的親和色譜(例如，A蛋白或G蛋白親和色譜)、離子交換色譜(例如，陽離子交換(羧甲基樹脂)、陰離子交換(氨乙基樹脂)和混合模式交換)、嗜硫吸附(例如，用巰基乙醇和其他SH配體)、疏水相互作用或芳香吸附色譜(例如，應用苯基瓊脂糖凝膠、親雜氮芳基樹脂(aza-arenophilic resin)、或間氨基苯基硼酸)、金屬螯合親和色譜(例如，應用 Ni (II)-和Cu (II)-親和材料)、尺寸排阻色譜法和電泳方法(諸如凝膠電泳、毛細管電泳) (Vijayalakshmi, Μ. A.，Appl.Biochem.Biotech. 75(1998)93—102)。在一個實施方案中，該辦法包括在適於表達異源免疫球蛋白的條件下培養包含編碼該免疫球蛋白的核酸的真核細胞。術語「在適於表達免疫球蛋白的條件下」是指用於培養表達免疫球蛋白的哺乳動物細胞的條件，並且其對本領域技術人員而言是公知的或可容易地確定。本領域技術人員還公知這些條件可依據所培養的哺乳動物細胞類型以及依據所表達的免疫球蛋白類型而不同。一般地，例如在20°C至40°C之間的溫度培養哺乳動物細胞， 並且培養足以允許有效產生免疫球蛋白的時間，例如4至觀天。本發明的另一方面是通過應用根據本發明的方法監測重組產生的免疫球蛋白的糖基化模式的方法。本發明的另一方面是用於產生蛋白質的方法，其包括以下步驟a)用酶IdeS酶切割蛋白質-免疫球蛋白融合蛋白，並由此產生該蛋白質。
提供了以下實施例、序列表和附圖以幫助理解本發明，本發明的真實範圍在所附權利要求中提出。應當理解，在不背離本發明的精神下可對提出的方法進行改變。序列表說明SEQ ID NO :1來自化膿鏈球菌的IdeS的胺基酸序列。SEQ ID NO :2CH1處開始且在CH2處結束的鼠IgGh免疫球蛋白序列。SEQ ID NO :3CH1處開始且在CH2處結束的鼠IgG3免疫球蛋白序列。SEQ ID NO 4 人 IgGl 恆定區。SEQ ID NO :5 人 IgG4 恆定區。附圖描述

圖1 :IgGl免疫球蛋白的IdeS消化的示意圖。圖2 通過SEC和直接輸注至質譜儀分析的經IdeS切割的人IgGl的質譜。該質譜僅顯示了糖基化的Fc片段。圖3:通過SEC和直接輸注至質譜儀分析的經IdeS切割的人IgGl的質譜。該質譜顯示了糖基化的Fc片段和Fab2片段。圖4 =IdeS消化且經還原的鼠IgG3免疫球蛋白的色譜圖。圖5 鼠IgG3免疫球蛋白的在鉸鏈區中具有0糖基化的重鏈Fab片段的放大質譜。圖6 鼠IgG3免疫球蛋白的具有N糖基化的重鏈Fc片段的放大質譜。圖7 從 LC-MS 獲得的 0 糖基化胰蛋白酶肽(tryptic peptide) (IPKPSTPPGSSCPPG NILGGPSVFIFPPKPK(HC =重鏈，胺基酸(aa) 217-247 ；S和T 可能的0糖基化位點)的去卷積質譜。圖8 =IdeS消化的人源化IgG4免疫球蛋白的色譜圖。圖9 人源化IgG4免疫球蛋白的具有N糖基化的重鏈Fc片段的放大質譜。圖10 =IdeS消化的人源化IgGl免疫球蛋白的色譜圖。圖11 人源化IgGl免疫球蛋白的具有N糖基化的重鏈Fc片段的放大質譜。圖12 =IdeS消化的人源化IgGl免疫球蛋白的色譜疊加圖，所述免疫球蛋白取自培養物上清液和A蛋白純化的樣本。圖13 =IdeS消化的人源化IgGl免疫球蛋白的質譜疊加圖，所述免疫球蛋白取自培養物上清液和A蛋白純化的樣本(保留時間16. 8分鐘)。圖14 :IdeS消化的人源化IgGl免疫球蛋白的放大的質譜疊加圖，所述免疫球蛋白取自培養物上清液和A蛋白純化的樣本(保留時間16. 8分鐘)。圖15 完整免疫球蛋白、Fab2片段和標準品的分析尺寸排阻色譜疊加圖。實施例1確定抗體濃度抗體濃度通過在UVIKON XL型分光光度計(Goebel Company)上測量^Onm處的吸收來測定。所用的抗體的消光係數是1. 55ml/(mg cm)並且根據I^Ce，C. N.等人(Protein Sci. 4(1995)2411-2423)的方法來計算。實施例2—般方法 A (用於 IgGl、IgG3)分析Fc片段糖基化模式的IdeS消化
將100 μ g(0. 66nmol)免疫球蛋白在50mM TRIS/HC1緩衝液pH 8. 0中稀釋至lmg/ml的終濃度，並添加2μ 1 (c = lmg/ml,0. 06nmol)免疫球蛋白降解酶(IdeS，漏 345890Da)，以得到重量比為1 50的酶與免疫球蛋白之比。取決於所使用的免疫球蛋白， 將該溶液在37°C溫育2至5小時。為了用尺寸排阻色譜法分析以及直接輸注至質譜儀，通過添加等體積的甲酸至該溶液終止酶活性。還原IdeS消化的免疫球蛋白，用於Fab片段的糖基化模式的額外分析為了還原，將一半樣本用64μ 1 IOOmM的磷酸鉀緩衝液pH 7.0稀釋，得到115 μ 1 終體積。然後，加入60 μ 1溶解於一體積4Μ鹽酸胍中的0. 5MTCEP (三(2-羧基乙基)膦， Pierce)和50ml 8M鹽酸胍。隨後，在37°C溫育該樣本30分鐘。通過添加5 μ 1 20% (ν/ ν)甲酸終止反應。實施例3一般方法 B (用於 IgGl、IgG3、IgG4)聯合IdeS和CpB消化將100 μ g(0. 66nmol)免疫球蛋白在50mM TRIS/HC1緩衝液pH 8. 0中稀釋至lmg/ml的終濃度，並添加2μ 1 (c = lmg/ml,0. 06hmol)免疫球蛋白降解酶(IdeS，漏 345890Da)，以得到重量比為1 50的酶與免疫球蛋白之比。取決於所使用的免疫球蛋白， 將該溶液在37°C溫育2至5小時。在IdeS溫育時間結束之前30分鐘，添加1 μ 1 (lmg/ ml)羧肽酶 B (CpB，Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,Germany)至該溶液，得到重量比為 1 25的酶與免疫球蛋白之比。實施例4一般方法C(用於具有複雜糖基化模式的IgG)聯合IdeS 和 EndoH 消化將25 μ g(0. 17nmol)免疫球蛋白在pH 6. 0的磷酸鈉緩衝溶液中稀釋至0. 5mg/ml 的終濃度，並添加 2. 5 μ 1 (C = 2. 5U/500 μ 1)的內切糖苷酶 H(Roche Diagnostics GmbH, 1&111111^加，661~1^1^)，在371溫育1811，以切割寡糖結構。隨後，通過添加25 μ 1 0. IM TRIS/ HCl緩衝液pH 8. 0將pH調節至8. 0。通過添加0. 5 μ 1 (c = lmg/ml，0. 02nmol)免疫球蛋白降解酶(IdeS，MW 345890Da)，並在37°C溫育2h，實現免疫球蛋白的切割。實施例5一般方法D (用於培養上清液)聯合IdeS和CpB消化將50μ g(0. 33nmol)表達免疫球蛋白的真核細胞的培養上清液在10，800rcf (相對離心力)離心3分鐘，並在50mM TRIS/HC1緩衝液pH 8. 0中稀釋至0. 7mg/ml的終濃度。添加1μ l(c = lmg/ml，0. 06nmol)免疫球蛋白降解酶(IdeS，MW 345890Da),以得到重量比為1 50的酶與免疫球蛋白之比。取決於所使用的免疫球蛋白，將該溶液在37°C 溫育2至5小時。在IdeS溫育時間結束之前30分鐘，添加1μ l(lmg/ml)羧肽酶B(CpB， RocheDiagnostics GmbH,Mannheim,Germany)至該溶液，得至Ij重量比為1 25的醇與免疫球蛋白之比。實施例6RP-HPLC-MS 方法
在與QTOF II (Micromass/Waters)偶聯的 Agilent Cap LCllOO 上進行 LC-MS。在 Phenomenex Jupiter C18柱(5 μ m粒度、300人孔大小，1x250mm柱)進行色譜分離。洗脫液A是0. 5%甲酸，洗脫液B是70%異丙醇、20%乙腈、9. 5%水和0. 5%甲酸。流速是40 μ 1/ 分鐘，在75°C進行分離，將根據實施例2-5之一的方法獲得的2 μ g(10 μ 1)免疫球蛋白注射至柱上。使用了以下梯度
權利要求
1.確定IgGl或IgG2或IgG4亞類的人或人源化免疫球蛋白、或IgGh或IgG2b或IgG3 亞類的鼠免疫球蛋白、或它們的變體的糖基化模式的方法，所述方法包括以下步驟a)通過用酶IdeS酶消化將所述免疫球蛋白切割為片段；b)通過反相高效液相色譜法分離通過酶消化獲得的所述免疫球蛋白的片段；c)對步驟b)中獲得的分離的所述免疫球蛋白片段進行質譜分析；以及d)從步驟c)中獲得的質譜數據確定所述免疫球蛋白的糖基化模式。
2.確定IgGl或IgG2或IgG4亞類的人或人源化免疫球蛋白、或IgGh或IgG2b或IgG3 亞類的鼠免疫球蛋白的Fab2片段的糖基化模式的方法，其包括以下步驟a)通過用酶IdeS酶消化將所述免疫球蛋白切割為片段；b)用甲酸和還原劑處理步驟a)的所述酶消化的免疫球蛋白；c)通過反相高效液相色譜法或尺寸排阻色譜法分離獲得的所述免疫球蛋白的片段；d)通過直接輸注至質譜儀，對步驟b)中獲得的分離的所述免疫球蛋白片段進行質譜分析；以及e)從步驟c)中獲得的質譜數據確定所述Fal32片段的糖基化模式。
3.產生IgGl或IgG2或IgG4亞類的人或人源化免疫球蛋白、或IgGh或IgG2b或IgG3 亞類的鼠免疫球蛋白的Fab2片段或Fab片段的方法，其特徵在於該方法包括以下步驟a)提供從其中獲得Fab2片段或Fab片段的免疫球蛋白；b)通過用酶IdeS酶消化，將所述免疫球蛋白切割為Fab2片段和HC-FC片段；c)如果欲產生Fab片段，則用甲酸和還原劑處理步驟b)的所述酶切割的免疫球蛋白；d)通過使用步驟b)或c)中獲得的片段的A蛋白色譜樹脂的色譜法產生所述Fal32片段或所述Fab片段。
4.監測樣本的方法，其包括以下步驟a)儲存樣本一段時間；b)通過用酶IdeS酶消化將所述免疫球蛋白切割為片段；c)通過反相高效液相色譜法分離通過酶消化獲得的所述免疫球蛋白的片段；d)用甲酸和還原劑處理步驟c)的所述酶切割的免疫球蛋白；e)通過反相高效液相色譜法或尺寸排阻色譜法分離獲得的所述免疫球蛋白的片段；f)通過與用步驟b)至e)處理的參考樣本相比較的片段保留時間的位移，確定降解產物的存在。
5.根據前述權利要求任一項的方法，其特徵在於所述分離步驟是 通過尺寸排阻色譜法對獲得的所述免疫球蛋白的片段脫鹽。
6.根據前述權利要求任一項的方法，其特徵在於所述切割步驟通過用酶IdeS酶消化將所述免疫球蛋白切割為片段，並用羧肽酶B處理所述免疫球蛋白。
7.根據前述權利要求任一項的方法，特徵在於所述方法在所述切割步驟之後和所述純化步驟之前包括以下步驟用甲酸和還原劑處理所述酶切割的免疫球蛋白。
8.根據前述權利要求任一項的方法，其特徵在於所述切割在pH5.5至？!1 8.5的？!1範圍內進行。
9.根據前述權利要求任一項的方法，其特徵在於所述切割進行2小時。
10.根據前述權利要求任一項的方法，其特徵在於所述還原劑是三(2-羧基乙基)-膦。
11.根據前述權利要求任一項的方法，其特徵在於IdeS與免疫球蛋白分子的摩爾比是 1 25 至 1 2500 之間。
全文摘要
本發明涉及確定IgG1或IgG4亞類的人免疫球蛋白、或IgG2a或IgG3亞類的鼠免疫球蛋白的糖基化模式的方法，其包括以下步驟a)通過用酶IdeS酶消化將所述免疫球蛋白切割為片段；b)通過反相高效液相色譜法分離通過酶消化獲得的所述免疫球蛋白的片段；c)對步驟b)中獲得的分離的所述免疫球蛋白片段進行質譜分析；以及d)從步驟c)中獲得的質譜數據確定所述免疫球蛋白的糖基化模式。
文檔編號C07K16/06GK102308216SQ201080007076
公開日2012年1月4日 申請日期2010年2月5日 優先權日2009年2月9日
發明者A·策克, H·科爾, J·T·雷古拉, P·松德爾曼 申請人:羅切格利卡特公司