一種全人源化EGFRvIII嵌合抗原受體T細胞及其製備方法與流程
2023-09-09 20:58:05
本發明涉及一種嵌合抗原受體T細胞及其製備方法，具體涉及一種全人源化EGFRvIIICART細胞及其製備方法。
背景技術：
：據《2011年中國腫瘤登記年報》報導，腦瘤或中樞神經系統腫瘤是死亡率排名第十位的惡性腫瘤。腦瘤內惡性程度較高的為膠質母細胞瘤，約佔膠質瘤一半的比例。當前，膠質母細胞瘤的治療方式主要是手術、放療和化療，存在著治癒率低、藥物副作用大和復發率高等問題，至今仍沒有有效的治療手段，使得患者生存時間通常少於2年。近年來，隨著腫瘤免疫學理論和技術的發展，免疫治療作為一種新的治療手段，主要通過人為幹預來調動機體自身免疫系統，對癌細胞進行殺滅的作用日益受到重視。目前，最熱門、最有效的免疫治療手段包括免疫檢查點抑制劑和嵌合抗原受體T細胞(ChimericAntigenReceptorTcells，CART)。其中，免疫檢查點抑制劑包括針對CTLA4、PD1、PDL1等免疫抑制分子的抗體，已被美國FDA批准用於黑色素瘤、肺癌等的治療(中國國內正在進行臨床試驗)；CART在治療白血病和淋巴瘤時，顯示了巨大的優勢，對於兒童復發、難治白血病，臨床數據達到了93％的完全緩解率(CR)。天然狀況下，由免疫反應(病毒、腫瘤抗原)活化的T細胞在識別、殺死靶細胞時，主要受到兩種信號的刺激，一個為第一信號，來自T細胞受體(Tcellreceptor,TCR)和CD3分子複合體，另一個為協同刺激信號，來自協同刺激分子CD28、4-1BB。T細胞只有受到這兩種信號刺激時，才能充分活化，發揮殺傷功能。但是，許多腫瘤細胞會通過下調TCR分子識別的MHC-抗原肽複合物，或者下調共刺激分子，使T細胞不能發揮殺傷功能，從而逃避免疫系統的攻擊，影響其治療效果。CART是基因工程改造的T細胞，是近年來發展的靶向免疫治療新策略，CAR分子一端為抗體的抗原識別區(單鏈抗體scFv)，另一端為胞內區，活化T細胞。不同代數CART的胞內區不同，最早的第一代CART只有CD3分子的胞內區，不能充分增殖，臨床效果不好；第二代CART胞內區為協同刺激分子CD28+CD3ζ或4-1BB+CD3ζ，能夠傳遞T細胞活化的兩種信號，在2011年臨床試驗治療白血病時顯示了神奇的效果，能夠清除所有白血病細胞，達到完全治癒腫瘤的目的；第三代CART中加入了兩種協同刺激分子CD28和4-1BB分子，連同CD3ζ分子，能提供T細胞更多的活化信號，賦予T細胞更強的增殖性、持久的生命力，特異性地識別靶向性殺傷腫瘤細胞，尚未在臨床應用。理想的腫瘤抗原應該是在正常組織中不表達或極少表達，在腫瘤組織的細胞中表達率高，它為腫瘤細胞生長過程中所必須的，避免腫瘤細胞通過不表達該抗原而逃避免疫監視。表皮生長因子受體III突變體(EGFRvIII)為表皮生長因子受體(EGFR)基因的突變體，EGFRvIII主要表達於膠質母細胞瘤內，EGFRvIII常與EGFR基因擴增同時存在，EGFR和EGFRvIII的表達見表1。表1-EGFR和EGFRvIII在不同腫瘤組織的表達腫瘤類型EGFR高表達比例EGFRvIII高表達比例膠質母細胞瘤40-63％24-64％頭頸癌43-100％42-48％非小細胞肺癌32-84％0-5％乳腺癌14-91％27-36％結直腸癌25-77％0％胰腺癌30-95％無數據相比EGFR，EGFRvIII主要為EGFR胞外區的外顯子2-7缺失，但是剩餘基因的閱讀框沒有改變，能夠繼續轉錄、翻譯出EGFR外顯子8後面的胺基酸，由此形成腫瘤特異性表位，其胞內區能夠傳遞信號，導致細胞向惡性轉化，EGFRvIII特異性表達於腫瘤細胞內，正常組織沒有表達，因此EGFRvIII是較好的腫瘤免疫治療的靶點。細胞學方面的實驗表明EGFRvIII促進細胞增殖、浸潤，抵抗凋亡，使腫瘤細胞對放療及一些化療藥物具有抵抗性，與腫瘤的發生、發展有密切關係。EGFRvIII在人類肺鱗癌標本內，有5％的檢出率；EGFRvIII基因在小鼠肺組織內表達能夠導致腫瘤，表明EGFRvIII過表達能夠促進腫瘤發生，過表達EGFRvIII的膠質母細胞瘤細胞對通常的EGFR抑制劑治療無效，惡性程度較高。臨床試驗以EGFRvIII特異肽段增強的DC細胞回輸患者，可將患者中位生存時間從63.3周提高到110.8周。2013年，SampsonJ.H.構建了針對EGFRvIII的3代CART細胞，與放療配合，在動物實驗中能夠有效的清除膠質瘤細胞。然而，SampsonJ.H儘管使用了3代CART結構，但是其使用的識別EGFRvIII的抗體序列為鼠源的，活化T細胞的分子也是鼠源的，使得構建的3代CART結構只能活化小鼠T細胞，不能夠活化人T細胞。現有技術CN201480009507.1公開了使用人源化抗EGFRvIII嵌合抗原受體治療癌症中主要用到是小鼠抗體序列3C10，而選用139抗體序列只做了2代CAR，沒有做動物實驗。因此，全人源化EGFRvIIICART細胞關鍵之處在於設計全人源識別EGFRvIII的scFV序列使用在3代CART結構，證明此種設計能夠使CART細胞具有殺傷EGFRvIII表達細胞的功能，通過細胞實驗和動物實驗均證明有效才可行。技術實現要素：本發明的目的是通過以下技術方案實現的，一種全人源化EGFRvIIICART細胞，所述T細胞表面表達全人源化EGFRvIIICAR基因，其鹼基序列如SEQIDNO:3所示。進一步，所述全人源化EGFRvIIICAR基因是由合成的ScFV基因和合成的3代CAR結構基因通過重疊PCR進行拼接。進一步，所述合成的ScFV基因包括編碼CD8信號肽的核苷酸+全人源化139抗體的輕鏈可變區胺基酸密碼子優化的核苷酸+編碼linker(G4S)3+全人源化139抗體的重鏈可變區胺基酸密碼子優化的核苷酸序列，其鹼基序列如SEQIDNO:1所示。進一步，所述合成的3代CAR結構基因包括編碼CD8鉸鏈區+CD28跨膜區、胞漿區+4-1BB胞漿區+CD3ζ胞漿區的核苷酸片段，其鹼基序列如SEQIDNO:2所示。本發明進一步的目的是通過以下技術方案實現的，一種全人源化EGFRvIIICART細胞的製備方法，包括以下步驟：(1)構建3代慢病毒CAR載體：首先將合成的ScFV基因或合成的3代CAR結構基因分別擴增PCR，得到合成的ScFV基因片段的PCR產物和合成的3代CAR結構基因片段的PCR產物；然後進行重疊PCR將這兩個基因片段的PCR產物連接在一起，得到3代CAR結構的EGFRvIIICAR基因；最後將Pre-Lenti-EF1-MCS載體和EGFRvIIICAR基因雙酶切，連接，轉化，提質粒，測序，得到序列正確的表達EGFRvIIICAR的慢病毒載體Pre-Lenti-EF1-EGFRvIIICAR；(2)包裝EGFRvIIICAR慢病毒，感染T細胞，製備得到CART進行細胞殺傷實驗驗證，證明有效；(3)再次製備EGFRvIIICART，進行動物實驗功能驗證，證明有效。進一步，步驟(1)中，用於所述擴增PCR的引物為EGFRvIII-EcoRI-up序列如SEQIDNO:4所示和EGFRvIII-BamHI-down序列如SEQIDNO:5所示。進一步，步驟(1)中，用於所述重疊PCR的引物為Middle-R如SEQIDNO:6所示和Middle-F如SEQIDNO:7所示。進一步，步驟(1)中，所述測序引物為Pre-up-Seq，如SEQIDNO:8所示和Pre-down-Seq，如SEQIDNO:9所示。進一步，步驟(1)中，所述雙酶為EcoRI限制性內切酶和BamHI限制性內切酶。本發明的優點在於利用全人源化139抗體序列設計構建了3代全人源化EGFRvIIICART的結構，進行了細胞實驗和動物實驗，皆證明有效,能夠活化人T細胞，是目前最新的針對EGFRvIII靶點的CART設計，能夠用於人體腫瘤的治療，為EGFRvIIICART細胞進行臨床試驗、臨床研究提供了基礎。附圖說明通過閱讀下文優選實施方式的詳細描述，各種其他的優點和益處對於本領域普通技術人員將變得清楚明了。附圖僅用於示出優選實施方式的目的，而並不認為是對本發明的限制。而且在整個附圖中，用相同的參考符號表示相同的部件。在附圖中：圖1為本發明EGFRvIIICAR慢病毒載體構建流程圖。圖2(a)-(b)為CART細胞殺死表達EGFRvIII的MC38靶細胞的鏡下圖。圖3為Real-timePCR鑑定MC38EGFRvIII的表達。圖4為LDH釋放實驗檢測CART的殺傷率。其中1為MC38-EGFRvIII+controlCART的殺傷率；2為MC38-EGFRvIII+EGFRvIIICART的殺傷率。圖5為EGFRvIIICART抑制小鼠皮下腫瘤實驗設計流程。圖6為EGFRvIIICART抑制小鼠皮下腫瘤體積變化。圖7為EGFRvIIICART抑制小鼠皮下腫瘤體重變化。具體實施方式下面將參照附圖更詳細地描述本公開的示例性實施方式。雖然附圖中顯示了本公開的示例性實施方式，然而應當理解，可以以各種形式實現本公開而不應被這裡闡述的實施方式所限制。相反，提供這些實施方式是為了能夠更透徹地理解本公開，並且能夠將本公開的範圍完整的傳達給本領域的技術人員。實施例1：Pre-Lenti-EF1-EGFRvIIICAR載體構建1、合成的ScFV基因：包括編碼CD8信號肽的核苷酸+全人源化139抗體的輕鏈可變區胺基酸密碼子優化的核苷酸+編碼linker(G4S)3的核苷酸+全人源化139抗體的重鏈可變區胺基酸密碼子優化的核苷酸序列，其鹼基序列如SEQIDNO:1所示。其中，全人源化識別EGFRvIII的139抗體序列參見世界專利WO2005010151A2。2、合成的3代CAR基因：包括編碼CD8鉸鏈區+CD28跨膜區、胞漿區+4-1BB胞漿區+CD3ζ胞漿區的核苷酸片段，其鹼基序列如SEQIDNO:2所示。3、將合成的ScFV基因和合成的3代CAR基因通過重疊PCR反應進行拼接，得到3代結構的EGFRvIIICAR基因，如SEQIDNO:3所示。具體過程如下：(1)引物設計：使用序列分析軟體pDRAW32分析EGFRvIIICAR基因序列，單酶切位點EcoRI、BamHI適合用於基因克隆，能夠和Pre-Lenti-EF1-MCS載體的多克隆位點匹配，設計兩端引物：EGFRvIII-EcoRI-up序列：CGGAATTCGCCACCATGGCCTTACCAGTGACCGC，如SEQIDNO:4所示；EGFRvIII-BamHI-down序列：CGGGATCCTTAGCGAGGGGGCAGGGCCTG，如SEQIDNO:5所示。用於重疊PCR的引物：Middle-R，GTCGTGGTGGGCTTCGCTGGGCTAGACACTGTGACCAGTG，如SEQIDNO:6所示。Middle-F，CACTGGTCACAGTGTCTAGCCCAGCGAAGCCCACCACGAC，如SEQIDNO:7所示。(2)PCR擴增、分子克隆：EGFRvIII-EcoRI-up和Middle-R引物以EGFRvIIIScFV基因為模板得到前面片段EGFRvIIIScFV，Middle-F和EGFRvIII-BamHI-down引物以3代CAR基因為模板得到後面片段CD8鉸鏈區-CD28跨膜區+胞漿區-4-1BB胞漿區-CD3ζ胞漿區，然後重疊PCR，得到全長3代EGFRvIIICAR基因，克隆到Pre-Lenti-EF1-MCS載體，送測序，測序引物為：Pre-up-Seq引物，GGAGCCTACCTAGACTCAGC，如SEQIDNO:8所示，Pre-down-Seq引物，CAACCAGGATTTATACAAGG，如SEQIDNO:9所示。測序結果經比對，完全正確，得到了表達EGFRvIII3代CAR基因的慢病毒載體Pre-Lenti-EF1-EGFRvIIICAR(見圖1)。由此，採用容易在T細胞表達的EF1啟動子，採用全人源識別EGFRvIII的抗體序列，使用慢病毒表達體系構建了完全適合臨床試驗、臨床研究的CART用EGFRvIII載體。實施例2：細胞殺傷實驗1、慢病毒包裝：(1)包裝細胞293T細胞培養於37℃，5％CO2孵箱內，培養基為DMEM(Hyclone)/10％FBS(蘭州百靈)。(2)包裝前一天，0.25％胰酶消化293T細胞，1×107細胞/培養皿種植10cm培養皿。(3)轉染細胞時，除了Pre-Lenti-EF1-MCS-EGFRvIIICAR穿梭質粒外，還要加入包裝質粒psPAX2、pMD2.0G共轉染，其中Pre-Lenti-EF1-MCS-EGFRvIIICAR質粒5μg，psPAX2質粒3.75μg，pMD2.0G質粒1.25μg。轉染時，將三種質粒的混合物加入500μlMEM培養基(Hyclone)內，在另一個微型離心管內將25μlLipofectamine2000試劑(LifeTechnologies)加入到500μlMEM培養基(Hyclone)內，然後將稀釋的轉染試劑緩慢逐滴加入稀釋的質粒上方，輕輕渦旋，離心，室溫靜置20min，期間將10cm培養皿內舊培養基換為MEM培養基，最後將質粒和轉染試劑的混合物均勻加入10cm培養皿內，輕輕搖晃混勻，放入CO2孵箱；孵育5h後，將培養基換為新鮮含血清培養基。(4)細胞轉染48h後，可以收穫病毒，將10ml含病毒培養基轉入15ml離心管內，4℃，1250rpm，離心5min，去除混入的293T細胞；然後將含病毒培養基通過0.45um濾器過濾，濃縮，分裝，-80℃凍存，並留存部分病毒(約40ul)測定滴度。2、外周血單核細胞分離(1)抽血：在無菌條件下，抽取肝素抗凝的人體靜脈血10ml。(2)分離外周血單核細胞：採用淋巴細胞分離液(達科為生物工程有限公司)，依照產品說明書進行，獲得外周血單核細胞，用含IL2(1000u/ml)、10％滅活血清的1640培養基重懸，計數。3、T細胞純化(1)外周血單核細胞計數：取1×107個外周血單核細胞於1.5ml微型離心管中。(2)250g，22℃，離心10分鐘，收集細胞沉澱。(3)吸棄上層液體，80μL無菌磁珠分離液重懸細胞，加入20μl無菌的人CD3MicroBeads(美天旎)。(4)4℃冰箱中放置1小時，期間，輕彈一次，懸起細胞。(5)1小時後，加入1mL的磁珠分離液，輕輕上下顛倒混勻，250g，4℃離心10min。期間準備純化過濾柱，將純化過濾柱安放在磁鐵上(美天旎)，用500μl的磁珠分離液潤洗。(6)離心後的細胞棄上清，500μl磁珠分離液重懸，加入過濾柱，細胞懸液隨重力流出後，純化過濾柱用500μl的磁珠分離液洗四次。(7)將純化過濾柱從磁鐵上卸掉，使用1mL磁珠分離液將磁性吸附的T細胞快速衝出，至1.5ml微型離心管。(8)250g，4℃，離心10min。(9)含IL2(1000u/ml)、含10％滅活血清的1640培養基重懸，計數。4、T細胞慢病毒感染(1)純化得到的T細胞計數，2×106T細胞/培養孔(6孔板)種植，培養過夜後，加入MOI(感染複數)為2的對照病毒液(空載體包裝，Control)和Pre-Lenti-EF1-MCS-EGFRvIIICAR病毒液，換為酶標板離心轉子，1000g，22℃，離心30min，放入CO2孵箱，感染過夜。(2)感染第一天，補加1ml新鮮培養基(IL2(1000u/ml)、10％滅活血清)。(3)感染第三天，T細胞增殖非常旺盛，將T細胞收穫、洗滌離心後轉入25cm2塑料培養瓶。(4)CART細胞擴增至一定數量後，利用流式細胞儀(使用Jacksonimmnuoresearch的FITC標記山羊抗人Fab段抗體)鑑定EGFRvIIICART表面,識別EGFRvIII的單鏈抗體的表達陽性率。5、殺傷實驗(1)通過Real-timePCR的方法，檢測了9種腫瘤細胞系，都沒有檢測到EGFRvIII的表達。因此，我們構建了表達EGFRvIII的慢病毒載體，感染MC38或BxPC細胞，得到的穩定細胞系能夠高水平的表達EGFRvIII(圖3)。計數高表達EGFRvIII的MC38細胞，1×104個細胞/孔(96孔板)；計數感染的T細胞(Control病毒液感染的ControlT細胞和Pre-Lenti-EF1-MCS-EGFRvIIICAR病毒液感染的EGFRvIIICART細胞)，按照效靶比10:1,5:1,2.5:1的比例加入MC38-EGFRvIII細胞上層，實驗設計見表2。表2-殺傷實驗設計表(靶細胞：MC38-EGFRvIII)6、殺傷測量通過測量被CART殺死的死亡細胞釋放的LDH，來確定CART細胞殺死靶細胞的效果(圖2、圖4)。(1)操作按照Promega公司LDH釋放試劑盒說明書(CytoTox96非放射性細胞毒性檢測，貨號：G1780)進行。(2)步驟5中的殺傷實驗過夜，約18h後，最大釋放孔加入10×細胞裂解液(10xlysisbuffer)20ul，混勻。(3)2h後，96孔板內每孔取50μl上清，加入50μlLDH酶底物，室溫避光靜置反應20min，酶標儀測量波長492nm處的吸光度OD492。(4)殺傷率計算公式為式中，實驗孔為不同設計效靶比得到的OD492，效應細胞自發為ControlT細胞或EGFRvIIICART細胞的OD492，靶細胞自發為靶細胞最小釋放，靶細胞最大為加入裂解液後，細胞全部死亡的最大釋放。CART細胞殺死表達EGFRvIII的MC38靶細胞，見圖2(a)-(b)。由圖2(b)可知，梭型的腫瘤細胞幾乎消失，CART細胞活化後聚集成團。根據殺傷率計算公式計算得到的殺傷率見圖4。由圖4可知，LDH釋放實驗檢測CART的殺傷率與對照相比，CART細胞殺傷效果較好，表明Pre-Lenti-EF1-MCS-EGFRvIIICART殺傷功能較好。實施例3：動物實驗1、小鼠品系：為NSG免疫缺陷小鼠品系，免疫系統缺乏T細胞、B細胞和NK細胞功能。2、腫瘤接種：使用外源高表達EGFRvIII的BxPC-1腫瘤細胞系，3×106細胞/100ulPBS皮下注射8隻小鼠，見圖5。3、CART注射：腫瘤細胞接種6天後，其中，4隻小鼠為一組尾靜脈注射Control，另4隻小鼠為一組尾靜脈注射EGFRvIIICART細胞(1×107細胞/200ulPBS)，見圖5。4、每隔2天觀察小鼠，測量體重，直至CART細胞注射22天後，EGFRvIIICART處理的4隻小鼠皮下腫瘤消失。對腫瘤體積變化和體重變化作圖，見圖6、圖7。由圖6可知，CART細胞處理後，每隔2天測量腫瘤體積1次，對照組腫瘤生長至較大體積，而EGFRvIIICART處理組腫瘤生長被抑制。由圖7可知，每隔2天，測量小鼠體重，EGFRvIIICART注入小鼠體內，沒有影響體重。綜上可見，EGFRvIIICART處理可以顯著抑制腫瘤生長。以上所述，僅為本發明較佳的具體實施方式，但本發明的保護範圍並不局限於此，任何熟悉本
技術領域：
的技術人員在本發明揭露的技術範圍內，可輕易想到的變化或替換，都應涵蓋在本發明的保護範圍之內。因此，本發明的保護範圍應以所述權利要求的保護範圍為準。SEQUENCELISTING北京普瑞金科技有限公司；普瑞金（深圳）生物技術有限公司一種全人源化EGFRvIII嵌合抗原受體T細胞及其製備方法20179PatentInversion3.51783DNA合成的ScFV基因1atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccagg60ccggacatccagatgacccagagccctagcagcctgagcgccagcgtgggcgacagagtg120accatcacctgtcgggccagccagggcatcagaaacaacctggcctggtatcagcagaag180cccggcaaggcccccaagagactgatctacgctgccagcaatctgcagagcggcgtgccc240agcagattcaccggaagcggctccggcaccgagttcaccctgatcgtgtccagcctgcag300cccgaggacttcgccacctactactgcctgcagcaccacagctaccctctgaccagcggc360ggaggcaccaaggtggagatcaagcggaccggcagcaccagcggcagcggcaagcctggc420agcggcgagggaagcgaggtccaggtgctggaatctggcggcggactggtgcagcctggc480ggcagcctgagactgagctgtgccgccagcggcttcaccttcagcagctacgccatgtct540tgggtccggcaggctcctggaaagggcctggaatgggtgtccgccatcagcggctctggc600ggctccaccaactacgccgacagcgtgaagggccggttcaccatcagccgggacaacagc660aagaacaccctgtatctgcagatgaacagcctgagagccgaggacaccgccgtgtactac720tgtgccggcagcagcgggtggagcgagtactggggccagggcacactggtcacagtgtct780agc7832939DNA合成的3代CAR基因2ccagcgaagcccaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcg60tcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcac120acgagggggctggacttcgccccacgcaaaattgaagttatgtatcctcctccttaccta180gacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagt240cccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctg300gcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagagg360agcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgc420aagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccaaacggggc480agaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaa540gaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgaga600gtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctat660aacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgg720gaccctgagatggggggaaagccgcagagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaat780gaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgc840cggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacc900tacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa93931722DNAEGFRvIIICAR基因3atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccagg60ccggacatccagatgacccagagccctagcagcctgagcgccagcgtgggcgacagagtg120accatcacctgtcgggccagccagggcatcagaaacaacctggcctggtatcagcagaag180cccggcaaggcccccaagagactgatctacgctgccagcaatctgcagagcggcgtgccc240agcagattcaccggaagcggctccggcaccgagttcaccctgatcgtgtccagcctgcag300cccgaggacttcgccacctactactgcctgcagcaccacagctaccctctgaccagcggc360ggaggcaccaaggtggagatcaagcggaccggcagcaccagcggcagcggcaagcctggc420agcggcgagggaagcgaggtccaggtgctggaatctggcggcggactggtgcagcctggc480ggcagcctgagactgagctgtgccgccagcggcttcaccttcagcagctacgccatgtct540tgggtccggcaggctcctggaaagggcctggaatgggtgtccgccatcagcggctctggc600ggctccaccaactacgccgacagcgtgaagggccggttcaccatcagccgggacaacagc660aagaacaccctgtatctgcagatgaacagcctgagagccgaggacaccgccgtgtactac720tgtgccggcagcagcgggtggagcgagtactggggccagggcacactggtcacagtgtct780agcccagcgaagcccaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatc840gcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtg900cacacgagggggctggacttcgccccacgcaaaattgaagttatgtatcctcctccttac960ctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtcca1020agtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttggtggagtc1080ctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaag1140aggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacc1200cgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccaaacgg1260ggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactact1320caagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactg1380agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctc1440tataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggc1500cgggaccctgagatggggggaaagccgcagagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtac1560aatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgag1620cgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggac1680acctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa1722434DNA人工合成4cggaattcgccaccatggccttaccagtgaccgc34529DNA人工合成5cgggatccttagcgagggggcagggcctg29640DNA人工合成6gtcgtggtgggcttcgctgggctagacactgtgaccagtg40740DNA人工合成7cactggtcacagtgtctagcccagcgaagcccaccacgac40820DNA人工合成8ggagcctacctagactcagc20920DNA人工合成9caaccaggatttatacaagg20當前第1頁1 2 3