一種精準化小鼠脊髓夾傷夾子和夾傷力度調整方法

2023-09-10 03:22:25 1

一種精準化小鼠脊髓夾傷夾子和夾傷力度調整方法
【專利摘要】本發明涉及發明領域，尤其涉及一種精準化小鼠脊髓夾傷夾子和夾傷力度調整方法。通過旋進或者或者旋出頂緊螺釘，調整夾子被頂緊側和夾子夾持穿透側之間的距離而調整夾持力度。包含如下步驟：選取18-21g雌性小鼠，精確定位小鼠胸11椎體，行該椎體背部椎板骨切除術，以專門改良血管夾將該節段脊髓以左右方向夾傷，即為造模成功，本方法所建立的脊髓損傷模型較之前的方法具有簡單易行、精確易重複、成功率高等特點。損傷後觀察行為學指標，脊髓損傷病理學指標，以及膠質瘢痕指標，發現本方法很好地模擬了人類脊髓損傷後的實際過程，仿真度極高，實現高度重現，有之前的方法無法比擬的優勢。
【專利說明】一種精準化小鼠脊髓夾傷夾子和夾傷力度調整方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及機械領域，尤其涉一種精準化小鼠脊髓夾傷夾子和夾傷力度調整方法。
【背景技術】
[0002]脊髓損傷(Spinal cord injury, SCI)將給患者帶來不可逆性神經功能損害。隨著現代交通和建築業的發展，因SCI造成的截癱患者不斷增加。隨著醫療手段的進步使得SCI患者死亡率下降的同時，帶來的卻是更多生活質量嚴重受損的截癱患者。同時，患者和社會還需要為SCI後的生活護理和功能康復支付巨額的醫療費用。因此，闡明SCI的機理並尋找逆轉的途徑是當前神經科學研究領域的熱點。目前，對SCI的治療效果仍不佳，原因是SCI後的病理生理機制非常複雜，人們對此認識還很不全面、深入。而可靠的SCI動物模型對於闡明其病理生理機制和評價損傷後幹預手段的效果非常關鍵。
[0003]目前存在的脊髓損傷動物模型的製作方法主要包括:①壓迫和挫傷，②全/半橫斷傷，③缺血和化學損傷。而其中以壓迫和挫傷模型與人類SCI在機理及形態上相關性較好。但是以下因素制約了以Alien建立垂直打擊致傷模型為代表的挫傷模型的廣泛應用:
①需要製作複雜的打擊裝置以確保損傷的一致性和模型的穩定性，②適於在大鼠等體型較大的動物上操作，而對於體型微小的小鼠難以應用，③垂直打擊模型僅僅模擬了從背部單一方向打擊造成的組 織移位挫傷，而無法模擬臨床上SCI後脊髓受到多方向的持續壓迫損傷和缺血。
[0004]由於大鼠價格低廉、體型適宜，且與人類SCI損傷相似性較好，大部分SCI實驗研究都以大鼠為對象構建SCI動物模型。而隨著大量轉基因小鼠的研製成功，在體特異性基因修飾對SCI後損傷修復的影響為SCI研究帶來了更多契機。然而小鼠過小的體型增加了SCI建模的難度，這在一定程度上制約了小鼠SCI模型的廣泛應用。儘管如此，仍有許多小鼠模型被應用於SCI研究中，其中包括橫斷、打擊、缺血模型等。由於橫斷損傷的臨床相似度較差，打擊損傷的重複性不好且需要複雜的設備，Joshi M(參見文獻Joshi M，FehlingsMG.Development and characterization of a novel, graded model of clip compressivespinal cord injury in the mouse:Part1.Cl ip design，behavioral outcomes，andhistopathology.J Neurotrauma, 2002,19:175-190.)和 Plemel JR(參見文獻 Plemel JR,Duncan G，Chen KW, et al.A graded forceps crush spinal cord injury model in mice.JNeurotrauma, 2008, 25:350-370.)相繼提出了重複性好，易於操作，且臨床相似度較高的小鼠脊髓夾傷模型。其優點在於:①製作模型所需裝置簡單易得，②彌補了打擊傷模型的不足，更全面的模擬了臨床SCI的損傷特點，③適用於體形較小的小鼠，因而更加便於將基因技術應用與SCI的研究中。
[0005]但是，我們在實際操作過程中發現，Joshi M提出的腹背夾傷模型手術過程中破壞較大，出血較多易致小鼠死亡，大量椎骨的咬除易引起恢復過程中脊柱畸形和周圍肌肉壓迫；而Plemel JR提出的左右夾傷模型雖克服了上述缺點，但是其夾傷部位選擇在脊柱胸5-6節段，該處位於背側斜方肌內大血管下，術中極易引起該血管損傷後大出血致死，且胸5-6位於脊髓生理彎曲凸向腹側處,手術操作難度大；Herrmann JE將左右夾傷的脊髓節段選擇在腰1-2，而此處脊髓已接近馬尾，發出大量神經纖維，不易於術後標本取材及後續操作。
[0006]總結經驗，我們認為由於小鼠體型較小，手術操作難度較大，為了確保模型建立的穩定性和重複性，建模過程中應特別注意以下關鍵要素:①小鼠性別:在實驗設計允許的情況下，應儘量選擇雌性小鼠，因雌性小鼠尿路相對於雄性小鼠更短，更易術後護理排尿。
②小鼠年齡和體重:由於本模型是以壓迫脊髓至一定厚度造成損傷，為確保模型的一致性，應儘量保證小鼠體重、體型的接近，且8w以上體重大於18g的成年小鼠(雌性小鼠成年在18-22g)體型大小比較適宜夾傷操作。體型過小，脊柱和脊髓過細則模型難以構建或操作所致誤差易增大。③夾傷節段的選擇:由於斜方肌下血管容易大出血，造成小鼠失血死亡，且腰椎以上部位椎體較細，並向腹側屈曲，操作難度較大，易增加操作所致誤差；而夾傷位置過低，則因發出神經纖維過多不易取材。故體積較大，凸向背側的腰椎胸11節段椎體，更適於夾傷操作，亦便於術後取材。④節段的定位:因小鼠脊髓從頭側至尾側每一節段粗細不一，故同樣的夾傷厚度在不同的節段造成的損傷程度不同，為確保模型的穩定性，各組小鼠的夾傷節段應儘可能保持一致，而傳統的通過觀察脊柱形狀判斷節段的方法有失準確。本發明首次提出了通過探查肋骨而判斷脊柱節段的方法能夠準確無誤的判定所需夾傷的脊柱節段，具有良好的可靠性。
[0007]而且，通用的夾傷力度不可調整，因此造成標準不統一，評價混亂。
[0008]由於既往報導的小鼠脊髓損傷模型存在上述不足之處，為了更好地研究脊髓損傷的病理生理機制，並準確判斷幹預手段對脊髓損傷後功能結局的影響，我們需要穩定、重複性好、易操作的動物模型作為研究平臺。

【發明內容】

[0009]發明的目的:為了提供為了提供更為穩定、易行的夾傷夾子和夾傷調控方法，具體目的見具體實施部分的多個實質技術效果。
[0010]為了達到如上目的，本發明採取如下技術方案:
[0011]一種精準化小鼠脊髓夾傷夾子，包含夾子頂端和其伸出的兩個側壁，兩個側壁之間形成夾持空間，其特徵在於，所述兩個側壁分別為夾子被頂緊側(4)和夾子夾持穿透側
(5)，其中夾子被頂緊側(4)包含一個頂住孔(3)，頂住孔(3)為槽狀，還包含穿過夾子夾持穿透側(5)的穿透孔的頂緊螺釘(I)，所述穿透孔內壁上包含螺紋，所述頂緊螺釘(I)能夠在穿透孔中旋進或者或者旋出而調整夾子被頂緊側(4)和夾子夾持穿透側(5)之間的距離。
[0012]本發明的進一步技術方案在於，所述頂緊螺釘(I)端部包含手持部分(2)，所述手持部分(2)為圓形。
[0013]本發明的進一步技術方案在於，所述頂緊螺釘(I)上包含刻度。
[0014] 一種精準化小鼠脊髓夾傷夾傷力度調整方法，利用如權利要求1所述的夾子，通過旋進或者或者旋出頂緊螺釘(I)，調整夾子被頂緊側(4)和夾子夾持穿透側(5)之間的距離而調整夾持力度。[0015]採用如上技術方案的本發明，相對於現有技術有如下有益效果:調整方便，力度調整靈活便捷，提供了一種標準的夾傷方法。
[0016]進一步地,包含如下步驟:
[0017]選取成年雌性小鼠，體重(18_21g)。用工具將血管夾兩臂寬度打磨至0.5mm，於兩臂間固定一定厚度間隔物使血管夾閉合時將脊髓壓迫至相應厚度。
[0018]腹腔麻醉小鼠，小鼠俯臥位固定於手術臺上，以胸11棘突為中心，備皮。75%酒精消毒背部皮膚，取背部正中切口切開皮膚，長約2cm。依次切開背斜方肌、背闊肌，顯露胸9-腰I椎體棘突及椎板。用精細蚊式止血鉗探查小鼠左側第13肋骨，其脊柱發出部位即胸12與胸13交界處，藉以判定胸11脊椎位置，小心咬除胸11椎體棘突及背側椎板。以血管夾從左右兩側將胸11節段小鼠脊髓夾傷，夾傷的過程中調整好夾傷力進行夾傷，持續15秒。術中以冰生理鹽水棉球壓迫止血。逐層縫合肌肉和皮膚，腹腔注射1.0ml生理鹽水以補充術中丟失血容量，置於暖光燈下復甦。術後分籠飼養，每天擠壓膀胱2次，以協助排尿，直至小鼠自主排尿反射恢復。
[0019]採用如上技術方案的本發明，相對於現有技術有如下有益效果:
[0020]1、雌性小鼠尿路相對於雄性小鼠更短，更易術後護理排。
[0021]2、8w以上體重大於18g的成年小鼠(雌性小鼠成年在18_22g)體型大小比較適宜夾傷操作。
[0022]3、體積較大，凸向背側的腰11節段椎體，更適於夾傷操作，亦便於術後取材。 [0023]4、通過探查肋骨而判斷脊柱節段的方法能夠準確無誤的判定所需夾傷的脊柱節段，具有良好的可靠性。
[0024]5、本模型非常類似於絕大多數人體脊髓損傷的實際過程。
[0025]6、本發明建立的動物模型重複性好。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]為了進一步說明本發明，下面結合附圖進一步進行說明:
[0027]圖1為夾子的結構示意圖；
[0028]圖2為夾子的調整夾持力的局部結構示意圖；
[0029]圖3為小老鼠脊椎部分結構示意圖；
[0030]1.頂緊螺釘；2.手持部分；3.頂住孔；4.夾子被頂緊側；5.夾子夾持穿透側。【具體實施方式】
[0031]下面結合附圖對本發明的實施例進行說明，實施例不構成對本發明的限制:
[0032]以下以小鼠的試驗模型建立為例；
[0033]實驗動物及夾傷裝置
[0034]成年雌性C57BL/6J小鼠，體重(18_21g)，由第三軍醫大學野戰外科研究所實驗動物中心提供。血管夾(微血管合攏器，ZF610R)購於山東新華器械有限公司，並用工具將血管夾兩臂寬度打磨至0.5_，於兩臂間固定不同厚度間隔物(0.1,0.25、0.4_直徑金屬絲)使血管夾閉合時將脊髓壓迫至不同厚度。夾子的結構如下:所述兩個側壁分別為夾子被頂緊側4和夾子夾持穿透側5，其中夾子被頂緊側4包含一個頂住孔3，頂住孔3為槽狀，還包含穿過夾子夾持穿透側5的穿透孔的頂緊螺釘1，所述穿透孔內壁上包含螺紋，所述頂緊螺釘I能夠在穿透孔中旋進或者或者旋出而調整夾子被頂緊側4和夾子夾持穿透側5之間的距離。通過旋進或者或者旋出頂緊螺釘1，調整夾子被頂緊側4和夾子夾持穿透側5之間的距離而調整夾持力度。因此可以調整夾傷力度。
[0035]另外，根據不同的動物還能夠選擇不同的夾傷距離和夾傷力度。
[0036]動物模型製作
[0037]4%水合氯醛腹腔麻醉小鼠(10ml/kg體重)，以胸11棘突為中心，備皮。75%酒精消毒背部皮膚，取背部正中切口切開皮膚，長約2cm。依次切開背斜方肌、背闊肌(注意避開斜方肌下方大血管)，顯露胸9-腰I椎體棘突及椎板。用精細蚊式止血鉗(ZH109R，山東新華器械有限公司)探查小鼠左側第13肋骨，其脊柱發出部位即胸12與胸13交界處，藉以判定胸11脊椎位置，小心咬除胸11椎體棘突及背側椎板(左右夾傷組)，腹背夾傷組還須咬除兩側椎弓根，僅保留椎管腹側骨質。以不同間隔厚度血管夾分別從左右兩側將胸11節段小鼠脊髓壓迫至0.1mm (n = 8)、0.25mm (η = 8)和0.4mm (η = 8),持續15s。對照組僅咬除胸11椎體棘突及椎板，不夾傷脊髓(η = 8)。術中以冰生理鹽水棉球壓迫止血。逐層縫合肌肉和皮膚，腹腔注射1.0cc生理鹽水以補充術中丟失血容量，置於暖光燈下復甦。術後分籠飼養，每天擠壓膀胱2次，以協助排尿，直至小鼠自主排尿反射恢復。
[0038]行為學觀察
[0039]小鼠後肢運動功能觀察採用BMS(Basso Mouse Score, BMS)運動功能評分法(表I)，於直徑100cm，高30cm的塑料觀察盆中進行。術前3d，所有小鼠均於觀察盆內預適應15min/d，傷後第一周於2d，4d，7d觀察3次，之後每周觀察I次，共8周。觀察時間取小鼠睡眠/覺醒周期中行動活躍階段，在晚間20:00進行。
[0040]
【權利要求】
1.一種精準化小鼠脊髓夾傷夾子，包含夾子頂端和其伸出的兩個側壁，兩個側壁之間形成夾持空間，其特徵在於，所述兩個側壁分別為夾子被頂緊側(4)和夾子夾持穿透側(5)，其中夾子被頂緊側(4)包含一個頂住孔(3)，頂住孔(3)為槽狀，還包含穿過夾子夾持穿透側(5)的穿透孔的頂緊螺釘(I)，所述穿透孔內壁上包含螺紋，所述頂緊螺釘(I)能夠在穿透孔中旋進或者或者旋出而調整夾子被頂緊側(4)和夾子夾持穿透側(5)之間的距離。
2.如權利要求1所述的一種精準化小鼠脊髓夾傷夾子，其特徵在於，所述頂緊螺釘(I)端部包含手持部分(2)，所述手持部分(2)為圓形。
3.如權利要求1所述的一種精準化小鼠脊髓夾傷夾子，其特徵在於，所述頂緊螺釘(I)上包含刻度。
4.一種精準化小鼠脊髓夾傷夾傷力度調整方法，利用如權利要求1所述的夾子，通過旋進或者或者旋出頂緊螺釘(I)，調整夾子被頂緊側(4)和夾子夾持穿透側(5)之間的距離而調整夾持 力度。
【文檔編號】A61D1/00GK103989536SQ201410168361
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年4月24日 優先權日:2014年4月24日
【發明者】趙天智, 石菲, 高國棟, 賀世明 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學