氣相色譜串聯質譜/質譜法同時測定豆芽中6種植物生長調節劑殘留的方法與流程

2023-09-10 06:23:00 2

本發明涉及一種豆芽中6種植物生長調節劑殘留的測定方法，尤其是涉及一種通過氣相色譜串聯質譜/質譜法對豆芽中6種植物生長調節劑進行定量檢測的方法。
背景技術：
：近年來，隨著「毒豆芽」事件的屢次曝光，引起了人民對豆芽質量安全的高度重視。所謂「毒豆芽」，是指在豆芽生產過程中非法添加對人體有害的工業原料、激素、農藥、獸藥、抗生素等，從而改變豆芽生產周期和外觀，增加豆芽產量，最後流入市場銷售的豆芽，因其添加的很多物質都對人體有害，故稱為毒豆芽。植物生長調節劑是人工合成的對植物的生長發育有調節作用的化學物質和從生物中提取的天然植物激素。根據其作用可分為：植物生長抑制劑，植物生長促進劑，植物生長延緩劑。在生產上常用的有3種類型植物生長促進劑生長素類，分別是：吲哚衍生物，如吲哚乙酸(IAA)，吲哚丁酸(IBA)；氯代苯的衍生物，如2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)，2,4-D丁酯；萘乙酸類，如萘乙酸(NAA)；防落素，如4-氯苯氧乙酸(4-CPA)。它們的生理作用與內源激素相似，可以促進植物葉片的擴大生長，維管束的分化、根的形成。不法商販在生產豆芽時通過添加豆芽激素，使豆芽長得粗壯長，無毛根，從而來迎合群眾的選購意願。而人類食用後可以通過新陳代謝將其降解，正常使用情況下合理地使用植物生長調節劑，將它在豆芽中的殘留量控制在一定範圍內，是不會對人體造成危害的。但是不合理的過量植物生長調節劑被人體吸收後，長期食用會對人體產生蓄積危害。GB2760-2014規定經表面處理的新鮮蔬菜中2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的的最大使用量0.01g/kg，最高殘留限量≤2.0mg/kg。國家食品藥品監督管理總局發布的食藥監食監三便函[2014]73號文件提供了一種氣相色譜質譜聯用法(GC-MS)，檢測豆芽中4-氯苯氧乙酸(4-CPA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸(IAA)、2,4-D-丁酯、吲哚丁酸(IBA)6種植物生長調節劑，並且要求測定低限(LOQ)為0.03mg/kg。美國規定了果蔬類蔬菜中2,4-D的殘留限量為0.1mg/kg。實驗過程中發現豆芽基質幹擾較大，尤其是吲哚乙酸(IAA)和吲哚丁酸(IBA)，回收率低，GC-MS法無法準確定量。因此迫切需要建立一個準確、可靠的氣相色譜-串聯質譜/質譜(GC-MS/MS)測定方法。國內外關於豆芽中相關藥物殘留的檢測方法報導較少。目前，植物生長調節劑的檢測方法主要有氣相色譜法(GC)，氣相色譜-質譜法(GC-MS)，氣相色譜串聯質譜/質譜法(GC-MS/MS)，高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜串聯質譜/質譜法(LC-MS/MS)。常宇文報導了一種利用凝膠滲透色譜-氣相色譜法測定豆芽中2,4-二氯苯氧乙酸殘留量的方法。石金娥採用GC-MS法檢測了豆芽中4-氯苯氧乙酸、萘乙酸、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、2,4-D-乙酯、2,4-D-丁酯、吲哚乙酸、吲哚丁酸7種植物生長調節劑的殘留量。吳平谷利用氣相色譜質譜(GC-MS)法測定了豆芽中2,4-D-乙酯、2,4-D-丁酯、4-氯苯氧乙酸、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、β-萘乙酸、吲哚乙酸、吲哚丁酸、多效唑、激動素、6-苄基腺嘌呤10種植物生長調節劑的殘留量。李殷利用氣相色譜串聯質譜法測定了豆芽中4-氯苯氧乙酸和2,4-二氯苯氧乙酸2種植物生長調節劑的殘留量。柴勇利用高效液相色譜法測定了豆芽中赤黴素、激動素、6-苄氨基嘌呤、2,4-二氯苯氧乙酸4種激素的殘留量，方法的測定低限＜0.5mg/kg。劉春生利用超高效液相色譜-串聯三重四極杆質譜(UPLC-MS/MS)法檢測了豆芽中咪鮮胺、頭孢氨苄、諾氟沙星、6-苄氨基嘌呤、赤黴酸、2，4-二氯苯氧乙酸、4-氯苯氧乙酸7種藥物的殘留量。劉印平利用氣相色譜質譜(GC-MS)法測定了豆芽中4-氯苯氧乙酸、吲哚乙酸、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、2,4-二氯苯氧乙酸丁酯、吲哚丁酸、β-萘乙酸6種植物生長調節劑的殘留量。技術實現要素：為了解決現有豆芽中植物生長調節劑殘留檢測的難題，本發明的目的是提供一種氣相色譜串聯質譜/質譜法測定豆芽中4-氯苯氧乙酸(4-CPA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸(IAA)、2,4-D-丁酯、吲哚丁酸(IBA)殘留量的方法，該方法準確、快速、高效，測定低限均為15μg/kg，回收率和精密度均符合殘留分析要求，並且完全滿足國內外有關法規對豆芽中植物生長調節劑殘留的要求，可為進出口豆芽植物生長調節劑殘留的監管提供技術支持。為了實現上述目的，本發明採用了以下的技術方案：氣相色譜串聯質譜/質譜法同時測定豆芽中6種植物生長調節劑殘留的方法，6種植物生長調節劑為4-氯苯氧乙酸、2,4-二氯苯氧乙酸、萘乙酸、吲哚乙酸、2,4-D-丁酯和吲哚丁酸，該方法包括以下步驟：1)樣品處理：①樣品提取分別稱取兩份豆芽試樣各10.0g(精確至0.01g)於兩個50mL離心管中(一份用於測定4-氯苯氧乙酸(4-CPA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)，另一份用於測定2,4-二氯苯氧乙酸丁酯)，分別加入40μL加酸，再加入20mL乙腈，3.0g氯化鈉，渦旋混勻，4000rpm離心5min後，取10mL上層乙腈，用旋轉蒸發儀濃縮至近幹，分別都用甲醇復溶。②衍生向第一份復溶液加入1mL三氟化硼甲醇衍生溶液，渦旋混勻，40℃加熱衍生10min，取出冷卻後待淨化用；③淨化將衍生液和2,4-二氯苯氧乙酸丁酯的復溶液合併後轉移至離心管中，加入2.0mL乙酸乙酯-正己烷混合溶液和2.0mL純水，渦旋混勻，4000rpm離心機離心5min，取出上層有機相，向下層水相再加入2.0mL乙酸乙酯-正己烷混合溶液重複萃取一遍，合併兩次萃取液，40℃水浴下氮吹至1.0mL以下，再用乙酸乙酯-正己烷混合溶液定容至1.0mL，過膜後轉移至進樣瓶中供GC-MS/MS分析測定。2)測定：採用氣相色譜串聯質譜/質譜法，其中：液相色譜條件為：a)色譜柱為HP-5MS，30m×0.25mm×0.25μm；b)進樣口溫度：220℃；c)程序升溫：80℃保溫1.0min，10℃/min升溫至230℃，保溫4min，30℃/min升溫至320℃保溫3min；d)載氣：氦氣，純度≥99.999％，流速：1.0mL/min；e)進樣方式：不分流進樣；f)進樣量：2μL；質譜條件為：a)電離模式：電子轟擊源(EI)；b)電離能量：70eV；c)離子源溫度：230℃；d)接口溫度：280℃；e)離子檢測模式：多反應監測模式(MRM)；所述的多反應監測條件如下：其中，帶「*」的為定量離子，其餘為定性離子；(3)標準曲線的製作純溶劑標準溶液：移取0.25mL4-氯苯氧乙酸、2,4-D、萘乙酸、吲哚乙酸、吲哚丁酸的混合工作溶液於10mL玻璃離心管中，再加入1.0mL三氟化硼甲醇溶液，渦旋混勻，40℃加熱衍生10min，取出冷卻後加入0.25mL2,4-D-丁酯工作溶液，然後按照步驟③進行淨化，製備成含量為50ng/mL、75ng/mL、150ng/mL、300ng/mL、500ng/mL的標準溶液；基質匹配標準溶液：準確吸取適量空白樣品基質，氮吹乾，分別加入等量的混合標準工作液，混勻後，配成系列基質匹配的標準工作溶液，現配現用；(4)空白試驗不加試樣，在步驟1)和步驟2)相同實驗條件下進行試驗；(5)結果計算和表述按公式以下公式計算試樣中各個植物生長調節劑含量：式中：X—試樣中各個植物生長調節劑的含量，單位為微克每千克；C—由標準工作曲線得到樣液中各個植物生長調節劑的濃度，單位為納克每毫升；V—樣液最終定容體積，單位為毫升；m—最終樣液所代表的試樣質量，單位為克。本發明的測定方法採用氣相色譜串聯質譜/質譜法同時測定豆芽中6種植物生長調節劑，方法簡便、快速、準確、可靠，測定低限、回收率和精密度均符合要求。本發明的測定方法具有以下技術效果：1)首次開發了氣相色譜串聯質譜/質譜法同時測定豆芽中6種植物生長調節劑殘留的方法，填補了技術空白；2)提供了氣相色譜串聯質譜/質譜法同時測定豆芽中6種植物生長調節劑殘留的最優條件。附圖說明圖1為空白豆芽樣品的選擇性離子流圖。圖2為4-氯苯氧乙酸(4-CPA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸(IAA)、2,4-D-丁酯、吲哚丁酸(IBA)混合標準溶液的選擇性離子流圖。圖3為空白豆芽樣品添加4-氯苯氧乙酸(4-CPA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸(IAA)、2,4-D-丁酯、吲哚丁酸(IBA)混合標準溶液(15μg/kg)的選擇性離子流圖。具體實施方式為進一步說明本發明，結合以下實施例具體說明1試劑和材料1.1正己烷：色譜純。1.2甲醇：色譜純。1.3甲酸：色譜純。1.4三氟化硼甲醇溶液：優級純。1.5乙腈：色譜純1.6乙酸乙酯：色譜純1.7氯化鈉：分析純1.850mL聚丙烯具塞塑料離心管、10mL聚丙烯具塞塑料離心管、250mL具塞錐形瓶、100mL濃縮瓶、10mL玻璃離心管等器皿、一次性無菌注射器，0.22μm過濾膜，1.0mL、2.0mL、5.0mL帶刻度玻璃移液管等。1.9乙酸乙酯-正己烷混合液：吸取體積為2mL的乙酸乙酯和8mL的正己烷配成體積比為1:4的乙酸乙酯-正己烷混合液。1.2.10標準品：信息見表1表1標準品信息化合物英文名CAS號4-氯苯氧乙酸4-Chlorophenoxyaceticacid122-88-32,4-二氯苯氧乙酸2,4-Dichlorophenoxyaceticacid94-75-7萘乙酸1-Naphthaleneaceticacid86-87-3吲哚乙酸Indole-3-aceticacid87-51-42,4-二氯苯氧乙酸丁酯Butyl2,4-dichlorophenoxyacetate94-80-4吲哚丁酸3-Indolebutyricacid133-32-41.2.11標準溶液及試劑配製植物生長調節劑(6種)儲備液1.0mg/mL：分別稱取0.01g(精確至0.1mg)上述植物生長調節劑標準品，用甲醇分別溶解定容至10mL，4℃保存。分別準確量取適量的4-氯苯氧乙酸(4-CPA)、2,4-二氯苯氧乙酸、萘乙酸、吲哚乙酸、吲哚丁酸5種標準儲備液，混合，用甲醇稀釋配製成100.0μg/mL和10.0μg/mL的5種混合標準溶液，2,4-D-丁酯標準溶液按照此法單獨配製成100.0μg/mL和10.0μg/mL標準溶液，4℃保存。標準工作溶液：準確吸取一定量的5種混合標準溶液，用甲醇稀釋至200ng/mL、300ng/mL、600ng/mL、1200ng/mL、2000ng/mL的標準工作溶液，2,4-D-丁酯標準溶液按照此法單獨配製成200ng/mL、300ng/mL、600ng/mL、1200ng/mL、2000ng/mL，4℃保存。2、儀器和設備2.1Agilent7890A/5975C氣相色譜-串聯質譜聯用儀，配有電子轟擊離子源(EI)2.2色譜柱：AgilentHP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)2.3MS2MiniShaker渦旋混合儀；2.4離心機：飛鴿牌TDL80-2B，不低於4000rpm2.5分析天平；金諾牌TD3102。2.6分析天平；MettlerAE260。2.7BuchiR215旋轉蒸發儀；2.8氮吹儀3、測定步驟3.1樣品前處理3.1.1樣品提取分別稱取兩份豆芽試樣各10.0g(精確至0.01g)於兩個50mL離心管中(一份用於測定4-氯苯氧乙酸(4-CPA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)，另一份用於測定2,4-二氯苯氧乙酸丁酯)，分別加入40μL加酸，再加入20mL乙腈，3.0g氯化鈉，渦旋混勻，4000rpm離心5min後，取10mL上層乙腈，用旋轉蒸發儀濃縮至近幹，分別都用甲醇復溶。3.1.2衍生向第一份復溶液加入1mL三氟化硼甲醇衍生溶液，渦旋混勻，40℃加熱衍生10min，取出冷卻後待淨化用；3.1.3淨化將衍生液和2,4-D-丁酯的復溶液合併後轉移至離心管中，加入2.0mL乙酸乙酯-正己烷混合溶液和2.0mL純水，渦旋混勻，4000rpm離心機離心5min，取出上層有機相，向下層水相再加入2.0mL乙酸乙酯-正己烷混合溶液重複萃取一遍，合併兩次萃取液，40℃水浴下氮吹至1.0mL以下，再用乙酸乙酯-正己烷混合溶液定容至1.0mL，過膜後轉移至進樣瓶中供GC-MS/MS分析測定。3.2測定3.2.1氣相相色譜串聯質譜/質譜條件由於測試條件取決於所使用的儀器，因此不可能給出色譜分析的普遍參數。採用下列操作條件已被證明對測試是合適的。(1)氣相色譜條件A)色譜柱：HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)；B)進樣口溫度：220℃；C)程序升溫：80℃(1.0min)10℃/min230℃(4min)30℃/min320℃(3min)；D)載氣：氦氣，純度≥99.999％，流速1.0mL/min；E)進樣方式：不分流進樣；F)進樣量：2μL。(2)質譜條件A)電離模式：電子轟擊源(EI)，能量為70eV；B)離子源溫度：230℃；C)接口溫度：280℃；D)離子檢測模式：多反應監測模式(MRM)；E)碰撞氣：高純氮氣；F)監測離子對及碰撞能量見表2表2多反應監測條件其中，帶「*」的為定量離子，其餘為定性離子。3.2.2標準工作曲線的製作純溶劑標準溶液：移取0.25mL4-氯苯氧乙酸、2,4-D、萘乙酸、吲哚乙酸、吲哚丁酸的混合工作溶液於10mL玻璃離心管中，再加入1.0mL三氟化硼甲醇溶液，渦旋混勻，40℃加熱衍生10min，取出冷卻後加入0.25mL2,4-D-丁酯工作溶液，然後按照3.1.3步驟進行淨化，製備成含量為50ng/mL、75ng/mL、150ng/mL、300ng/mL、500ng/mL的標準溶液。(相當於樣品中添加10.0、15.0、30.0、60.0、100.0μg/kg6種植物生長調節劑混合標準溶液)基質匹配標準溶液：準確吸取適量空白樣品基質，氮吹乾，分別加入等量的混合標準工作液，混勻後，配成系列基質匹配的標準工作溶液，現配現用。3.2.3空白試驗除不加試樣外，均按上述步驟進行。4、結果計算和表述按公式(1)計算試樣中各個植物生長調節劑含量：式中：X—試樣中各個植物生長調節劑的含量，單位為微克每千克；C—由標準工作曲線得到樣液中各個植物生長調節劑的濃度，單位為納克每毫升；V—樣液最終定容體積，單位為毫升；m—最終樣液所代表的試樣質量，單位為克。5、方法測定低限本發明方法對於豆芽中4-氯苯氧乙酸、2,4-D、萘乙酸、吲哚乙酸、2,4-D-丁酯、吲哚丁酸等6種植物生長調節劑的測定低限均為15μg/kg。6、方法的回收率和精密度本方法回收率實驗設定了三個添加濃度，按本方法所確定的實驗條件，對每個添加濃度進行6次實驗，回收率及精密度結果見表3。表3豆芽中6種植物生長調節劑同時測定方法的添加回收實驗7、結論綜合上述情況，本發明方法的回收率、測定低限和精密度等各項技術指標均符合要求，方法應用於豆芽中6種植物生長調節劑同時檢測，重現性良好。本發明建立的檢驗方法操作簡便、結果準確。當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp