乳基料中游離態手性胺基酸的檢測方法
2023-09-09 22:59:20 1
乳基料中游離態手性胺基酸的檢測方法
【專利摘要】本發明公開了乳基料中游離態手性胺基酸的檢測方法。其包括下述步驟：（1）製備待測樣品：將乳基料去除脂肪和蛋白質並提取游離態胺基酸，得到待測樣品；（2）衍生：將標準胺基酸和步驟（1）的待測樣品分別進行衍生，衍生的條件如下：採用N-異丁醯基-L-半胱氨酸與鄰苯二甲醛聯合衍生，內標物為L-高精氨酸；（3）分離檢測：採用高效液相色譜-螢光檢測方法分離檢測胺基酸，將待測樣品的色譜圖與標準胺基酸的色譜圖比較，即可。本發明的檢測方法採用高效液相色譜分離結合柱前手性試劑衍生和螢光檢測法，檢測限大大降低，能提高檢測的解析度和靈敏度，可以對乳基料中胺基酸組分進行手性構型的定性和定量分析。
【專利說明】乳基料中游離態手性胺基酸的檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及食品領域，尤其涉及乳基料中游離態手性胺基酸的檢測方法。
【背景技術】
[0002]近年來，乳製品食品安全事件引起社會廣泛關注，由乳製品質量缺陷引發的食源性疾病明顯增多，使得乳製品的質量安全問題受到廣泛重視。食品科技的發展在豐富人類食品消費的同時，也給乳製品生產帶來了安全問題。為了加強乳製品質量監管，《食品安全法》、《乳品質量安全監督管理條例》，《企業生產乳製品許可條件審查細則(2010版)》、《企業生產嬰幼兒配方奶粉許可條件審查細則(2010版)》等法規相繼出臺，乳製品行業迫切需要更多的整體解決方案以滿足日益增加的檢測需求。眾多的檢測需求以及法規需求，同時也給乳製品分析實驗室帶來了如何細化完善檢測指標、提高檢測準確度靈敏度、提高實驗室效率和降低分析成本的難題。
[0003]由於乳蛋白的胺基酸組成與人體需要頗為接近，因此被譽為「理想蛋白質」。牛乳中不僅蛋白質含量高，而且富含多種生物活性成分以及人體所需的各種胺基酸等。胺基酸是構成蛋白質的基本單位，它參與生物體內的新陳代謝和生理過程。不同的胺基酸比例、排列方式組成不同類別的蛋白質，它們在維持機體組織生長、更新、參與各種化學反應、提供生理活動所需要的熱能等方面發揮著重要作用。游離胺基酸是人體可直接吸收的營養成分，它的含量和成分能夠部分地反映出食品的營養價值。
[0004]組成人體內生命物質的20種基本胺基酸，除甘氨酸外都有兩種互成鏡像的L型和D型結構。動物實驗表明D-胺基酸可能阻斷一些重要生理物質的合成，還能抑制動物的生長，D-胺基酸構成的蛋白質多肽通常不被或緩慢地被肽酶水解；肝、腎中的D-胺基酸氧化酶能使D-胺基酸脫氨轉化從而消除其毒性。研究表明人體內的D-胺基酸多與老齡化組織如白內障晶體渾濁、早老痴呆患者腦白質和灰質、某些腎臟疾病有關。人體內D-胺基酸的來源一方面是體內胃腸道細菌本身含有以及L-胺基酸消旋化形成，另一方面是通過攝取體外的藥物、食物帶入。而目前已知可能含有D-胺基酸的食物包括海帶、一些昆蟲、海洋動物、蘋果和梨等天然食物，以及生物處理的乳製品、飲料、調味品、醃製品、加工腸、醬菜等加工食品。目前，食品中的手性胺基酸的分析研究還很少，更不屬於食品安全的常規檢測項目。由此，D-胺基酸對食品的安全性有待深入研究，食物中胺基酸水平以及D-胺基酸水平的監測將可能成為食品營養學及食品安全領域的一個重要方面。
[0005]牛乳中含有少量的D-胺基酸是正常現象，如部分種類的D-胺基酸含量較高可能與細菌引起的乳房炎有一定關係，並且在一定時間範圍內，D-胺基酸含量會隨著牛乳存儲期的延長而增加。因此，D-胺基酸含量可能可以作為乳製品細菌汙染程度或貨架期的一個指標。此外據報導健康牛初乳中D-胺基酸的含量較高，大約可達健康牛非初乳的5倍。
[0006]針對胺基酸檢測，現有的胺基酸測定方法，多數使用茚三酮染色或衍生，採用分光光度計或胺基酸分析儀進行胺基酸的分析，也有部分採用高效液相色譜儀，但也需要使用特殊的離子交換色譜柱。現行國家標準GB/T5009.124-2003《食品中胺基酸的測定》和GB/T18246-2000《飼料中胺基酸的測定》均採用全自動胺基酸分析儀；IS013903:2005 (E)《動物飼料-胺基酸含量的測定》使用胺基酸分析儀或高效液相色譜儀測定動物飼料中的17種胺基酸(不包括色氨酸);AOAC官方方法994.12《飼料中胺基酸的測定-過甲酸氧化與焦亞硫酸鈉-酸水解法》適用於用胺基酸分析儀測定16種胺基酸(包括蛋氨酸和胱氨酸,不包括酪氨酸和色氨酸)。以上標準方法均不涉及胺基酸手性異構體的測定。
[0007]胺基酸對映體的分離分析常用的有化學拆分法、膜拆分法、酶拆分法、萃取拆分法、誘導結晶法、毛細管電泳拆分法、色譜拆分法等。化學拆分法是把外消旋體與拆分劑作用生成兩種非對映異構體鹽，然後利用兩種鹽的溶解度差異來進行分離；膜拆分法主要依賴於胺基酸對映體與溶液中的金屬陽離子及載有手性選擇子的固定相形成三元配合物的穩定性差異，通常L型胺基酸形成的配合物比D型的穩定，待拆分的胺基酸外消旋體選擇性吸附在手性滲透膜上，然後被吸附的胺基酸脫附，並通過濃度差驅動擴散至溶液中；酶拆分法是利用酶的高度立體專一性，在一定條件下只能催化外消旋體中的一個異構體反應生成非對映體從而實現對映異構體的分離；萃取拆分法利用溶質在兩種互不相溶的溶劑相中溶解度的差異提取拆分；誘導結晶法利用胺基酸的某一旋光異構體在一定溫度時較外消旋體溶解度小，易析出的性質，在外消旋體溶液中加入某種旋光異構體作為晶種，誘使與晶種相同的異構體優先析出，藉此達到分離目的；毛細管電泳拆分法是利用各種不同帶電性質和荷電量的分子在毛細管柱中電泳流和電滲流兩種作用下遷移速度不同而實現分離的；色譜拆分法可以利用手性固定相色譜柱拆分、也可以利用流動相中添加了手性添加劑的非手性固定相色譜柱拆分、還可以利用手性試劑與被拆分物進行衍生化反應生成非對應異構體而實現分離。
[0008]這些方法各有優缺點:化學拆分法機制工藝最成熟，多用於工業上批量生產，但拆分產率和產品旋光純度不高；膜拆分法能耗低、易於連續操作，但局限於膜的穩定性和使用壽命；酶拆分法高度立體專一，拆分產率高，產品光學純度較高，反應條件溫和，對環境友好，但酶製劑品種有限、保存條件苛刻、價格昂貴，而且這種方法以及基於這種方法的生物傳感器法通常只能測得單一種類胺基酸的對映體含量或多種D-胺基酸的總量；萃取拆分法提取與分離效率高、分離效果好、需要設備簡單，但局限於新型提取拆分劑的開發和選擇；誘導結晶法設備簡單，但操作繁瑣，且只能應用於少部分能生成外消旋聚集體的分子；毛細管電泳拆分法解析度高，但與前幾種方法類似的，一次只能同時拆分一種或少數幾種胺基酸；色譜拆分法方法多，適應胺基酸種類更廣，能實現多種胺基酸的同時分離和分析，但手性色譜柱價格昂貴，因此該法主要集中在於手性試劑和分離條件的選擇和開發。
[0009]採用高效液相色譜儀檢測胺基酸時，由於大多數胺基酸無紫外吸收和螢光發射特徵，為提高分析檢測的靈敏度和分離選擇特性，通常將胺基酸進行柱前或柱後衍生。與胺基酸分析儀相比，柱前衍生具有快速靈敏、不需專用儀器等優點，通常採用鄰苯二甲醛(0PA)、異硫氰酸苯酯(PITC)，氯甲酸-9-芴甲酯(FM0C-C1)、丹醯氯(dansyl-Cl)，2，4-二硝基氟苯(DNFB)，6-氨基喹啉-N-羥基琥珀醯亞胺基氨基甲酸酯(AQC)等，由於OPA衍生步驟簡單，反應速度快，剩餘試劑不產生幹擾，衍生物可用多種檢測器檢測，應用較為廣泛。柱後衍生應用最廣泛的是茚三酮，上述衍生試劑各有優劣。此外，採用高效液相色譜-蒸發光散射(HPLC-ELSD)檢測法可不經過衍生對胺基酸和碳水化合物等物質進行測定，檢測的範圍寬，使用較為方便。但該檢測器對樣品前處理要求比較嚴格，適用於成分比較單一或比較乾淨的樣品的檢測，成分複雜的樣品則會對結果造成較大的幹擾；在洗脫液霧化過程中需消耗大量的氮氣，增加了測定成本；不能使用鹽溶液作為流動相，會對檢測造成幹擾。
[0010]現有技術中，一般採用茚三酮柱後衍生法的胺基酸自動分析儀不能拆分手性異構體。對游離胺基酸的分析要準確定性和定量，一般要求兩兩分離度不低於1.0，最好大於
1.2，平均分離度一般大於1.5。對於某些種類的胺基酸，有些儀器的平均分離度較高的可以達到大於3.3。而一般的胺基酸自動分析儀最低檢測限在2-8pmol (即使相對較靈敏的天門冬氨酸，也在3pmol左右，信噪比S/N=2或3)。
【發明內容】
[0011]本發明所要解決的技術問題在於為了克服現有的胺基酸測定方法存在成本高、普適性差、難於拆分胺基酸手性異構體以及基於高效液相色譜儀的胺基酸測定方法難以滿足快速準確地對多種基本胺基酸及其手性異構體進行同時的定性和定量分析的缺陷，提供一種乳基料中游離態手性胺基酸的檢測方法。
[0012]本發明採用IBLC (N-異丁醯基-L-半胱氨酸)作為手性試劑與OPA聯合衍生，通過對生成的非對映立體異構體進行檢測來間接檢測手性胺基酸，既能實現胺基酸的手性拆分，又能提高檢測的解析度和靈敏度(本發明可以同時實現35種胺基酸的兩兩分離，兩兩分離度均在1.2或以上，平均分離度達3.7，表明解析度較高；各種胺基酸的最低檢測限為0.05pmol (S/N=3)，表明靈敏度較高)，而且這兩種試劑也能很容易的從試劑公司購得標準品。本發明的檢測方法集中對乳基料中的絕大部分基本胺基酸進行一次性、同時的系統分析，包括手性分析。此前的研究方法多集中在單個或少數幾種胺基酸的手性分析和含量測定，對基本胺基酸的系統的一次性分析也多是利用胺基酸自動分析儀進行，這種方法不能得到手性構型的分析結果，另外方法的檢測限也有所局限(現有技術中的檢測限一般為2-8pmol)。本方法採用高效液相色譜分離結合柱前衍生和螢光檢測法，檢測限大大降低，最低檢測限可達0.05pmol (即5X 10_14mol，信噪比S/N=3)，可以對乳基料中胺基酸組分進行手性構型的定性和定量分析。
[0013]本發明是通過以下技術方案解決上述技術問題的:
[0014]本發明提供了一種乳基料中游離態手性胺基酸的檢測方法，其包括下述步驟:
[0015](I)製備待測樣品:將乳基料去除脂肪和蛋白質並提取游離態胺基酸，得到待測樣品;
[0016](2)衍生:將標準胺基酸和步驟(I)的待測樣品分別進行衍生，衍生的條件如下:採用N-異丁醯基-L-半胱氨酸與鄰苯二甲醛聯合衍生，內標物為L-高精氨酸；
[0017](3)分離檢測:採用高效液相色譜-螢光檢測方法分離檢測胺基酸，將待測樣品的色譜圖與標準胺基酸的色譜圖比較，即可；
[0018]其中，高效液相色譜的條件如下:流動相A為pH值為5.90?6.10、鈉離子濃度為20?25mmol/L的乙酸-乙酸鈉緩衝液，流動相B為甲醇與乙腈的體積比為12:1的混合溶劑，以流動相A與流動相B按照下述體積比進行梯度洗脫:0min: (95?100)%A+(0?5)%B — 15min: (84 ?88)%A+(12 ?16)%B — (45 ?55)min: (75 ?78)%A+(22 ?25) %B — 90min: (30 ?46)%A+(54 ?70) %B — 95min: (30 ?46)%A+(54 ?70) %B ;流速為
0.6 ?lmL/min。[0019]本發明中，所述的乳基料一般是指本領域常用的生鮮乳、乳粉、復原乳或僅經過乳酸菌發酵的將用於進一步加工的發酵乳等。
[0020]其中，所述的將乳基料去除脂肪和蛋白質並提取游離態胺基酸可按本領域常規方法進行，較佳地通過下述步驟進行:將乳基料離心，撇去上層脂肪後，與0.lmol/L鹽酸按照lg: (0.5?2)mL的比例混合均勻後再加入三氯乙酸使三氯乙酸終濃度為3?10%，靜置使蛋白質完全沉澱，離心後取上清液，用孔徑為0.22 濾膜過濾得到的濾液即為待測樣品，更佳地通過下述步驟進行:將乳基料於4°C條件下以5000 X g離心30min，撇去上層脂肪後，與0.lmol/L鹽酸按照lg:1mL的比例混合均勻後，再加入三氯乙酸使三氯乙酸終濃度為5%，振蕩使充分混勻後於4°C靜置4?24h使蛋白質完全沉澱(更佳的靜置時間為12h)，再於4°C條件下以(9000?20000) Xg離心10?30min後取上清液(更佳地為15000Xg離心20min)，用孔徑為0.22 U m濾膜過濾得到的濾液即為待測樣品。待測樣品於-85?_18°C保存(更佳地為不高於_80°C保存)；所述的終濃度是指質量百分比濃度。
[0021]本發明中，步驟(2)中，將標準胺基酸進行衍生較佳地通過下述步驟進行:用孔徑為0.22 ii m濾膜過濾如下試劑:硼酸-硼酸鈉緩衝溶液、含200?300mmol/L N-異丁醯基-L-半胱氨酸的硼酸-硼酸鈉緩衝溶液、含150-200mmol/L鄰苯二甲醛的硼酸-硼酸鈉緩衝溶液、含0.3?0.5mmol/L內標物L-高精氨酸的0.lmol/L HCl溶液以及含有標準胺基酸的0.lmol/L HCl溶液，然後按照體積比13:1:1:1:8混合，振蕩混勻，避光條件下靜置發生衍生反應；所述的硼酸-硼酸鈉緩衝溶液的濃度為0.01?0.5mol/L，pH值為10.0?10.8。步驟(2)中，將標準胺基酸進行衍生更佳地通過下述步驟進行:用孔徑為0.22 pm濾膜過濾如下試劑:硼酸-硼酸鈉緩衝溶液、含260mmol/LN-異丁醯基-L-半胱氨酸的硼酸-硼酸鈉緩衝溶液、含170mmol/L鄰苯二甲醛的硼酸-硼酸鈉緩衝溶液、含0.4mmol/L內標物L-高精氨酸的0.lmol/L HCl溶液以及含有標準胺基酸的0.lmol/L HCl溶液，然後按照體積比13:1:1:1:8混合，振蕩混勻，避光條件下靜置發生衍生反應；所述的硼酸-硼酸鈉緩衝溶液的濃度為0.01?0.5mol/L, pH值為10.0?10.8。
[0022]本發明中，步驟(2)中，將步驟(I)的待測樣品進行衍生較佳地通過下述步驟進行:按照上述標準胺基酸衍生的方法，將所述的含有標準胺基酸的0.lmol/L HCl溶液替換為含有待測樣品的0.lmol/L HCl溶液，即可。
[0023]上述步驟(2)中，所述的硼酸-硼酸鈉緩衝溶液的濃度較佳地為0.05mol/L，pH值較佳地為10.4 ;所述的振蕩較佳地採用旋渦振蕩器進行振蕩，振蕩的時間較佳地為10?60s，更佳地為30s ;所述的衍生反應的時間較佳地為1.5?18min，更佳地為5min ;所述的衍生反應的溫度較佳地為16-30°C，更佳為21?25°C。
[0024]本發明中，硼酸-硼酸鈉緩衝溶液的濃度是指共軛酸鹼的總濃度。
[0025]發明人經過大量研究發現，N-異丁醯基-L-半胱氨酸(S卩IBLC,N-1sobutyryl-L-cysteine,又稱N-異丁醯基_L_巰基丙氨酸)能與一級胺基酸再加上鄰苯二甲醛反應生成具有螢光吸收的穩定產物。上述衍生反應條件溫和，與胺基酸反應生成穩定的異吲哚類衍生物，衍生產物在室溫下1.5-18min內穩定存在，有利於進行準確有效的檢測。過量的IBLC不幹擾測定。該衍生劑的特點和優勢有利於準確有效的胺基酸測定，其作為一種精細化工原料，價格便宜，容易購得，有利於方法的推廣應用。
[0026]其中，在所述的聯合衍生中，應保證N-異丁醯基-L-半胱氨酸的終濃度使溶液中的胺基酸完全衍生，一般常規乳基料中總的游離態胺基酸含量為500~3000 u mol/L (其中對乳粉而言，此含量為復原為液態乳後的含量)，根據乳牛品種、產乳期是否初乳、產乳季節、飼餵飼料、乳中微生物數量以及加工方式不同，該含量有所差異，但據大量文獻報導和本發明人研究發現，該含量範圍主要集中在800~2000 y mol/L，本發明中所述的N-異丁醯基-L-半胱氨酸的最終加入量較佳地不低於總胺基酸最終加入量的2倍，所述的最終加入量為物質的量(摩爾數)。
[0027]其中，所述的高效液相色譜的色譜柱可採用本領域常規使用的各種色譜柱並配以保護柱，較佳地為十八烷基矽烷鍵合矽膠色譜柱和保護柱，所述的十八烷基矽烷鍵合矽膠色譜柱較佳地為規格5 u m、150 X 4.6mm的十八烷基矽烷鍵合矽膠色譜柱，所述的保護柱較佳地為規格5 u m、12.5X4.6mm的十八烷基矽烷鍵合矽膠色譜柱。色譜柱的柱溫較佳地為16~35°C，更佳地為25°C。進樣量較佳地為6~50 μ L，更佳地為15 u L。
[0028]其中，所述的流動相A較佳地為pH值為5.98~6.02、鈉離子濃度為23mmol/L的乙酸-乙酸鈉緩衝液。
[0029]其中，所述的流動相A與流動相B較佳地按照下述體積比進行梯度洗脫:0min:97%A+3%B — 15min: 85%A+15%B — 50min: 77%A+23%B — 90min: 40%A+60%B — 95min: 40%A+60%B。
[0030]其中，所述的流速較佳地為lmL/min。
[0031]其中，在所述的螢光檢測方法中，螢光檢測器的激發波長較佳地為220~250nm，更佳地為230nm ;所述的突光檢測器的發射波長較佳地為415~485nm,更佳地為445nm。
[0032]步驟(3)中，得 到標準胺基酸的色譜圖和待測樣品的色譜圖後，還可以進一步通過繪製標準曲線來計算乳基料中各胺基酸的含量:通過標準胺基酸的色譜圖，以某種標準胺基酸(sAAx)與內標物L-高精氨酸的色譜峰面積之比值(AsAAx/\_h_)對反應體系中該標準胺基酸與內標物L-高精氨酸的最終加入量之比值(NsMx/\_h_)作圖擬合作標準曲線，並通過待測樣品的色譜圖計算待測樣品的該胺基酸(AAx)與內標物L-高精氨酸的色譜峰面積之比值(AAAx/\_H_)，通過標準曲線得出待測樣品中對應的該胺基酸的最終加入量和內標物最終加入量的比值(NAAx/\_H_)，從而得到待測樣品中該胺基酸的含量。
[0033]本發明中，L-Homo(L-homoarginine)即是指內標物L-高精氨酸，0PA(o_phthalicaldehyde)即是指鄰苯二甲醒。
[0034]本發明中，所述的胺基酸較佳地包括L-天門冬氨酸、D-天門冬氨酸、L-穀氨酸、L-天冬醯胺、D-穀氨酸、L-絲氨酸、D-天冬醯胺、D-絲氨酸、L-穀氨醯胺、D-穀氨醯胺、L-蘇氨酸、L-組氨酸、甘氨酸、D-蘇氨酸、D-組氨酸、L-精氨酸、L-丙氨酸、D-精氨酸、D-丙氨酸、L-酪氨酸、D-酪氨酸、L-纈氨酸、L-甲硫氨酸、L-色氨酸、D-甲硫氨酸、D-纈氨酸、L-苯丙氨酸、L-異亮氨酸、D-色氨酸、D-苯丙氨酸、L-亮氨酸、D-異亮氨酸、D-亮氨酸、L-賴氨酸和D-賴氨酸中的一種或多種。
[0035]本發明中所述的IBLC、OPA和胺基酸標準品(17種構成蛋白質的基本胺基酸及其手性異構體、甘氨酸以及作為內標物的L-高精氨酸)均為純度> 97%的標準試劑(更佳地為> 99%、手性化合物的光學純度> 99.5%);鹽酸、乙酸、乙酸鈉和三氯乙酸等的純度可採用本領域常規使用的純度，較佳地為分析純；甲醇和乙腈的純度為本領域常規使用純度，較佳地為色譜純；除特殊說明外所有配製溶液的水按本領域常規均為超純水(電阻率達
18.2MQ ? cm)。[0036]在符合本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本發明各較佳實例。
[0037]本發明所用試劑和原料均市售可得。
[0038]本發明的積極進步效果在於:
[0039](I)本發明可集中對乳基料中的絕大部分基本胺基酸進行一次性、同時的系統分析，包括手性分析。通過採用IBLC (N-異丁醯基-L-半胱氨酸)作為手性試劑與OPA聯合衍生，結合HPLC和通用的C18液相色譜柱，能夠對乳基料中除脯氨酸和半胱氨酸以外的18種生物體構成蛋白質的基本胺基酸進行一次性手性分離，再通過對生成的非對映立體異構體進行螢光檢測來實現對分離得到的35種胺基酸的同時測定(其中甘氨酸不存在手性異構體)，該方法有助於對乳製品營養和質量指標的細化及其相關檢測方法的建立。
[0040](2)本發明的檢測方法採用高效液相色譜分離結合柱前手性試劑衍生和螢光檢測法，檢測限大大降低，最低檢測限可達0.05pmol (即5X10_14mol，信噪比S/N=3)，能提高檢測的解析度和靈敏度，可以對乳基料中胺基酸組分進行手性構型的定性和定量分析。而此前的研究方法多集中在單個或少數幾種胺基酸的手性分析和含量測定，對基本胺基酸的系統的一次性分析也多是利用胺基酸自動分析儀進行，這種方法不能得到手性構型的分析結果，另外方法的檢測限也有所局限。
[0041](3)本發明的檢測方法普適性更強，而且不需要昂貴的胺基酸分析儀和/或昂貴的胺基酸測定試劑包，適用於更多的常規實驗室。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0042]圖1為36種標準胺基酸衍生物色譜圖(其中加入的L-胺基酸的濃度為8 U mol/L,L-高精胺酸為0.4mmol/L, D-胺基酸和甘氨酸均為4 y mol/L，最終進樣量分別為40，250，20 和 20pmol)。
[0043]圖2為實施例2生乳樣品中的17種胺基酸及其手性異構體和甘氨酸的HPLC測定曲線圖譜(其中加入的內標物L-高精氨酸的濃度為0.4mmol/L，最終進樣量為250pmol)。
【具體實施方式】
[0044]下面通過實施例的方式進一步說明本發明，但並不因此將本發明限制在所述的實施例範圍之中。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，按照常規方法和條件，或按照商品說明書選擇。
[0045]本發明的實施例採用的試驗條件如下:
[0046]檢測儀器:Agilentl260高效液相色譜系統，G1329B100孔自動進樣裝置，AgilentG1321B螢光檢測器；
[0047]色譜柱:美國安捷倫公司的XDB C18 (150X4.6_，5 y m)液相色譜柱，保護柱為美國安捷倫公司的XDB C18 (12.5X4.6mm, 5 u m)分析保護柱；
[0048]柱溫:25°C；
[0049]流動相:流動相A為鈉濃度23mmol/L的乙酸/乙酸鈉緩衝液(pH值為
6.00±0.02)，流動相B為甲醇/乙腈混合溶劑(v:v=12:1)，流速為lmL/min ；
[0050]檢測波長:設定激發波長為230nm,發射波長445nm ；[0051]進樣量:15iiL。
[0052]洗脫程序:
[0053]
【權利要求】
1.一種乳基料中游離態手性胺基酸的檢測方法，其包括下述步驟:(I)製備待測樣品:將乳基料去除脂肪和蛋白質並提取游離態胺基酸，得到待測樣品； (2)衍生:將標準胺基酸和步驟(1)的待測樣品分別進行衍生，衍生的條件如下:採用N-異丁醯基-L-半胱氨酸與鄰苯二甲醛聯合衍生，內標物為L-高精氨酸； (3)分離檢測:採用高效液相色譜-螢光檢測方法分離檢測胺基酸，將待測樣品的色譜圖與標準胺基酸的色譜圖比較，即可； 其中，高效液相色譜的條件如下:流動相A為pH值為5.90~6.10、鈉離子濃度為20~25mmol/L的乙酸-乙酸鈉緩衝液，流動相B為甲醇與乙腈的體積比為12:1的混合溶劑，以流動相A與流動相B按照下述體積比進行梯度洗脫:0min: (95~100)%A+(0~5)%B — 15min: (84 ~88)%A+(12 ~16)%B — (45 ~55)min: (75 ~78)%A+(22 ~25) %B — 90min: (30 ~46)%A+(54 ~70) %B — 95min: (30 ~46)%A+(54 ~70) %B ;流速為0.6 ~lmL/min。
2.如權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於，所述的將乳基料去除脂肪和蛋白質並提取游離態胺基酸通過下述步驟進行:將乳基料離心，撇去上層脂肪後，與0.lmol/L鹽酸按照Ig: (0.5~2)mL的比例混合均勻後再加入三氯乙酸使三氯乙酸終濃度為3~10%，靜置使蛋白質完全沉澱，離心後取上清液，用孔徑為0.22 濾膜過濾得到的濾液即為待測樣品；所述的終濃度是指質量百分比濃度；較佳地通過下述步驟進行:將乳基料於4°C條件下以5000 Xg離心30min,撇去上層脂肪後，與0.lmol/L鹽酸按照lg:1mL的比例混合均勻後，再加入三氯乙酸使三氯乙酸終濃度為5%，振蕩使充分混勻後於4°C靜置4~24h使蛋白質完全沉澱，再於4°C條件下以(9000~20000) Xg離心10~30min後取上清液，用孔徑為0.22 濾膜過濾得到的濾液即為待測樣品；所述的靜置的時間較佳地為12h，所述的離心的條件較佳地為15000Xg離心20min。
3.如權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於，步驟(2)中，將標準胺基酸進行衍生通過下述步驟進行:用孔徑為0.22 y m濾膜過濾如下試劑:硼酸-硼酸鈉緩衝溶液、含200~300mmol/L N-異丁醯基-L-半胱氨酸的硼酸-硼酸鈉緩衝溶液、含150-200mmol/L鄰苯二甲醛的硼酸-硼酸鈉緩衝溶液、含0.3~0.5mmol/L內標物L-高精氨酸的0.lmol/LHCl溶液以及含有標準胺基酸的0.lmol/L HCl溶液，然後按照體積比13:1:1:1:8混合，振蕩混勻，避光條件下靜置發生衍生反應；所述的硼酸-硼酸鈉緩衝溶液的濃度為0.01~0.5mol/L, pH值為10.0~10.8 ;步驟(2)中，將標準胺基酸進行衍生較佳地通過下述步驟進行:用孔徑為0.22 y m濾膜過濾如下試劑:硼酸-硼酸鈉緩衝溶液、含260mmol/L N-異丁醯基-L-半胱氨酸的硼酸-硼酸鈉緩衝溶液、含170mmol/L鄰苯二甲醛的硼酸-硼酸鈉緩衝溶液、含0.4mmol/L內標物L-高精氨酸的0.lmol/L HCl溶液以及含有標準胺基酸的0.lmol/L HCl溶液，然後按照體積比13:1:1:1:8混合，振蕩混勻，避光條件下靜置發生衍生反應；所述的硼酸-硼酸鈉緩衝溶液的濃度為0.01~0.5mol/L, pH值為10.0~10.8 ; 和/或，步驟(2)中，將步驟(1)的待測樣品進行衍生通過下述步驟進行:按照所述的標準胺基酸進行衍生的方法，其中，將所述的含有標準胺基酸的0.lmol/L HCl溶液替換為含有待測樣品的0.lmol/L HCl溶液，即可。
4.如權利要求3所述的檢測方法，其特徵在於，步驟(2)中，所述的硼酸-硼酸鈉緩衝溶液的濃度為0.05mol/L，pH值為10.4 ;所述的振蕩採用旋渦振蕩器進行振蕩，振蕩的時間為10~60s，較佳地為30s ;所述的衍生反應的時間為1.5~18min，較佳地為5min ;所述的衍生反應的溫度為16-30°C，較佳為21~25°C。
5. 如權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於，所述的高效液相色譜的色譜柱為十八烷基矽烷鍵合矽膠色譜柱和保護柱，所述的十八烷基矽烷鍵合矽膠色譜柱較佳地為規格5umU50X4.6mm的十八烷基矽烷鍵合矽膠色譜柱，所述的保護柱較佳地為規格5 y m、12.5X4.6mm的十八烷基矽烷鍵合矽膠色譜柱；色譜柱的柱溫較佳地為16~35°C，更佳地為25°C ;進樣量較佳地為6~50 ii L，更佳地為15 u L。
6.如權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於，所述的流動相A為pH值為5.98~6.02、鈉離子濃度為23mmol/L的乙酸-乙酸鈉緩衝液； 和/或，所述的乳基料為生鮮乳、乳粉、復原乳或僅經過乳酸菌發酵的將用於進一步加工的發酵乳。
7.如權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於，所述的流動相A與流動相B按照下述體積比進行梯度洗脫:0min:97%A+3%B — 15min:85%A+15%B — 50min: 77%A+23%B — 90min:40%A+60%B — 95min:40%A+60%B ； 和/或，所述的流速為lmL/min。
8.如權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於，在所述的螢光檢測方法中，螢光檢測器的激發波長為220~250nm，較佳地為230nm ;螢光檢測器的發射波長為415~485nm，較佳地為445nm。
9.如權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於，步驟(3)中，得到標準胺基酸的色譜圖和待測樣品的色譜圖後，還進一步通過繪製標準曲線來計算乳基料中各胺基酸的含量:通過標準胺基酸的色譜圖，以某種標準胺基酸與內標物L-高精氨酸的色譜峰面積之比值對反應體系中該標準胺基酸與內標物L-高精氨酸的最終加入量之比值作圖擬合作標準曲線，並通過待測樣品的色譜圖計算待測樣品的該胺基酸與內標物L-高精氨酸的色譜峰面積之比值，通過標準曲線得出待測樣品中對應的該胺基酸的最終加入量和內標物最終加入量的比值，從而得到待測樣品中該胺基酸的含量。
10.如權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於，所述的胺基酸包括L-天門冬氨酸、D-天門冬氨酸、L-穀氨酸、L-天冬醯胺、D-穀氨酸、L-絲氨酸、D-天冬醯胺、D-絲氨酸、L-穀氨醯胺、D-穀氨醯胺、L-蘇氨酸、L-組氨酸、甘氨酸、D-蘇氨酸、D-組氨酸、L-精氨酸、L-丙氨酸、D-精氨酸、D-丙氨酸、L-酪氨酸、D-酪氨酸、L-糹顏氨酸、L-甲硫氨酸、L-色氨酸、D-甲硫氨酸、D-纈氨酸、L-苯丙氨酸、L-異亮氨酸、D-色氨酸、D-苯丙氨酸、L-亮氨酸、D-異亮氨酸、D-亮氨酸、L-賴氨酸和D-賴氨酸中的一種或多種。
【文檔編號】G01N30/06GK103645266SQ201310743057
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月27日 優先權日:2013年12月27日
【發明者】遊春蘋, 郭本恆, 劉振民, 吳正鈞, 任婧, 杭鋒 申請人:光明乳業股份有限公司