Piggybac轉座子變異及其使用方法

2023-09-10 07:19:20 1

專利名稱：：Piggybac轉座子變異及其使用方法PIGGYBAC轉座子變異及其使用方法
背景技術：
：本申請主張2009年2月25日申請的美國臨時申請案案號61/155，206的優先權，所述美國臨時申請案全文併入本申請做為參考。把DNA導入細胞的典型方法包含例如磷酸鈣的DNA濃縮劑試劑、聚乙二醇、含脂質的試劑，例如磷脂質、多層脂質體，以及由病毒為媒介的策略。然而，所述方法可具有一些限制。例如，DNA濃縮試劑與病毒媒介策略相關的大小限制。再者，在病毒策略中，可轉染至細胞的核苷酸量有限制。並非所有方法都能促使進入的核苷酸插入細胞的核苷酸中，以及雖然DNA濃縮方法與含脂質試劑相對容易製備，但是插入核苷酸至病毒載體中需要大量勞力。病毒為媒介的策略可以是細胞形式或組織形式專一性，以及在體內使用病毒為媒介的策略可產生免疫問題。解決這些問題的一種合適工具是轉座子。轉座子(transposons)或轉座因子(transposableelements)包含(短的)核苷酸序列，具有終端重複序列上遊與下遊。有活性的轉座子編碼的酵素會促使核苷酸的切除與插入至目標DNA序列中。轉座因子代表許多真核基因組的實質部分。例如，50%的人類基因組是衍生自轉座因子序列，以及其它基因組，例如植物，可包含實質更高比例的轉座因子衍生DNA。轉座因子典型分為兩類，第1類與第2類。第1類表示為反轉錄轉座子(LINEs、SINEs、LTRs與ERVs)。第2類包含「剪與貼"DNA轉座子，由終端反轉重複(IlRs)定性，以及被因子編碼的轉座酶(transposase)動員(mobilized)。目前，在真核細胞中，辨識10個超級家族的剪與貼DNA轉座子(FeschotteandPritham,2007)。雖然第2類在許多真核細胞中廣為分布且具有活性，但是已經被認為在哺乳動物基因組中轉座性地不活化。這結論主要是基於人類與老鼠基因組序列的初始分析。雖然兩個物種有許多不同的DNA轉座子，但沒有近代活性的顯示(Landeretat.2001；Waterstonetal.2002)。例如，在人類基因組中，有超過300，000個可辨識的DNA因子(elements)，它們被分為120個家族，並且屬於5個超級家族。這些因子大部分(40個家族；98，000複製(copies))合併在至少4-8千萬年，但是沒有證據顯示任何人類DNA轉座子家族比3萬7千年年輕(PaceandFeschotte,2007)。可在實驗室條件下模擬水平基因轉換的自然過程。在植物中，Ac/Ds與Spm家族已經時常轉染至異質物種(heterologousspecies)中(OsborneandBaker,1995Curr.Opin.CellBiol.7,406-413)。然而，在動物中，活性轉座子系統從一物種轉換至另一物種的障礙是轉換的物種專一性，需要自然宿主產生的要素(factors)。無脊椎動物與脊椎動物的轉座子在模式生物體中皆有轉基因(transgenesis)與插入突變(insertionalmutagenesis)的潛力。特別是在相同物種中其它轉座子系統的可得性開啟遺傳分析的新可能性。仍需要新方法導入DNA至細胞中，以及特別是促進不同大小的轉座子有效插入細胞核苷酸或是插入DNA至細胞基因組的方法，同時比目前技藝中可得的架構(construct)具更有效率的轉錄/轉譯結果。發明概述如下詳細說明，已知在許多昆蟲、鼠、豬與包含人類的哺乳類動物細胞中，粉斑夜W,(Trichoplusiani；cabbageloopermoth)的piggyBac^^子^^舌f生因子。*串i青的發明人已經分離粉斑夜蛾PiggyBac變異，比野生型(wildtype)的轉座頻率更高。高活性的轉座子可用於基因轉移統，把核苷酸穩定導入至細胞的DNA中。再者，本申請的發明人已經^!爭i只合併缺piggyBac轉移子(integrationdefectivepiggybacktransposons)0^發明的基因轉移系統可用於例如但不限於基因治療、插入突變或基因發現的方法中。因此，在第一方面，本發明特徵在於包括一或多高活性PiggyBac核苷酸序列的轉座子，及其保留轉座子活性的變異、衍生物與片段。在一實施例中，相較於野生型PiggyBac轉座子，高活性PiggyBac轉座子具有較高量的轉座子切除(transposonexcision)。在另一實施例中，轉座子包括2、3、4、5或更多的高活性piggyBac核苷酸序列以及其保留活性的變異、衍生物與片段的轉座子。在另一實施例中，高活性PiggyBac核苷酸序列是來自於Noctuidae屬。在另一相關實施例中，高活性piggyBac核苷酸序列是來自於粉斑夜蛾物種。在另一實施例中，所述核苷酸序列是選自於SEQIDNO:34_SEQIDNO:63或SEQIDNO70SEQIDNO:96。在另一實施例中，所述核苷酸序列編碼的胺基酸序列是選自SEQIDN0:3_SEQIDNO:32ο在另一方面，本發明特徵是包括一或多個合併缺陷的(integrationdefective)piggyBac核苷酸序列以及其變異、衍生物與片段的轉座子。在一實施例中，相較於野生型piggyBac轉座子，所述合併缺陷的(integrationdefective)piggyBac轉座子具有較低的合併率(rateofintegration)。在另一實施例中，所述合併缺陷的(integrationdefective)piggyBac核苷酸序列是來自於Noctuidae屬。在另一相關實施例中，所述合併缺陷的(integrationdefective)piggyBac核苷酸序列是來自於粉斑夜蛾物種。在一實施例中，所述核苷酸序列是選自於SEQIDN0:67-SEQIDNO:69。在另一實施例中，所述核苷酸序列編碼的胺基酸序列是選自SEQIDN0:64_SEQIDNO:66。在另一實施例中，所述野生型piggyBac轉座子包括對應於SEQIDNO:1的核苷酸序列。在一些實施例中，高活性變異包括SEQIDN0:2中胺基酸改變，選自於G2C、Q40R、S3N、S26P、DOV、G165S、T43A、Q55R、T57A、S61R、I82V、I90V、S103P、S103T、N113S、M185L、M194V、S230N、R281G、M282V、G316E、P410L、I426V、Q497L、K501N、K565I、N505D、S573L、S509G、N570S、N538K、K575R、Q591P、Q591R、F594L。在上述方面的實施例中，所述轉座子可插入至細胞的DNA中。在上述方面的另一實施例中，所述轉座子可包括標示蛋白質(markerprotein)0在上述方面的另一實施例中，所述轉座子是插入質體(plasmid)中。在一實施例中，所述轉座子更包括至少一部份的開放讀架(openreadingframe)。在另一實施例中，所述轉座子更包括至少一表現控制區域。在另一實施例中，所述表現控制區域是選自於啟動子、促進子或消音子(silencer)。在另一相關實施例中，所述轉座子更包括啟動子操作連結至至少一部份的開放讀架。在一實施例中，所述細胞是得自於動物。在另一實施例中，所述細胞是得自於脊椎或無脊椎動物。在另一實施例中，所述脊椎動物是哺乳動物。在一實施例中，本發明特徵在於包括根據任一上述方面的轉座子的基因轉移系統；以及PiggyBac轉座酶。在一實施例中，piggyBac轉座酶是來自於Noctuidae屬。在相關實施例中，所述PiggyBac轉座酶是來自粉斑夜蛾物種。在另一實施例中，所述piggyBac轉座酶包括對應於SEQIDNO:33的胺基酸序列。在另一實施例中，所述piggyBac轉座酶是哺乳動物piggyBac轉座酶。在一實施例中，所述轉座子是插入細胞的基因組中。在另一實施例中，所述細胞是得自於動物。在另一實施例中，所述細胞是得自於脊椎或無脊椎動物。在另一實施例中，所述脊椎動物是哺乳動物。在一些實施例中，本發明特徵也在於包括任依上述方面的轉座子的細胞。在其它方面中，本發明特徵在於包括轉座子的醫藥組合物，所述轉座子包括高活性的PiggyBac核苷酸序列與piggyBac轉座酶，以及醫藥可接受的載體、輔劑或運送體。本發明特徵也在於導入外來DNA至細胞中的方法，所述方法包括使細胞接觸上述方面的基因轉移系統，因而導入外來DNA至細胞中。在一實施例中，所述細胞是幹細胞。本發明特徵也在於套組，所述套組包括含有高活性piggyBac核苷酸序列以及導入DNA至細胞中的說明。在一實施例中，所述高活性piggyBac核苷酸序列是來自於Noctuidae屬。在另一實施例中，所述高活性PiggyBac核苷酸序列是來自於粉斑夜蛾物種。在另一實施例中，所述核苷酸序列是選自SEQIDNO:34_SEQIDNO:63或SEQIDNO:70-SEQIDNO:96。在另一方面，本發明特徵也在於套組，所述套組包括轉座子與使用說明，所述轉座子包括合併缺陷的PiggBac核苷酸序列。在一實施例中，所述核苷酸序列是選自SEQIDNO:67_SEQIDNO:69。由本申請的詳細說明與權利要求書可清楚理解本申請的特徵與優點。定義除非特別指出，否則本申請的實施是使用習知的化學、分子生物學、微生物學、重組DNA與免疫學的技術，這些都是熟知此技藝的人士能力範圍之內。文獻中已解釋這些技術。例如，J.Sambrook，E.F.Fritsch與T.Maniatis，1989，MolecularCloningALaboratoryManual,SecondEdition,Books1-3,ColdSpringHarborLaboratoryPress；Ausubel,F.Μ.etal.(1995與periodicsupplements；CurrentProtocolsinMolecularBiology,ch.9,13與16,JohnWiley&Sons，NewYork,N.Y.)；B.Roe,J.Crabtree與A.Kahn,1996,DNAIsolationandSequencing:EssentialTechniques,JohnWileyJ.Μ·PolakandJames0'D.McGee,1990,InSituHybridizationPrinciplesandPractice；OxfordUniversityPress；M.J.Gait(Editor),1984,OligonucleotideSynthesis:APracticalApproach,IrIPress；D.Μ.J.Lilley與J.Ε.Dahlberg,1992,MethodsofEnzymology:DNAStructurePartA:SynthesisandPhysicalAnalysisofDNAMethodsinEnzymology,AcademicPress；UsingAntibodies:ALaboratoryManual:PortableProtocolNO.IbyEdwardHarlow,DavidLane,EdHarlow(1999,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ISBN0-87969-544-7)；Antibodies:ALaboratoryManualbyEdHarlow(Editor),DavidLane(Editor)(1988,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ISBN0-87969-3,4-2),1855.HandbookofDrugScreening,由RamakrishnaSeethala,PrabhavathiB.Fernandes編輯(2001,NewYork,N.Y.,MarcelDekker,ISBN0-8247-0562-9)；以及LabRef:AHandbookofRecipes,Reagents,andOtherReferenceToolsforUseattheBench,JaneRoskamsandLindaRodgers編輯，2002，ColdSpringHarborLaboratory,ISBN0-87969-630-3。這些文獻皆併入本申請做為參考。在本申請中，除非特別說明，否則以下語詞的意義如下所述。在本申請中，「包括」與「具有」等類似語詞可具有美國專利法中所定義的意義，以及可以代表「包含」與類似語詞；「實質上由…組成」的意義如美國專利法中所描述，以及所述語詞是開放式的，允許超出主張之外的新增內容存在，只要所主張的基本或新穎特徵不受增加物的影響，但排除習知技藝的實施例。在本申請中，「合併缺陷的」語詞是指相較於對應野生型轉座子，以較低頻率整合(integrate)至宿主基因組的轉座子。在一些實施例中，本申請的轉座子是通過習知的整合機制而整合。在本申請中，「核苷酸」或「聚核苷酸」語詞是指單股或雙股DNA與RNA，以及其組合物。聚核苷酸可包含有不同功能的核苷酸序列，例如包含編碼序列以及非編碼序列，例如調節序列。聚核苷酸可直接得自於自然來源，或是可用重組、酵素或化學技術的輔助製備而得。聚核苷酸型態可以是線形或是環形。例如，聚核苷酸可以是載體的一部分或是片段。「編碼序列」或是「編碼區域」是編碼多肽的聚核苷酸，以及當放在適當調節序列的控制下時，表現編碼的多肽。編碼區域的邊界通常是由5』端的轉譯起始碼與3』端的轉譯停止碼決定。調節序列是核苷酸序列，調節其操作連結的編碼區域的表現。調節序列的非限制範例包含啟動子、轉錄起始位置、轉譯起始位置、轉譯停止位置、轉錄終結子(包含例如聚腺苷酸化信號)以及居中序列(interveningsequence)(內含子；introns)。在本申請中，「操作連結」語詞是指與另一核苷酸序列有功能關係的核苷酸序列。例如，如果編碼序列是操作連結至啟動子序列，則這通常是指所述啟動子可啟動編碼序列的轉錄。操作連結是指連結的DNA序列典型是鄰近的，以及視需要，連接兩個蛋白質編碼區域，讀取架連續。由於當與啟動子相距幾千鹼基時，促進子(enhancer)仍具有功能，以及內含子序列可以是不同長度，所以有些核苷酸序列可以是操作連結但並不相鄰。在本申請中，「多肽」語詞是指任何長度的胺基酸聚合物。因此，多肽的定義中包含例如胜肽、寡胜肽、蛋白質、抗體與酵素。這語詞也包含多肽的表現後修飾，例如醣基化(例如增加醣類)、乙醯基化、磷酸化等。在本申請中，「轉座子」或「轉座因子」是指多可從供應(donor)多核苷酸切割出來的核苷酸，所述供應多核苷酸例如載體，並且可合併至目標位置，例如細胞的基因組或是染色體外的DNA。轉座子包多核苷酸，所述多核苷酸包含由在轉座子終端由cis-acting核苷酸序列側邊相接的核苷酸序列。如果至少一cis-acting核苷酸序列是位在核苷酸序列的5』以及至少一cis-acting核苷酸序列是位在核苷酸序列的3』，則核苷酸序列是被cis-acting核苷酸序列「側邊連接」。Cis-actging核苷酸序列包含在轉座子各端的至少一倒轉重複(在本申請中也是指倒轉終端重複，ITR)，較佳是哺乳動物piggyBac家族轉座酶結合的轉座子。在一些較佳實施例中，所述轉座子是來自Noctuidae家族。在一些較佳實施例中，所述轉座子是粉斑夜蛾(Trichoplusiani；cabbageloopermoth)的piggyBac轉座子。在本申請中，「粉斑夜蛾」是指Noctuidae蛾屬的一員。「分離的」多肽或多核苷酸是指已經從自然環境移除、使用重組技術產生的或是化學或酵素合成的多肽或多核苷酸。較佳地，本發明的多肽或多核苷酸是純化的，亦即實質上沒有任何其它的多肽或多核苷酸以及相關的細胞產物或其它雜質。在本申請中，「轉座酶」語詞是指催化從供應多核苷酸(例如載體)切除轉座子以及後續合併轉座子至目標細胞基因組或染色體外DNA的多肽。較佳地，轉座酶結合倒轉序列或直接重複。轉座酶可以呈現為多肽。或者，所述轉座酶呈現為多核苷酸，包含編碼轉座酶的編碼序列。所述多核苷酸可以是RNA，例如編碼轉座酶的mRNA，或是DNA，例如編碼轉座酶的編碼序列。當轉座酶呈現為編碼轉座酶的編碼序列時，在本發明的一些方面中，所述編碼序列可以存在包含轉座子的相同載體上，亦即incis。在本發明的其它方面中，所述轉座酶編碼序列可存在第二載體上，亦即intrans.在一些實施例中，所述轉座酶是哺乳動物piggyBac轉座Bi。圖1是表格(表幻說明在本發明高活性變異中，與野生型(正常化至1)不同的胺基酸改變與折迭增加。圖2(A與B)，(A)部分說明野生型粉斑夜蛾轉座子的核苷酸序列，對應於SEQIDNO1以及對應胺基酸序列(SEQIDNO:2，(B)部分說明對應於野生型粉斑夜蛾轉座酶的胺基酸序列，對應於SEQIDNO:33ο圖3說明切割高活性piggyBac突變株的辨識。圖4說明合併缺陷的piggyBac轉座子的胺基酸序列，對應於SEQIDNOs64-66。具體實施例方式對於基因工程使用轉座子的能力是高度取決於它可移動的頻率。例如，如果10個子代中有1個具有轉座子活動，則比1000個子代中有1個發生轉座子活動更容易分離出所要的衍生型。本申請的發明人已經從粉斑夜蛾分離高活性PiggyBac轉座子，它比野生型具有更高的轉座活性。在許多生物中使用插入突變與轉殖，廣用轉座子例如PiggyBac於基因組工程。來自粉斑夜蛾的PiggyBac轉座子已顯示為在昆蟲、老鼠、豬與包含人類的哺乳動物細胞中是活性因子。因此，本發明特徵在於高活性piggyBac轉座子。高活性piggyBac轉座子是指比野生型PiggyBac轉座子具有更高頻率的轉座活動(transposonevent)。例如，在一些實施例中，高活性PiggyBac轉座子發生轉座0.5倍、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、45倍、50倍或更多。根據本發明的較佳實施例，高活性piggyBac轉座子與轉座酶結合，包含一對重複序列。在一些較佳實施例中，第一重複是典型位在核苷酸序列的上遊，以及第二重複是典型位在核苷酸序列的下遊。因此，第二重複與第一重複的序列相同，但是與第一重複的讀取方向相反(互補雙股序列的5』與3』端交換)。由於兩重複是正好相反的重複序列，所以這些重複稱為「倒轉重複」(IRs)。在一些實施例中，在上述核苷酸序列的上遊或下遊，可發生多個重複。較佳地，位在上述核苷酸序列上遊與下遊的重複數量一樣。在一些實施例中，所述重複是短的，在10-20鹼基對之間，較佳是15個鹼基對。本申請所述的重複aRs)較佳是入細胞DNA的核苷酸序列。核苷酸序列可包含基因的全部或部分的開放讀架(亦即部分的蛋白質編碼基因)、一或多個表現控制序列(亦即核苷酸中的調節區域)或連同所有或部分的開放讀架。較佳的表現控制序列包含但不限於啟動子、促進子、邊界控制因子、位置控制區域或消音子。在較佳實施例中，核苷酸序列包括啟動子操作連接至至少一部份的開放讀架。根據一些實施例，本發明的高活性轉座子可較佳發生為線性轉座子(從5』端至3』端延伸)，可用作為線性片段或環化，例如在質體中。本發明特徵在於高活性piggyBac核苷酸序列及其保留轉座子活性的變異、衍生物與片段。在本發明的較佳實施例中，相較於野生型PiggyBac轉座子，高活性piggyBac轉座子具有較高量的轉座子切害1J(transposonexcision)。在一些較佳實施例中，所述高活性piggyBac核苷酸序列是來自於Noctuidae屬。在其它實施例中，所述高活性PiggyBac轉座子核苷酸序列是來自粉斑夜蛾。本發明的較佳實施例是指編碼本申請定義的高活性piggyBac轉座子的核苷酸。熟知此技藝的人士可知由於遺傳碼的重複性(degeneracy)，因此許多不同的多核苷酸可邊碼相同的多肽。除此之外，應理解熟知此技藝的人士可使用慣常技術製造核苷酸取代，而不影響本發明多核苷酸編碼的多肽序列，用來反應任何特定宿主生物表現所述多肽的密碼子使用。可用此技藝的任何方法修飾所述多核苷酸。可進行所述修飾，用來促進本發明多核苷酸的體內活性或生命期。可用重組、合成或熟知此技藝的人士知道的任何技術產生多核苷酸例如DNA多核苷酸。也可以用標準技術選殖產生。通常使用重組方法可產生較長的多核苷酸，例如使用PCR(聚合酶鏈反應)選殖技術。這涉及製造一對引子(例如約15至30核苷酸)側接要選殖的脂質目標序列區域，使引子接觸動物或人類細胞的mRNA或cDNA，在放大所要區域需要的條件下，進行聚合酶鏈反應，分離放大的片段(例如在洋菜膠體上純化反應混合物)以及回收放大的DNA。所述引子可被設計為包含合適的限制酵素辨識位置，因而被放大的DNA可被選殖到合適的選殖載體中。應理解本發明的多核苷酸可以只包含編碼區域。然而，較佳是如果所述多核苷酸更包括一部分核苷酸在操作連結中，允許編碼區域的有效轉譯。更佳是如果所述多核苷酸(DNA形式)更包括啟動子在操作連結中，允許編碼區域的轉錄，以及部分的核苷酸允許在目標細胞中編碼區域的有效轉譯。根據本發明，核苷酸典型包括核醣核酸，包含mRNA、DNA、cDNA、染色體DNA、染色體外DNA、質體DNA、病毒DNA或RNA。在一些較佳實施例中，由於遺傳密碼的重複性，核苷酸較佳是選自編碼高活性PiggyBac轉座子相同胺基酸序列的任何核酸序列。這些其它的核苷酸序列可在選擇的宿主生物中造成編碼融合蛋白質的改良表現。熟知此技藝的人士知道適當調整核苷酸序列的表格。通常用標準程序進行所述核苷酸與/或衍生物的製備與純U(i^jALSambrooketal.2001,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor,N.Y.)。相較於自然的核苷酸序列，這些自然核苷酸的其它變異可具有一或多個插入、刪除與/或取代的密碼子。相較於轉座子的自然核苷酸序列，這些序列變異較佳造成具有至少一胺基酸取代、刪除與/或插入的合併缺陷與/高活性PiggyBac轉座子蛋白質。因此，本發明的核苷酸序列可編碼修飾的(非自然的)轉座子序列。再者，啟動子或其它表現控制區域可操作連結編碼本申請蛋白質的核苷酸，用來調節蛋白質表現的量或組織特性。在特定實施例中，粉斑夜蛾野生型PiggyBac轉座子包括對應於SEQIDNO1的核苷酸序列。SEQIDNO1粉斑夜蛾PiggyBac轉座子iA；、『Iι·.^-I^u··、.,'<ιχ^.ν\.Sit'i*νk<t？『H·,『-J^rKi■.t<、》f、f、/<t^··{IhPkI·<.「ft'Λ*Τ"1AFΓ.V，，·Λ*·""%/·■ΛΛ/<,·"ι<￠---.4"Λ'Ν<M<'M,y-Λ.^rKit·,tS4J。·Μ·>·,·t眾塞農Γ*^f.r^·*^^rsT；；νγ·**·'rτ■■■Ss>i^it-',S<·;.·.sfS^iνΑ>υ.二.；；s，約Jr』.二.S-Is"Λ-fW""1-—~、"S"κ『『『『*"iS,'·r>α·η,『「-4.產<<「1<XXyV—1—-<*<-^\Ii,itiJW-.^wVi^t.Ut.Ji..^itJ,'JiiCV2"*Ji·X.,IνΛ.tVΑ.^AA/ΑΛ.A^t*^^y-iJ'f^ni.^yii^a'T？WW:--*-·Α·'υρW·(·.·-T^vvwwwx.r*!；,νΛ}i-N/W-W.^々，作氣.滬Λ，.-ψyw-aw^svshywwxs*..*^--.~^^▲JJ--··."'-.ieJi^Vvvti.-I-VlLi.i'i2-ΛΛJl-<_·^/V^.ΗΛ鉍-鎮,J·tν,=Kt*■λ■『.'ΛV.Λ(『J■%>-·.Ji^4.··.IS^iΑ，\Λ"ΓJ。T·Λj.W-Γ7IJΓ:^.""Α,、.「'^j.TA-AwmTT,*i°TJACA-""/ΛΓ*-u""WVT""ΓΛ▲*-λM·"wi-*ΜΜ.1<-s'「「『'i"力,'Λ"Γ"*『「5/」；5.*H"』/1；」』乙，，廠』,Afi『二,AAW；'.^AΛ*.../C..'Iτ、，iV.W.·.uι^JtSimW.'ι-Vt^TT/'.^ν.11A,sJiju'tj'^-Λ-X-·>··■·,,,,-1O.,'^-r1-f,t—,fψ-->^V-ν—'Λ^H滬H、-%·-*·".^ζSM.J^tJ^『-ΑΗ.X.i-t>,H.'1SJ,JfA1:J^tA.''*ΛΑJ>"ΛΑ5!一AA、J"*"2aZ'〕二AAr-^v5-T-『了『:^I^Z.「；…-。廣CA^T-■"wA.'AAA·JT^T-2iTiJ^T>■-·ι·S^ΛJ.,―料"Λi1S<*■μ^i·^>ii,Ικ-4.if·*.『々iι{^；ι4·>tc'i.「fKΛ、ιΛ'iιA^t、ΑιΛ、『^w、p、-Λ,yi'~·；Jwy-Γ:j_χ"IiAΓΑ·ΧΙ1Α·νΓJA^^XA'JJ-Γ？i^ri-ΛΑ77J^TΓ-AΓΤΛΓV^\JAi*J1A^AAs:'7.A..,t<^srΓ\A-tΑ,.Γ."V、k■J、"SWit*「fcv·Λ『---·"J.7I4<『1A·=-j"j'-,^iV]...,,Ι*,ItJIUiJ-,/i..-i^...tJ\f.>4i.ii'*L1.。《*u4ii.i·"rrr》rW'JV:"7'/r.c-VIA"*;*Af^^riwj；"αλια;._r」AHs!9IIs:J·i>>(t.-■·/>'J·V--V『，"^Ι、-『-5；I1I1M「A,『t^Ttχ>、ti—-·>Λ-"、.<*--Jf、Τ*""·^TT1S「4**"f*、s.·■.4-j.-a~I..*■Caspase~2>Caspase-3>Caspase~4>Caspase-5>Caspase~6>Caspase-7>Caspase~8>Caspase-9、Caspase-10、Caspase-ll>或GranzymeB、ced_3、ced_9、Ceramide>c_Jun、c-Myc、CPP32、crmA、Cytochromec、D4-GDP-DI、Daxx、CdRl、DcRl、DD、DED,DISC、DNA-PK.sub.CS、DR3、DR4、DR5、FADD/M0RT-1、FAK,Fas、Fas-IigandCD95/fas(受體)、FLICE/MACH>FLIP、Fodrin、fos、G-Actin>Gas_2、Gelsolin、glucocorticoid/glucocorticoid受體、granzymeAfB、hnRNPsC1/C2、ICAD、ICE、JNK、LaminA/B、MAP、MCL-I、Mdm_2、MEKK-I、MORT-I、NEDD,NF-.sub..kappa.B、NuMa,p53、PAK-2、PARP,Perforin、PITSLRE、PKC.delta.、pRb，Presenilin、prICE、RAIDD、Ras、RIP、Sphingomyelinase、SREBPs、單純皰疹病毒的thymidinekinase、TNF-alpha、TNF-alpha受體、TRADD、TRAF2、TRAIL-Rl、TRAIL-R2、TRAIL-R3、Transglutaminase、Ul70kDasnRNP、YAMA的基因。本發明的piggyBac轉座子較佳是結合piggyBac轉座酶，相較於習知技藝的方法有一些優點，所述習知方法是關於病毒與反轉錄病毒的方法。例如，不同於原病毒的插入，通過intrans提供轉座酶活性，轉座子插入可以被(再)動員化((immobilized)。因此，例如除了進行耗時的微注射之外，也可根據本發明在新的位置產生轉座子插入。本發明的piggyBac轉座子結合上述定義的piggyBac轉座酶蛋白質可被轉染至細胞中，成為蛋白質或包含mRNA的核糖核酸、成為DNA，例如成為染色體外DNA，包含但不限於游離DNA、成為質體DNA或是成為病毒核苷酸。再者，編碼轉座酶蛋白質的核苷酸可被轉染至細胞中，成為核苷酸載體，例如質體，或是成為基因表現載體，包含病毒載體。因此，核苷酸可以是環形或是線形。本申請使用的載體是指質體、病毒載體或是黏質體(cosmid)可合併編碼本發明的轉座酶蛋白質或轉座子的核苷酸。「編碼序列」或是「開放讀架」是指當放在適當調節序列的控制下十，可在體內被轉錄與/或轉譯成為多肽的核苷酸區域。編碼轉座酶蛋白質的DNA可穩定插入細胞的基因組中或是插入在體中，用於持續或是可誘導型的表現。當轉座酶蛋白質轉染至細胞中或插入載體中成為核苷酸時，轉座酶編碼序列較佳是操作連結至啟動子。有許多啟動子可使用，包含但不限於持續啟動子、組織特異性激活子、可誘導的激活子與類似物。啟動子是調節信息，在細胞中結合RNA聚合酶，起始下遊(3』方向)編碼序列的轉錄。DNA序列操作連結至表現控制序列，例如啟動子，表現控制序列控制且調節DNA序列的轉錄與轉譯。「操作連結」包含在要表現的DNA序列前具有適當的開始信息(例如ATG)，以及維持正確的讀架，在表現控制序列的控制下，允許DNA序列的表現，產生所要的蛋白質產物。編碼高活性PuggyBac轉座子的核苷酸序列例如SEQIDNO:3-SEQIDNO:32或本申請所述的其它高活性變異。除了上述保守改變會需要改變轉座子編碼核苷酸序列(如本申請所述)之外，還有編碼高活性PiggyBac轉座子蛋白質的其它DNA或RNA序列。這些DNA或RNA序列具有與高活性piggyBac轉座子蛋白質相同的胺基酸序列，但是利用三個字母密碼子的重複性指定特定的胺基酸。例如，此技藝中已知可交替使用不同的特並RNA密碼子(對應於DNA密碼子，由U取代T)，編碼特定的胺基酸。DNA與蛋白質的操作方法是此技藝中已知的，並且文獻具有詳細說明，例如Sambrooketal,(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress或Ausubel,R.Μ.,ed.(1994).CurrentProtocolsinMolecularBiology。基因轉移系統本發明特徵也在於基因轉移系統，包括本發明的轉座子、本申請所述的合併缺陷的轉座子或高活性PiggyBac轉座子，以及本申請所述的piggyBac轉座酶。如上所述，piggyBac轉座酶蛋白質較佳是辨識高活性piggyBac轉座子上的重複(例如IR)。因此，本發明的基因轉移系統較佳是包括兩個成員本申請描述的轉座酶，以及本申請描述的高活性轉座子或合併缺陷的轉座子。較佳地，在一些實施例中，轉座子具有至少兩個重複(例如^s)。當兩個成員放在一起時，提供轉座子活性，以及允許轉座子重新定位。使用時，轉座酶結合至所述重複，以及啟動介於中間的DNA序列插入至細胞的DNA中，如下所述。在其它實施例中，所述基因轉移系統包括上述定義本發明的piggyBac轉座子結合piggyBac轉座酶蛋白質(或編碼piggyBac轉座酶的核苷酸，在細胞中提供活性)。這結合較佳造成插入核苷酸序列至細胞的DNA中。或者，通過非同質重組與許多可再現的機制，可能插入本發明的轉座子至細胞的DNA中。使用此基因轉移系統，本發明的轉座子可用於基因轉移。在一些較佳實施例中，所述基因轉移系統使用piggyBac轉座酶蛋白質，媒介插入高活性PiggyBac轉座子至不同細胞形式與不同物種的DNA中。較佳地，所述細胞包含適合本申請的任何細胞，包含但不限於動物細胞或來自細菌、真菌(例如酵母菌)或植物的細胞。較佳的動物細胞可以是脊椎動物或無脊椎動物的細胞。例如，較佳的脊椎動物細胞包含來自哺乳類動物的細胞，包含但不限於嚿齒動物，例如大鼠，有蹄類哺乳動物，例如牛或山羊、綿羊、豬，或人類細胞。在其它實施例中，這些細胞，特別是來自上述定義哺乳動物的細胞可以是分化多能的(pluripont)(亦即這些細胞的子代可以分化為數種有限的細胞型式，例如血液幹細胞或其它幹細胞)，以及分化全能(totipotent)細胞(亦即這些細胞的子代可變成器官中的任何細胞型式，例如胚胎幹細胞)。使用這些細胞有利於穩定表現轉座酶或得到已經轉染本發明基因轉移系統成員的許多細胞。此外，也可考慮卵母細胞、蛋以及一或多胚胎細胞，作為本發明基因轉移系統穩定轉染的目標。在本發明的一些實施例中，所述細胞是幹細胞。接收本發明PiggyBac轉座子與/或piggyBac轉座酶蛋白質的細胞且可插入轉座子至細胞DNA中，所述細胞可包含但不限於淋巴細胞、肝細胞、神經細胞、肌肉細胞、許多血液細胞以及器官的不同細胞，胚胎幹細胞、體幹細胞例如血液前驅細胞、胚胎、受精卵、精細胞(其中有些細胞可在體外操作)。在一些其它的實施例中，如果本發明的ρiggyBac轉座子，例如高活性ρiggyBac轉座子，與細胞內的PiggyBac轉座酶蛋白質接觸，則接受本申請轉座子的細胞DNA可包含所要轉染細胞(如上所述)中的任何DNA。例如，所述DNA可以是細胞基因組的一部分，或是染色體外，例如游離基因、質體、環行或線形DNA片段。插入的典型目標例如雙股DNA。本申請的基因轉移系統成員，亦即piggyBac轉座酶蛋白質(蛋白質或是由本申請所述核苷酸編碼的)以及本發明的PiggyBac轉座子可被轉染至細胞中，較佳是轉染至上述定義的細胞中，更佳是轉染至相同的細胞中。這些成員的轉染更可順序發生或是平行發生。例如，piggyBac轉座酶蛋白質或是其編碼核苷酸可同時轉染至上述定義的細胞中，或是在轉染哺乳動物piggyBac轉座子之後，轉染PiggyBac轉座酶蛋白質或是其編碼核苷酸至上述定義的細胞中。或者，在轉染PiggyBac轉座酶蛋白質或其編碼核酸序列之前、同時或之後，可轉染所述轉座子至上述定義的細胞中。如果是平行轉染，較佳是在投與之前，兩個成員在個別的配方中與/或直接比次混合，避免轉染前發生轉座。此外，可重複進行投與基因轉移系統的至少一成員，例如投與至少一、二或多劑量的成員。對於上述任何的轉染反應，可用此技藝中已知的合適方式調配所述基因轉移系統，或成為本申請所述的醫藥組合物或套組。在其它較佳實施例中，使用粒子轟擊、電子穿孔、微注射、結合具有含脂質載體的成員，例如陽離子脂質載體、DNA濃縮劑(例如磷酸鉀、聚離胺酸或聚乙亞胺)以及插入所述成分(亦即插入核苷酸至病毒載體中，以及使病毒載體接觸細胞)，所述基因轉移系統的成員較佳可被轉染至一或多細胞中。當使用病毒載體時，所述病毒載體可包含所述技藝中已知的任何病毒載體，選自反轉錄病毒載體、腺病毒載體或是腺相關病毒載體。如上所述，編碼piggyBac轉座酶蛋白質的核苷酸可以是RNA或是DNA。同樣地，編碼piggyBac轉座酶蛋白質的核苷酸或本發明的轉座子可轉染至細胞中，成為線形片段或是環形片段，較佳是質體或是重組的病毒DNA。再者，編碼piggyBac轉座酶蛋白質的核苷酸較佳是穩定的或暫時插入細胞的基因組中，促使細胞中PiggyBac轉座酶的暫時或延長表現。上述的基因轉移系統代表修飾過的非病毒DNA媒介的基因轉移。例如，使用病毒作為基因治療劑會使遺傳工程設計受限於病毒基因組的大小、結構與表現調節。本申請所述的非病毒載體主要是由合成的起始材料產生，因而比病毒載體更容易製造。相較於病毒試劑，非病毒試劑比較不可能成為免疫原，可重複投與。非病毒載體比病毒載體更穩定，因而比病毒載體更適合醫藥配方與應用。除此之外，本發明的基因轉移系統是非病毒基因轉移系統，便於插入至DNA，以及明顯改善穩定基因轉移的頻率。本發明更提供有效的方法用於產生轉殖動物，包含把本發明的基因轉移系統用於動物。轉職DNA並未有效率地插入染色體中。只有大約百萬分之一的外來DNA分子會插入細胞的基因組中，通常數次切割周期進入發展。結果，大部分的轉殖動物是mosaic(Hackettetal.(1993).Themolecularbiologyoftransgenicfish.InBiochemistryandMolecularBiologyofFishes(Hochachka&Mommsen，eds)Vol.2，pp.207—240)。@]ft，必須培養已經傳遞轉殖DNA的胚胎所培育的動物，直到分析到配子有插入的外來DNA存在。許多轉殖動物由於位置效應而無法表現轉殖基因。需要簡單、可靠的程序，在一個細胞階段，導引早期插入外來DNA至動物的染色體中。本發明的系統協助填補這個需要。在一些較佳實施例中，本發明的基因轉移系統可用於產生轉殖動物，在動物的一個或多個細胞中，攜帶特定標示或表現特定蛋白質。通常，此技藝中已知產生轉殖動物的方法，以及合併本發明基因轉移系統至這些技術中並不需要過度實驗，例如有許多產生轉殖動物的方法用於研究，或用於蛋白質生產，包含但不限於Hackettetal.(1993,supra)0此技藝中已有產生轉殖動物的其它方法的描述(例如Μ.Markkulaetal.Rev.R印rod.，1,97-106(1996)；R.T.Walletal.,J.DairyScL，80，2213-2224(1997))，J.C.Dalton，etal.(Adv.Exp.Med.Biol.,411,419-428(1997))andH.Lubonetal.(Transfus.Med.Rev.,10，131-143(1996))。在另一實施例中，本發明特徵在於由本申請方法產生的轉殖動物，較佳是使用本申請所述的基因轉移系統。例如，轉殖動物較佳可包含由所述基因轉移系統插入動物基因組中的核苷酸序列，因而所述轉殖動物可產生其基因產物，例如蛋白質。在轉殖動物中，此蛋白質較佳是由細胞分離的產物，例如本發明的蛋白質可產生在奶、尿、血液或蛋中。可使用啟動子，促進奶、尿、血液或蛋中的表現，以及這些啟動子包含但不限於酪蛋白啟動子、老鼠尿蛋白啟動子、貝塔球蛋白啟動子以及卵白蛋白啟動子。已經使用在細胞中產生蛋白質的其它方法，產生重組的生長荷爾蒙、重組的胰島素以及許多其它重組蛋白質。編碼這些或其它蛋白質的核苷酸可被插入至本發明的轉座子中，並且轉染至細胞中。上述本發明轉座子的有效轉染至細胞DNA中發生在當有哺乳動物的piggyBac轉座酶蛋白質存在時。當所述細胞是組織的一部分或是轉殖動物的一部分時，可得到大量的重組蛋白質。可從脊椎動物與無脊椎動物選擇轉殖動物，例如魚、鳥、哺乳動物，包含但不限於例如大鼠或老鼠的嚙齒動物、例如牛或山羊、綿羊、豬的有蹄類哺乳動物，或人類。本發明更提供基因治療的方法，包括導入所述基因轉移系統是本申請所述細胞中。因此，本申請中所述本發明的PiggyBac轉座酶較佳包括基因，用來提供基因治療至細胞或生物。較佳地，所述基因是在組織特異性激活子、廣布啟動子或在細胞中表現基因需要的一或多個其它表現控制區域的控制下。目前，測試許多基因用於許多基因治療，包含但不限於CFTR基因用於囊性纖維變性、腺苷去胺酶(ADA)用於免疫系統疾病、因子IX與介白素-2(IL-2)用於血液細胞疾病、阿法-1-抗胰蛋白酶用於肺病，以及腫瘤壞死因子(INF)與多抗藥性(MDR)蛋白質用於癌症治療。可在已知的基因資料庫，例如GenBank，獲得這些以及許多人類或動物特異性的基因序列，包含編碼標示蛋白質與許多重組蛋白質的基因序列。本發明基因轉移系統用於基因治療的優點是不受限於重複之間的中間核苷酸序列大小。使用哺乳動物PiggyBac轉座子蛋白質，可插入細胞DNA中的核苷酸序列大小沒有已知的限制。在特定的較佳實施例中，對於基因至料以及本發明的其它目的，可用許多方法將所述基因轉移系統轉染至細胞中，例如微注射、脂質媒介的方法或是病毒媒介的方法。例如，當使用微注射時，對於本發明轉座子的中間序列的大小有非常小的限制。同樣地，脂質媒介的方法沒有實質的大小限制。然而，導入基因轉移系統至細胞中的其它方法，例如病毒媒介的方法，可限制位於重複之間核苷酸序列的長度。因此，在一些實施例中，本申請所述的基因轉移系統可通過病毒傳遞至細胞，所述病毒包含反轉錄病毒(例如慢病毒)、腺病毒、腺關聯病毒、泡疹病毒以及其它病毒。有一些傳送機制的潛在組合，可用於高活性PiggyBac轉座子部分，包含由終端重複側接的轉基因以及編碼轉座酶的基因。例如，可在相同的重組病毒基因組中包含轉座子與轉座酶基因；單一感染傳送基因轉移系統的兩部分，因而轉座酶的表現而後導引從重組病毒基因組切除轉座子，後續插入細胞的染色體中。在另一範例中，可通過病毒與/或非病毒系統的組合，例如包含脂質的試劑，分別遞送轉座酶與轉座子。在這些例子中，轉座子與/或轉座酶基因可由重組病毒遞送。在每個例子中，表顯的轉座酶基因導引轉座子從載體DNA(病毒基因組)釋出，插入至染色體DNA中。在本發明的一些較佳實施例中，本發明的piggyBac轉座子可用於插入突變，較佳是經過辨識突變基因。DNA轉座子特別是具有不同於習知技藝的優點，例如關於病毒與反轉錄病毒方法。例如，不同於原病毒插入，可通過intrans提供轉座酶活性，再定位(remobilize)轉座子插入。因此，取代進行耗時的微注射，根據本發明可交連(crossing)儲存的轉殖，轉座子系統的上述兩成員，本發明的轉座子與本發明的轉座酶，在新位置產生轉座子插入。在較佳實施例中，為了突變生殖細胞，基因轉移系統是針對實驗動物的生殖系。或者，轉座酶表現可使用針對特定組織或器官的許多特定啟動子。此外，突變的轉座子在插入位置外的再定位可用於分離反突變體(revertants)，以及如果轉座子切除與側接DNA的刪除相關，則本發明基因轉移系統可用於產生刪除突變。再者，由於轉座子是由DNA組成，並且可維持在簡單質體中，本發明的轉座子與本發明基因轉移系統的使用相較於高感染性的反轉錄病毒更為安全且更簡單操作。轉座酶活性提供形式可以是上述定義的DNA、mRNA或蛋白質。在另一實施例中，本發明也提供有效率的系統用於基因發現，例如基因組映像(genomemapping)，使用本發明的基因轉移系統，導入上述定義本發明的piggyBac轉座子至基因中。在一範例中，高活性PiggyBac轉座子結合piggyBac轉座酶蛋白質或編碼PiggyBac轉座酶蛋白質的核苷酸轉染至細胞中。在一些較佳實施例中，轉座子較佳包括位在至少兩重複之間的核苷酸序列，其中所述重複結合PiggyBac轉座酶蛋白質，以及其中所述轉座子插入有PiggyBac轉座酶蛋白質的細胞的DNA中。在一些較佳實施例中，核苷酸序列包含標示蛋白質，例如GFP與限制核酸內切酵素辨識位置。在插入之後，細胞DNA被分離且用限制核酸內切酵素消化。例如，如果核酸內切酵素辨識位置是6-鹼基辨識位置，以及限制核酸內切酵素是使用6-鹼基辨識序列，則所述細胞DNA被切為平均約4000-bp片段。這些片段可被轉職或是可加入連結子(linker)至被消化的(digested)片段端，提供PCR引子的互補序列。當加入連結子時，PCR反應使用來自連結子的引子以及轉座子中所述重用於放大片段。而後定序放大的片段，以及側接直接重複的DNA用於搜尋計算機資料庫，例如GenBank。使用基因轉移系統用於上述方法，例如基因發現與/或基因標定，通過使用轉座子作為插入突變劑，允許關於生長與發育的基因辨識、分離與定性，或是控制生長與發育的轉錄調節序列的辨識、分離與定性。在本發明的另一實施例中，本發明提供在細胞中動員(mobilizing)核苷酸序列的方法。根據此方法，所述高活性PiggyBac轉座子插入細胞的DNA中，如本申請所述。高活性PiggyBac蛋白質或編碼piggyBac轉座酶蛋白質的核苷酸被轉染至細胞中，以及所述蛋白質可動員(亦即移動)所述轉座子從細胞的DNA內第一位置至所述細胞DNA內的第二位置。細胞的DNA較佳是基因組DNA或是外染色體DNA。本發明的方法允許轉座子從基因組的一位置移動至基因組的另一位置，或是例如從細胞中的直體移動至所述細胞的基因組。在另一實施例中，本發明基因轉移系統也可作為RNA幹擾技術方法的一部分。RNA幹擾(RNAi)是與mRNA或細胞的基因/基因片段互補的外來、雙股RNA(dsRNA)導入細胞中，專一性結合至特定的mRNA與/或基因，因而破壞基因表現。已經證實這個技術在果蠅、秀麗隱杆線蟲(Caenorhabditiselegans)、植物中有效，以及最近也正在哺乳動物細胞培養中有效。為了使用這個技術結合本發明，本發明的轉座子較佳包含編碼小的幹擾RNA(SiRNA)的短hairpin表現匣(shorthairpinexpressioncassettes)，與細胞的mRNA與/或基因/基因片段互補。這些siRNA具有較佳長度為20至30核苷酸，更佳的長度為20至25核苷酸，以及最佳長度為21至23核苷酸。所述siRNA可針對任何mRNA與/或基因，編碼上述定義的任何蛋白質，例如致癌基因(oncogene)。使用哺乳動物piggyBac轉座子用於插入siRNA載體至宿主基因組中，在體外或體內提供長期表現siRNA，因而可長期消音(silencing)特定基因產物。誘導式分化多能的幹細胞(iPS)在一些較佳實施例中，本發明可包含再計劃的載體(!^programmingvector)，所述載體包含多作用子的(polycistronic)表現匣，所述表現匣包括轉錄調節因子、一或多個再計劃因子以及一或多個本申請所述的高活性PiggyBac轉座子。較佳地，編碼再計劃因子是Sox、Oct、Nanog,Klf4或c-Myc。通常，幹細胞是未分化的細胞，可以進行連續的成熟功能細胞。例如，血液前驅幹細胞可成為任何不同形式最終分化的血液細胞。胚胎幹(ES)細胞是來自於胚胎並且是分化多能的，因而具有發展成為任何器官或組織形式的能力，或是至少有潛力成為完整的胚胎。誘導式分化多能的幹細胞通常簡稱為iPS細胞或是IPSCs，是分化多能的幹細胞形式，是人工取得自非分化多能的細胞，通常是成人體細胞，插入一些基因。例如在表現一些幹細胞基因、蛋白質與染色質甲基化圖案、分裂時間、胚樣體形成、畸胎瘤形成、存活的嵌合體形成以及潛力與分化能力，誘導式分化多能的幹細胞被認為和例如胚胎幹細胞的自然分化多能幹細胞相同，但是整體內容與自然分化多能幹細胞的關係仍被評估。2006年首次從老鼠細胞產生iPS(Takahashietal.，2006，併入本申請作為參考)，以及2007年從人類細胞產生iPS細胞(Takahashietal.，2007，併入本申請作為參考)。在幹細胞研究中已經被引用成為重要的成就，使得研究人員能得到分化多能的幹細胞，這對於研究是重要的，並且潛在具有治療使用，而沒有胚胎使用的爭議問題。「再計劃(!^programming)」是指在培養或在體內，能使形成至少一種新細胞形式的能力增加的程序，所述能力增加是指相較於相同條件下沒有再計劃的結果。更特別地，再計劃是指使體細胞具有分化多能潛力的程序。這是指如果在再計劃之前沒有所述子代可實質形成，而在足夠的增生之後，具有新細胞型式表現型特徵的子代有可測量的比例；否則，具有新細胞型式特徵的比例測量上多於在再計劃之前。在一些條件下，在增加偏好的程度上，具有新細胞型式特徵的子代比例可至少約為1^^5^^25%或更多。胚胎幹(EQ細胞是得自於早期胚胎的分化多能幹細胞。ES細胞最先是在1981年建立，自1989年開始用於產生基因剔除鼠(knockoutmice)0在1998年，人類ES細胞建立，目前成為再生醫學應用。不同於ES細胞，組織幹細胞具有有限的分化潛力。組織幹細胞存在組織中特定位置，並且具有未分化的細胞內結構。因此，組織幹細胞的分活多能性較低。組織幹細胞具有較高的核/質比例，以及具有一些細胞內胞器。大部分的組織幹細胞具有低的分化多能性、長細胞周期以及分化能力超過個體生命。組織幹細胞依取得位置分類，例如皮膚系統、消化系統、骨髓系統、神經系統等。皮膚系統的組織幹細胞包含表皮幹細胞、毛囊幹細胞等。消化系統的組織幹細胞包含胰臟(共同)幹細胞、肝臟幹細胞等。骨髓系統的組織幹細胞包含血液前驅幹細胞、間葉幹細胞等。神經系統的幹細胞包含神經幹細胞、視網膜幹細胞等。「誘導式分化多能的幹細胞」通常簡稱為iPS細胞或iPSC，是指從非分化多能細胞人工取得的分化多能幹細胞型式，典型是從成人體細胞或最終分化的細胞，例如纖維母細胞、血液前驅細胞、單核細胞、神經、表皮細胞等，插入一些基因，稱為再計劃因子。iPS細胞的產生對於用於誘導的基因是很重要的。以下的因子或其結合可用於本發明中。在一些方面中，編碼Sox與Oct(較佳為0ct3/4)的核苷酸可包含在再計劃因子中。例如，再計劃因子可包括編碼Sox2、0ct4、Nanog與Lin-觀的表現匣，或是編碼Sox2、0ct4、Klf4與c-myc的表現匣。編碼這些再計劃因子核苷酸可包括在相同的表現匣、不同表現匣、相同再計劃載體或不同再計劃載體中。已經辨識0ct-3/4與一些Sox基因家族成員(Soxl，Sox2,Sox3與SoxM)成為參與誘導過程中的重要轉錄調節因子，若缺乏則無法誘導。然而，已經辨識包含一些Klf家族(KIfl，Klf2，Klf4，andKlf5)成員、Myc家族(C-myc,L-myc與N-myc),Nanog與LIN28的其它基因可增加誘導效率。0ct-3/4(PoU5fl)是八聚體(Oct)轉錄因子家族之一，並且對於維持分化多能性具有重要作用。在Oct-3/4+細胞例如胚葉細胞(blastomeres)與胚胎幹細胞中，缺乏Oct-3/4會造成自發性的滋胚層(trophoblast)分化，以及Oct-3/4的存在造成胚胎幹細胞的分化多能與分化潛力。「Oct」家族的許多其它基因包含Oct-3/4相關的Octl與0ct6，不能引發誘導，因而在誘導程序中呈現Oct-3/4排斥性。類似Oct-3/4，基因的Sox家族與維持分化多能性相關，雖然相較於0ct_3/4，也與多分化潛能與單分化潛能幹細胞相關，Oct-3/4隻表現在多分化潛能幹細胞中。雖然Sox2適用於誘導的初始基因(Yamanakaetal.(2007)，Jaenischetal.(1988)andYuetal.O007))，已經發現Sox家族的其它基因也在誘導程序中作用。Soxl產生iPS細胞的效率如同Sox2，以及基因Sox3、Sox15與Soxl8也產生iPS細胞，但效率較低。在胚胎幹細胞中，促進分化多能需要至少一Oct成員例如Oct-3/4與至少一Sox成員例如Sox2。雖然Yuetal.(2007)已經報到Nanog可能是產生iPS細胞的因子之一，以及Nanog促進再計劃效率與劑量相關，但Yamanakaetal.(2007)報導誘導不需要Nanog。Klf家族的Klf4最初是由Yamanaka等人辨識，以及由Jaenisch等人(1988)確認為產生老鼠iPS細胞的因子，並且由Yamanaka等人Q007)說明為產生人類iPS細胞的因子。然而，Thompson等人報導人類iPS細胞的產生不需要Klf4，以及Klf4無法產生人類iPS細胞。發現Klf2與Klf4可產生iPS細胞，以及相關基因Klfl與Klf5也可以產生iPS細胞，但效率較低。Myc家族基因是與癌症相關的前致癌基因。Yamanaka等人與Jaenisch等人(1988)說明c-myc是參與產生老鼠iPS細胞的因子，以及Yamanaka等人說明它是參與產生人類iPS細胞的因子。然而，Thomson等人與Yamanaka等人Q007)報導產生人類iPS細胞不需要c-myc。在誘導iPS細胞中使用「myc」家族困擾在於iPS細胞最終要做為臨床治療，而c-myc誘導的iPS細胞轉殖的老鼠有25%會發展致命的畸胎瘤。已經辨識N-myc與L-myc取代c-myc會誘導相似的效率。醫藥組合物本發明更提供醫藥組合物，包含piggyBac轉座酶作為蛋白質或是由核苷酸編碼，與/或高活性PiggyBac轉座子，或本申請所述的基因轉移系統，包括piggrBac轉座酶作為蛋白質或是由核苷酸編碼，結合高活性PiggyBac轉座子。所述醫藥組合物的提供可選擇性結合醫藥上可接受的載體、輔劑或或運送體。在本申請中，根據本發明，醫藥上可接受的載體、輔劑或運送體是指無毒性載體、輔劑或運送體，不會破壞配方成分的醫藥活性。本發明組合物使用的醫藥上可接受的載體、輔劑或運送體包含但不限於離子交換劑、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、血清蛋白，例如人類血清白蛋白、緩衝物質例如磷酸鹽、甘胺酸、山梨酸、己二烯酸鉀、飽和蔬菜脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、鹽或電解質、氯化鈉、鋅鹽、矽酸膠、三矽酸鎂、聚乙烯四氫咯酮、纖維素為基礎的物質、聚乙二醇、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸酯、蠟、聚乙烯-聚氧丙烯-塊聚合物、聚乙烯二醇以及羊毛脂。本發明的醫藥組合物可口服、非口服投與、吸入噴灑、局部、直腸、鼻腔、臉頰、陰道投與或是經由植入的儲存器。本申請所使用的非口服一詞包含皮下、血管內、肌肉內、關節內、滑液內、胸骨內、腦脊髓膜內、肝內、intralesional以及顱內注射或灌注技術。較佳地，所述醫藥組合物是口服、腹膜內或血管內投與。本發明醫藥組合物的無菌注射形式可為水溶液或油性懸浮液。可根據此技藝中已知的技術調配這些懸浮液，使用合適的分散或溼潤劑以及懸浮試劑。所述無菌可注射的製備也可為無菌可注射的溶液或無毒非口無可接受的稀釋劑或溶劑中的懸浮液，例如在1，3_丁二醇中的溶液。在這些可接受的運送體與溶劑中，可使用水、Ringer’s溶液以及等滲透壓的氯化鈉溶液。除此之外，習知使用無菌、定性油作為溶劑或懸浮媒介。為此目的，可使用任何溫和的定性油，包含合成的單或二甘油酯。例如十八烯酸與其甘油酯衍生物的脂肪酸可用於製備注射劑，可以是自然醫藥與液或懸浮液也可包含長鏈的醇類稀釋劑或分散劑，例如羧甲基纖維素或類似的分散劑，通常使用在醫藥可接受劑量形式的配方中，包含乳劑與懸浮液。為了配方的目的，也可使用其它通常使用的接口活性劑，例如Tweens、Spans與其它乳化劑或生物可用性的促進劑，通常使用在醫藥可接受的固體、液體或其它劑量形式的製造中。本發明醫藥可接受的組合物可用任何口服可接受的劑量形式口服投與，包含但不限於膠囊、錠劑、水溶液懸浮液或溶液。例如使用錠劑作為口服使用，通常使用的載體包含乳糖與玉米澱粉。典型添加例如硬脂酸鎂的潤滑劑。對於口服投與膠囊形式，有用的稀釋劑包含乳糖與乾燥的玉米澱粉。當需要水溶液懸浮液作為口服使用時，活性成分結合乳化與懸浮劑。若需要，也可增加一些增甜、氣味或顏色劑。或者，本發明醫藥可接受的組合物可以是栓劑形式用於直腸投與。可混合本發明的基因轉移系統或其成分與合適的非刺激賦形劑製備這些組合物，所述非刺激賦形劑在室溫為固體而在直腸溫度則為液體，因此會在直腸融化，釋放所述藥物。所述材料包含可可油、蜜蠟以及聚乙烯二醇。本發明醫藥可接受的組合物也可局部投與，特別是當處理目標包含可局部使用處理的區域或器官，包含眼疾、皮膚或較低腸道。合適的局部配方可製備用於這些區域或器官中。對於局部使用，所述醫藥可接受的組合物可調配在合適的藥膏中，包含本發明的基因轉移系統或其成分，懸浮或溶解在一或多載體中。本發明局部投予的成分載體包含但不限於礦物油、液體礦脂、白礦脂、聚乙烯二醇、聚氧乙烯、聚氧乙烯成分、乳化蠟與水。或者，所述醫藥可接受的組合物可調配在合適的乳液或霜中，包含所述活性成分懸浮或溶解在一或多醫藥可接受的載體中。合適的載體包含但不限於礦物油、去水山梨醇單硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、十六醇酯蠟、鯨臘醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇與水。對於眼部使用，所述醫藥可接受的組合物可調配成為在等滲透壓、pH調整無菌鹽水中的粒子化懸浮液或較佳為在等滲透壓、PH調整無菌鹽水中的溶液，具有或沒有例如苯扎氯銨的防腐劑。或者，對於眼部使用，所述醫藥可接受的組合物可調配在膏藥中，例如礦脂。本發明醫藥可接受的組合物也可鼻腔投與或吸入。根據醫藥配方技藝中已知的技術，製備此組合物，以及所述組合物可製備為鹽水中的溶液、使用苯甲醇或其它合適的防腐劑、吸收促進劑增進生物可用性、氟碳化物與/或其它習知的溶解或分散劑。依待處理的宿主與特定的投與形式，本發明成分的量可結合載體材料產生單劑量形式的組合物。必須注意對於任何特定病患，特定劑量與處理方法取決於不同因子，包含使用特定成分的活性、年齡、體重、一般健康、性別、飲食、投與時間、排洩率、藥物結合與治療醫師的評估以及待處理疾病的嚴重程度。組合物中本發明成分的量取決於組合物中的特定成分。所述醫藥組合物較佳適合治療疾病，由基因缺陷造成的特定疾病，例如囊性纖維變性、高膽固醇血症、血友病、免疫缺陷，包含HIV、亨汀頓氏舞蹈病、阿法-抗-胰蛋白酶缺陷、直腸癌、黑色素瘤、腎癌、淋巴癌、急性骨髓白血病(AML)、急性淋巴白血病(ALL)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴白血病(CLL)、腸胃道腫瘤、肺癌、神經膠瘤、甲狀腺癌、乳癌、前列腺癌、肝癌、病毒誘發的腫瘤例如乳突瘤病毒誘導的癌症(例如子宮頸癌)、腺病毒癌、皰疹病毒誘發的腫瘤(例如Burkitt淋巴癌、EBV誘發的B細胞淋巴癌)、B型肝炎誘發的腫瘤(肝細胞癌)、HTLV-1與HTLV-2誘發的淋巴癌、肺癌、咽癌、肛門直腸癌、神經膠母細胞瘤、淋巴癌、直腸癌、星狀細胞瘤、腦癌、胃癌、視網膜母細胞瘤、基底細胞癌、腦轉移、髓母細胞瘤、陰道癌、胰臟癌、睪丸癌、黑色素瘤、膀胱癌、霍奇綜合症、腦膜瘤、Schneeberger'sdisease、支氣管癌、腦下垂體癌、蕈狀肉芽腫、咽喉癌、乳癌、神經纖維瘤、眼瞼腫瘤、Burkitt淋巴癌、喉癌、胸腺瘤、子宮體癌、骨癌、非霍奇淋巴癌、尿道癌、CUP綜合症、寡樹突神經膠質瘤、外陰癌、腸癌、食道癌、小腸腫瘤、顱咽瘤、卵巢癌、肝癌、血癌或皮膚或眼睛的癌症。套組本發明特徵在於套組，包括PiggyBac轉座酶作為蛋白質或由核苷酸編碼，與/或高活性PiggyBac轉座子；或本申請所述的基因轉移系統，包括PiggyBac轉座酶作為蛋白質或由核苷酸編碼，結合高活性PiggyBac轉座子；視需要結合醫藥可接受的載體、賦形劑或運送體，以及視需要結合使用說明。本發明套組的任何成分可連續或平行投與以及/或轉染至細胞中，例如在投與且/或轉染本發明高活性轉座子之前、同時或之後，PiggyBac轉座酶蛋白質或其編碼核苷酸可被投與以及/或轉染至細胞中。或者，在轉染PiggyBac轉座酶蛋白質或其編碼核苷酸之前、同時或之後，所述高活性PiggyBac轉座子可轉染至細胞中。如果是平行轉染，較佳是兩種成分提供在不同的配方且/或在投與前直接彼此混合，避免在轉染前轉座。除此之外，可依時間模式投與且/或轉染套組的至少一成分，例如投與多次劑量的此成分。以下範例提供完整的揭露內容給熟知此技藝的人士，描述如何製造與使用本發明的分析、篩選以及治療方法，並且不限制本發明的範圍。範例範例1.辨識合併缺陷的ρiggyBac變異本申請的實驗使用產生紅螢光蛋白質的Cherry基因，描述篩選與辨識切割PiggyBac轉座子。把piggyBac轉座子放入所述基因中，將所述基因去活化，因而細胞不是紅色。然而，PiggyBac切割回復所述基因，造成產生紅色螢光蛋白質。因此，紅色群落顏色增加代表突變切割更佳。使用突變PCR，轉殖到酵母菌的表現載體中，完成許多突變轉座酶基因的收集。在洋菜盤上生長包含各個突變的群落，而後用紅色螢光檢視。圖4說明已經分離的切割高活性。在一些較佳實施例中，合併缺陷的PiggyBac包括野生型piggyBac序列中的胺基酸改變，相當於SEQIDNO:2。較佳地，所述胺基酸改變是R371A、R373A或R371A、R373A。在較佳實施例中，合併缺陷的piggyBac相當於SEQIDNO:64、SEQIDNO:65或SEQIDNO66的胺基酸序列。範例2.辨識高活性變異使用合併缺陷的piggyBac突變作為起始點，本申請的發明人已經辨識高活性piggyBac轉座子突變。酵母菌切割分析如MitraR.等人所述(piggyBaccanbypassDNAsynthesisduringcutandpastetransposition.EMBOJ.Apr9；27(7):1097-109.Epub2008Mar20)用於辨識高活性突變株。使用突變PCR與側接ORF引子作為表現建構，突變化PiggyBac0RF，而後共同轉型(co-transformation)PCR產物與有間隙的piggyBac質體至包含ura-至ura+匣的酵母菌分析株中回復轉型，其中轉座子切割造成ura+群落形成。在SC-Trp-His盤上回復轉型株之後，把群落懸浮在水中，點在缺少尿嘧啶的盤上，來辨識切割。在這些點測試中比較突變轉型株與野生型的ura+群落數目，辨識潛在的高活性變異株。而後純化每一個高活性候選株，並且再次定量分析切割。而後懸浮包含來自確認高活25性的PiggyBac基因的質體DNA，來辨識piggyBac基因突變以及造成的胺基酸改變。胺基酸改變與對應的核苷酸改變如表1所示，如下L15PCUG變成CCGD19N/F395LGAC變成MC/UUU變成CUUS31P/T164AUCA變成CCA/ACA變成GCAH33YCAC變成UACE44K/K334RGAA變成AAA/AAG變成AGGE45GGAA變成GGAC97R/T242IUGU變成CGU/ACU變成AUUS103PUCC變成CCCR189K/G120GAGA變成AAA/GGU變成GGCR189R/D450N/R526RAGA變成AGG/GAC變成AACM194TAUG變成ACGM194VAUG變成GUGS213S/V436IAGU變成AGCI221TAUA變成ACA在M6+之間的S373PUCA變成CCAN384TAAC變成ACCC453S/N571SUGU變成AGU/AAU變成AGUT560AACU變成GCUN571SAAU變成AAGS573AUCG變成GCGS584PUCU變成CCUM589VAUG變成GUGM589V/D170DATG變成GUG/GAC變成GAUS592GAGU變成GGUF594LUUC變成TTA停止/WLESCNTGA變成TGG停止595ELESCN/H33HTGA變成GGA/CAC變成CAU突變株C圖1中的表2顯示從野生型(正常化至1)胺基酸改變與折迭增加的一些高活性高活性突變可發生在轉座酶的任何位置，以及預期會發現許多更高活性的PiggyBac變異。這些變異可能是單個胺基酸改變或是多個胺基酸改變。可使用酵母菌分析作為篩選辨識變異。可使用整個基因的PCR突變以及目標突變，使用較小的PiggyBac片段或寡核苷酸的突變，針對已辨識具有高活性的突變區域。範例3.使用高活性轉座子的誘導型分化多能幹細胞在一些實施例中，可使用高活性piggyBac轉座子，產生使用最少基因組的誘導型分活多能幹細胞。特別地，使用0ct3/4、SoX2、Klf4與c-myc作為最小的基因組。Takahashietal.(Cell,131,861-872,November30，2007)全文併入本申請作為參考，教導使用0ct3/4、SoX2、Klf4與c-myc，從人類皮膚纖維母細胞產生誘導型分化多能幹細胞(iPS)的方法。其它範例由上述說明，顯然可對本申請所述的內容進行變化與修飾而因應不同的使用與條件。所述實施例仍落於本申請權利要求的範圍內。本申請可變因素的任何定義中組件表列包含所列示組件的單一組件或組合的定義。本申請實施例包含作為單一實施例或任何實施例的組合或任何部份的組合。本申請內容中所有專利與公開案皆併入本申請作為參考。權利要求1.一種轉座子，包括一或多高活性PiggyBac核苷酸序列以及保留轉座子活性的變異、衍生物與片段。2.如權利要求1所述的轉座子，其中相較於野生型PiggyBac轉座子，所述高活性PiggyBac轉座子具有較高程度的轉座切割。3.如權利要求1所述的轉座子，包括2、3、4、5或更多高活性piggyBac核苷酸序列以及保留轉座子活性的變異、衍生物與片段。4.如權利要求1所述的轉座子，其中所述高活性PiggyBac核苷酸序列是來自Noctuidae屬。5.如權利要求1所述的轉座子，其中所述高活性PiggyBac核苷酸序列是來自粉斑夜蛾物種。6.如權利要求1所述的轉座子，包括選自SEQIDN0:34-SEQIDNO:63或SEQIDNO:70SEQIDNO:96的核苷酸序列。7.如權利要求6所述的轉座子，其中所述核苷酸序列編碼選自SEQIDN0:3-SEQIDNO32的胺基酸序列。8.一種轉座子，包括一或多合併缺陷的piggyBac核苷酸序列以及其變異、衍生物與片段。9.如權利要求8所述的轉座子，其中相較於野生型piggyBac轉座子，所述合併缺陷的PiggyBac轉座子具有較低的合併率。10.如權利要求8所述的轉座子，其中所述合併缺陷的piggyBac核苷酸序列是來自Noctuidae屬。11.如權利要求8所述的轉座子，其中所述合併缺陷的piggyBac核苷酸序列是來自粉斑夜蛾物種。12.如權利要求8所述的轉座子，包括選自SEQIDN0:67-SEQIDNO:69的核苷酸序列。13.如權利要求12所述的轉座子，其中所述核苷酸序列編碼選自SEQIDNO:64_SEQIDNO66的胺基酸序列。14.如權利要求2或9所述的轉座子，其中所述野生型piggyBac轉座子包括相當於SEQIDNO1的核苷酸序列。15.如權利要求1或8所述的轉座子，其中所述轉座子可插入至細胞的DNA中。16.如權利要求1或8所述的轉座子，其中所述轉座子更包括標示蛋白質。17.如權利要求1或8所述的轉座子，其中所述轉座子插入質體中。18.如權利要求17所述的轉座子，其中所述轉座子更包括至少一部份的開放讀架。19.如權利要求17所述的轉座子，其中所述轉座子更包括至少一表現控制區域。20.如權利要求17所述的轉座子，其中所述表現控制區域是選自啟動子、促進子或消首子。21.如權利要求17所述的轉座子，其中所述轉座子更包括啟動子操作連結到至少一部份的開放讀架。22.如權利要求15所述的轉座子，其中所述細胞是來自於動物。23.如權利要求22所述的轉座子，其中所述細胞是來自於脊椎動物或無脊椎動物。24.如權利要求17所述的轉座子，其中所述脊椎動物是哺乳動物。25.—種基因轉移系統，包括；根據權利要求1或權利要求8的轉座子；以及PiggyBac轉座酶。26.如權利要求25所述的基因轉移系統，其中所述PiggyBac轉座酶是來自NoctuidaejMο27.如權利要求沈所述的基因轉移系統，其中所述piggyBac轉座酶是來自粉斑夜蛾物種。28.如權利要求27所述的基因轉移系統，其中所述piggyBac轉座酶包括相當於SEQIDNO33的胺基酸序列。29.如權利要求25所述的基因轉移系統，其中所述piggyBac轉座酶是哺乳動物piggyBac轉座Bi。30.如權利要求25所述的基因轉移系統，其中所述轉座子插入所述細胞的基因組中。31.如權利要求30所述的基因轉移系統，其中所述細胞是來自動物。32.如權利要求30所述的基因轉移系統，其中所述細胞是來自脊椎動物或無脊椎動物。33.如權利要求32所述的基因轉移系統，其中所述脊椎動物是哺乳動物。34.一種包括權利要求1的所述轉座子的細胞。35.一種包括權利要求8的所述轉座子的細胞。36.一種醫藥組合物，包括包括高活性piggyBac核苷酸序列的轉座子與piggyBac轉座酶，連同醫藥可接受的載體、賦形劑或運送體。37.一種用於導入外來DNA至細胞中的方法，包括使所述細胞接觸權利要求25所述的基因轉移系統，因而導入外來DNA至細胞中。38.如權利要求37所述的方法，其中所述細胞是幹細胞。39.一種套組，包括包括高活性核苷酸序列的轉座子以及用於導入DNA至細胞中的說明。40.如權利要求39所述的套組，其中所述高活性piggyBac核苷酸序列是來自Noctuidae屬。41.如權利要求39所述的套組，其中所述高活性piggyBac核苷酸序列是來自粉斑夜蛾物種。42.如權利要求39所述的套組，包括選自SEQIDNO:34_SEQIDNO:63或SEQIDNO:70-SEQIDNO:96的核苷酸序列。43.一種套組，包括包括合併缺陷的piggyBac核苷酸序列的轉座子以及使用說明。44.如權利要求43所述的套組，包括選自SEQIDNO:67_SEQIDNO:69的核苷酸序列。全文摘要本發明提供高活性piggyBac轉座子，特別是來自粉斑夜蛾的高活性piggyBac轉座子，它的轉座頻率比野生型高。本發明特徵也在於合併缺陷的piggyBac轉座子。可在基因轉移系統中使用piggyBac轉座子與轉座酶，用於穩定導入核苷酸至細胞的DNA中。所述基因轉移系統可用於方法例如但不限於基因治療、插入突變或基因發現。文檔編號A61K48/00GK102421902SQ201080017915公開日2012年4月18日申請日期2010年2月25日優先權日2009年2月25日發明者N·L·克雷格申請人:約翰·霍普金斯大學