一種骨肽組合物及其製備方法
2023-09-10 00:43:15 2
專利名稱：一種骨肽組合物及其製備方法
技術領域：
本發明涉及骨肽的製劑，具體涉及骨肽組合物及其製備方法。
背景技術：
骨肽注射液(Ossotide Injection)為複方製劑,其主要成分為有機|丐、磷、無機鈣、無機鹽、微量元素、胺基酸等。骨肽注射液有利於骨折修復。也可用於治療增生性骨關節疾病及風溼、類風溼關節炎等。
骨肽有鹽水、酸水、鹼水提取及酶解法去除相關雜質，如
鹽水熱壓提取、過濾，去脂、離心、醇沉、過柱CN200510076912. 8公開了一種製備骨肽注射劑的方法，將哺乳動物骨用鹽水熱壓煮提，離心過濾，合併煮提液，低溫放置1-40 小時，去除表層脂肪，溫熱後離心過濾，真空濃縮後加入乙醇，靜置沉澱，吸出上層醇液，定容回收乙醇，得水提液，將水提液加等體積蒸餾水，一次通過弱酸性陽離子樹脂柱、弱鹼性陰離子樹脂柱、珠狀殼聚糖柱和殼聚糖改性活性炭柱，去雜純化，得純淨稀藥液。此方法中先醇沉後過柱除雜，得到的藥液中可能含有樹脂的降解物等汙染物，且多種樹脂柱的使用造成大量酸性胺基酸或鹼性胺基酸的損失。
酸水提取CN201110094765. 2公開一種注射用骨肽的製備工藝，其用哺乳動物四肢骨，除去剩肉，粉碎，水洗後用酸水熱壓2-3次，冷卻，分層，然後水層用無水乙醇沉澱，過濾，用酸調PH為1. 0-2. O,過濾,去除沉澱；濾液用鹼調PH值為7. 8-8. 8,過濾,去除沉澱,濾液調PH值近中性，過濾，去除沉澱，然後經超濾膜超濾，截留分子量為3000-10000道爾頓， 得到骨肽溶液。酸水解法會使色氨酸全部被破壞，絲氨酸和酪氨酸部分被破壞，並產生二次汙染。另外，該專利先醇沉，後酸沉鹼沉，由酸沉和鹼沉產生的雜質不能很好的去除。
鹼溶液提取CN200610150890.X使用鹼性提取、酸性提取的方法提取骨肽，取健康新鮮冷凍的哺乳動物的四肢骨，清洗，壓碎，將其置夾層鍋中，加入5%氫氧化鈉溶液 300C 55°C水解12 48小時，取上清液，調pH值酸沉，加熱，冷卻靜置後過濾。鹼水解法使含羥基和巰基的胺基酸，全部被破壞且產生消旋，因此增加了新的雜質。
酶解C N200610033055. 8公開了一種製備方法，取新鮮的動物四肢骨，清洗、消毒、粉碎、加入蒸餾水，在恆溫反應罐內以蛋白酶控制水解。
而多數工藝包含提取、去脂、濃縮、醇沉、調酸、調鹼、超濾膜過濾，類似上述方法的相關文獻很多，具體如下
熱壓提取、冷卻、去脂，濃縮，醇沉、調酸、調鹼CN200610017008. 4公開了一種骨肽注射液製備工藝，該發明將豬四肢骨提取、去脂、濃縮，然後沉澱、濃縮，再進行酸性沉澱、 鹼性沉澱，將加熱後的液體冷至室溫後置於冷庫中，取出除去酸性蛋白，進行過濾及超濾得到骨肽原液，再加水調解、過濾、灌封、滅菌即得骨肽注射液。醇沉可以去除由酸性沉澱及鹼性沉澱產生的雜質，該專利先醇沉，後酸沉鹼沉，未能達到除雜的效果。
熱壓提取、冷藏、去脂、調酸、離心、超濾CN200510051475.4公開了骨肽提取液的製備方法，取哺乳動物四肢骨，加水熱壓提取3次，熱壓溫度為115-121°C，時間為1-2小時，壓力為O. 15-0. 2Mpa ;合併提取液，冷藏12-48小時，除去上層浮脂，上清液調pH值 2. (Γ3. 0，放置12-24小時，濾過，濾液加熱65-80°C，時間為15-20分鐘，冷卻後離心，離心條件為3000-4000轉/分，離心時間為15-30分鐘，過濾，得清液，清液用截留分子量10000以下的超濾膜超濾1-2次，超濾得到骨肽提取物。該發明中僅去除鹼性蛋白，未除酸性蛋白。
熱壓提取、去脂、調酸、醇沉、調中性、調鹼CN200710099629. 6提供了一種骨肽注射劑的製備方法，該製備方法包括以下步驟將豬或牛的四肢骨，洗淨、打碎，加入1-4倍重量的純化水，105-120°C高壓提取至少2次，每次1-3小時，合併提取液，過濾，冷藏，除去上層油脂，調PH值1. 0-4. O,煮沸，冷藏；過濾，取上清液，減壓濃縮，加入乙醇，使其含醇量達到60-80%，靜置，過濾，回收乙醇至無醇味，用注射用水稀釋，調節pH值6. 0-8. O,過濾，滅菌，冷凍，緩化後室溫放置，過濾，調pH值6. 8-7. 2，脫色，調pH值6. 8-7. 2，滅菌，冷凍至結冰，取出緩化，用注射用水將緩化後的藥液稀釋，調節PH值6. 8-7. 5，精濾，得到骨肽注射液。該發明先醇沉，後去除酸性蛋白，且調節PH至弱鹼性，不能有效去除酸性蛋白及其雜質。
加壓提取、調酸、調鹼、超濾膜過濾CN200410013508.1公開了一種注射用骨肽的製備工藝，其中骨肽的製備方法為取哺乳動物的骨，加壓提取Γ2次，合併提取液，調酸性 pH值為2. 0-5. O,去沉澱，調鹼性pH值8. 0-9. 5，去沉澱，調中性pH值，將所述的沉澱澄清， 用超濾膜超濾，截留分子量為300(Γ10000道爾頓，製得骨肽提取液。該專利未進行醇沉，由酸性沉澱及鹼性沉澱產生的大量的雜質不能得到有效去除。
熱壓提取、去脂、醇沉、鹼沉、醇沉CN200810148842. 6公開了一種骨肽提取物的製備方法將豬四肢骨破碎後加水熱壓提取，提取液濃縮，得濃縮液，先後進行酸沉、鹼沉、醇沉，冷藏放置，分子量為10000道爾頓超濾。該專利中大量的濃縮步驟，導致活性物質失活。
而上述方法中，骨肽化合物含量較低，雜質去除不完全，上市產品偶有發熱、皮疹等過敏反應。
發明人對其提取技術進行了進一步的改進，得到了本發明。發明內容
本發明的目的是提供一種骨肽組合物。
本發明提供了一種骨肽組合物，該組合物中含有以下重量份的成分骨肽化合物 20-45重量份,胺基酸12-26重量份,核酸0_9重量份,遊尚脂肪酸0-0. 01重量份，聞分子量物質不超過2份。
優選地，所述骨肽組合物中含有以下重量份的成分骨肽化合物26-45重量份，胺基酸17-26重量份,核酸0-5. 2重量份,游離脂肪酸 0-0. 004重量份,高分子量物質不超過 I份。
進一步優選，所述骨肽組合物中含有以下重量份的成分骨肽化合物40-45重量份，胺基酸22-26重量份,核酸0-1. 23重量份,遊尚脂肪酸0-0. 003重量份，聞分子量物質不超過O. 62份。
上述組合物中
所述的重量份可以是μ g、mg、g、kg等醫藥領域公知的重量單位，也可以是上述單位的倍數，如100倍、10倍、1/100倍、1/10倍。
所述骨肽化合物是由膠原蛋白在適當高溫高壓條件下，充分水解形成較小分子量的多肽，分子量約為1000-10000道爾頓；
所述胺基酸包括門冬氨酸、穀氨酸、絲氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和賴氨酸。
所述核酸是由核苷酸聚合而成的生物大分子化合物；
所述游離脂肪酸為中性脂肪被酵素分解的產物；
所述高分子量物質為分子量高於11000道爾頓的物質。
本發明還提供了一種製備上述骨肽組合物的方法，該方法包括以下步驟
I)哺乳動物四肢骨經破碎清洗，加入四肢骨重量2倍量水，保溫熱壓提取2次，溫度為105-120°C，壓力為O. 1-0. 12Mpa，每次提取1-3小時，濾過，0_7°C冷藏12-36小時；
2)除去上層油脂，濾液用鹽酸溶液調節pH值至1. 8-3. 0，煮沸30_60分鐘，0_7°C 冷藏12-36小時；濾取上清液，氫氧化鈉溶液調節pH值至8. 5-11. O，煮沸30-60分鐘，0-7 V 冷藏12-36小時；
3 )濾取上清液，減壓濃縮至2. 5-3. Og/ml，加入95%乙醇使含醇體積量達到 60-80%,靜置12小時，經濾紙與O. 45 μ m微孔濾膜過濾，濾液加入藥液體積O. 5-1. 0%的藥用炭，30-45°C保溫吸附15-30分鐘，經濾紙與O. 45 μ m微孔濾膜過濾，回收乙醇至無醇味；
4)用注射用水稀配至1-1. 5g/ml，調pH值6. 0-7. 2，經O. 22 μ m濾膜濾過，經10000 超濾膜超濾，超濾液濃縮，濃縮液經O. 22 μ m濾膜濾過，經5000-8000超濾膜超濾，即得骨肽組合物。
優選的，上述組合物的製備方法包括以下步驟
I)豬或牛四肢骨經 破碎清洗，加入四肢骨重量2倍量的水，保溫熱壓提取2次，溫度為110-120°C，壓力為O. 11-0. 12Mpa，每次提取1-3小時，濾過，0_5°C冷藏18-36小時；
2)除去上層油脂，濾液用鹽酸溶液調節pH值至2. 0-3. 0，煮沸30_60分鐘，0_5°C 冷藏18-36小時；濾取上清液，40%氫氧化鈉溶液調節pH值至9. 0-11. O,煮沸30-60分鐘， 0-5°C冷藏18-36小時；
3 )濾取上清液，減壓濃縮至2. 7-3. Og/ml，加入95%乙醇使含醇體積量達到 70-80%,靜置12小時，經濾紙與O. 45 μ m微孔濾膜過濾，濾液加入藥液體積O. 5-1. 0%的藥用炭，40-45°C保溫吸附15-30分鐘，經濾紙與O. 45 μ m微孔濾膜過濾，回收乙醇至無醇味；
4)用注射用水稀配至1. 2-1. 5g/ml，調pH值6. 8-7. 2，經0.22 μ m濾膜濾過，經 10000超濾膜超濾；超濾液濃縮至2. 5g/ml，濃縮液經O. 22 μ m濾膜濾過，經5000-8000超濾膜超濾，即得組合物。
進一步優選，上述組合物的製備方法包括以下步驟
I)豬或牛四肢骨經破碎清洗，加入四肢骨重量2倍量的水，保溫熱壓提取2次，溫度為115-120°C，壓力為O. 11-0. 12Mpa，每次提取1_3小時，濾過，0_4°C冷藏18-36小時；
2)除去上層油脂，濾液用鹽酸溶液調節pH值至2. 3-3. 0，煮沸40_60分鐘，0_4°C 冷藏18-36小時；濾取上清液，40%氫氧化鈉溶液調節pH值至10. 2-11. 0，煮沸40-60分鐘，0-4°C冷藏18-36小時；
3 )濾取上清液，減壓濃縮至2. 7-3. Og/ml，加入95%乙醇使含醇體積量達到70-75%，靜置12小時，經濾紙與O. 45 μ m微孔濾膜過濾，濾液加入藥液體積O. 8-1. 0%的藥用炭，40-45°C保溫吸附20-30分鐘，經濾紙與O. 45 μ m微孔濾膜過濾，回收乙醇至無醇味；
4)用注射用水稀配至1. 2-1. 5g/ml，調pH值7. 0-7. 2，經0.22 μ m濾膜濾過，經 10000超濾膜超濾；超濾液濃縮至2. 5g/ml，濃縮液經O. 22 μ m濾膜濾過，經6000-8000超濾膜超濾，即得組合物。
上述方法中
所述水為純化水、礦物質水或注射用水，優選為注射用水。
所述稀配或濃縮g/ml均是以每ml液體中含的四肢骨的重量計算。
本發明還提供了上述骨肽組合物特徵圖譜的測定方法，該方法包括以下內容 使用十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑，以O. 1%三氟醋酸水溶液為流動相A，以體積比為 400:100:0. 5的水-乙腈-三氟醋酸為流動相B，柱溫37°C，檢測波長為257nm，線性梯度洗脫。
具體的，所述特徵圖譜的測定方法，該方法包括以下步驟
I)色譜條件與系統適用性試驗用十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑(如 ACQUITYUPLC HSST3, 2.1mmX 50mm,1. 8 μ m);以O. 1%三氟醋酸水溶液為流動相A,以水-乙腈-三氟醋酸(400:100:0. 5)為流動相B ;柱溫37°C ;流速為每分鐘O. 3ml ;檢測波長為 257nm ;按表I進行線性梯度洗脫，採樣速率為每秒5點；理論板數按黃嘌呤峰計算不低於 5000 ；
表I梯度洗脫表
權利要求
1.一種骨肽組合物，其特徵在於，該組合物中含有以下重量份的成分骨肽化合物 20-45重量份,胺基酸12-26重量份,核酸0_9重量份,遊尚脂肪酸0-0. 01重量份，聞分子量物質不超過2份。
2.根據權利要求1所述的組合物，其特徵在於，該組合物中含有以下重量份的成分骨肽化合物26-45重量份，胺基酸17-26重量份，核酸0-5. 2重量份，游離脂肪酸0-0. 004重量份，高分子量物質不超過I份。
3.根據權利要求1所述的組合物，其特徵在於，該組合物中含有以下重量份的成分骨肽化合物40-45重量份，胺基酸22-26重量份，核酸0-1. 23重量份，游離脂肪酸0-0. 003重量份，高分子量物質不超過O. 62份。
4.根據權利要求1-3任一項所述的組合物，其特徵在於，所述骨肽化合物是由膠原蛋白在適當高溫高壓條件下，充分水解形成較小分子量的多肽，分子量約為1000-10000道爾頓。
5.根據權利要求1-3任一項所述的組合物，其特徵在於，所述胺基酸包括門冬氨酸、穀氨酸、絲氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和賴氨酸。
6.一種製備權利要求1-5任一項所述的組合物的方法,其特徵在於,該方法包括以下步驟1)哺乳動物四肢骨經破碎清洗，加入四肢骨重量2倍量水，保溫熱壓提取2次，溫度為 105-120°C，壓力為O. 1-0. 12Mpa，每次提取1_3小時，濾過，0_7°C冷藏12-36小時；2)除去上層油脂，濾液用鹽酸溶液調節pH值至1.8-3. O,煮沸30-60分鐘，0_7°C冷藏 12-36小時；濾取上清液，氫氧化鈉溶液調節pH值至8. 5-11. 0，煮沸30-60分鐘，0_7°C冷藏 12-36小時；3)濾取上清液，減壓濃縮至2.5-3. Og/ml，加入95%乙醇使含醇體積量達到60_80%， 靜置12小時，經濾紙與O. 45 μ m微孔濾膜過濾，濾液加入藥液體積O. 5-1. 0%的藥用炭， 30-45°C保溫吸附15-30分鐘，經濾紙與O. 45 μ m微孔濾膜過濾，回收乙醇至無醇味；4)用注射用水稀配至1-1.5g/ml，調pH值6. 0-7. 2，經O. 22 μ m濾膜濾過，經10000超濾膜超濾，超濾液濃縮，濃縮液經O. 22 μ m濾膜濾過，經5000-8000超濾膜超濾，即得骨肽組合物。
7.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於，該方法包括以下步驟O豬或牛四肢骨經破碎清洗，加入四肢骨重量2倍量水，保溫熱壓提取2次，溫度為 110-120°C，壓力為O. 11-0. 12Mpa，每次提取1-3小時，濾過，0_5°C冷藏18-36小時；2)除去上層油脂，濾液用鹽酸溶液調節pH值至2.0-3. 0，煮沸30-60分鐘，0_5°C冷藏 18-36小時；濾取上清液，40%氫氧化鈉溶液調節pH值至9. 0-11. O,煮沸30-60分鐘，0_5°C 冷藏18-36小時；3)濾取上清液，減壓濃縮至2.7-3. Og/ml，加入95%乙醇使含醇體積量達到70_80%， 靜置12小時，經濾紙與O. 45 μ m微孔濾膜過濾，濾液加入藥液體積O. 5-1. 0%的藥用炭， 40-45°C保溫吸附15-30分鐘，經濾紙與O. 45 μ m微孔濾膜過濾，回收乙醇至無醇味；4)用注射用水稀配至1.2-1. 5g/ml，調pH值6. 8-7. 2，經O. 22 μ m濾膜濾過，經10000 超濾膜超濾；超濾液濃縮至2. 5g/ml，濃縮液經O. 22 μ m濾膜濾過，經5000-8000超濾膜超濾，即得組合物；優選地，該方法包括以下步驟1)豬或牛四肢骨經破碎清洗，加入四肢骨重量2倍量的水，保溫熱壓提取2次，溫度為 115-120°C，壓力為O. 11-0. 12Mpa，每次提取1_3小時，濾過，0_4°C冷藏18-36小時；2)除去上層油脂，濾液用鹽酸溶液調節pH值至2.3-3. 0，煮沸40-60分鐘，0_4°C冷藏 18-36小時；濾取上清液，40%氫氧化鈉溶液調節pH值至10. 2-11. 0，煮沸40-60分鐘，0_4°C 冷藏18-36小時；3)濾取上清液，減壓濃縮至2.7-3. Og/ml，加入95%乙醇使含醇體積量達到70_75%， 靜置12小時，經濾紙與O. 45 μ m微孔濾膜過濾，濾液加入藥液體積O. 8-1. 0%的藥用炭， 40-45°C保溫吸附20-30分鐘，經濾紙與O. 45 μ m微孔濾膜過濾，回收乙醇至無醇味；4)用注射用水稀配至1.2-1. 5g/ml，調pH值7. 0-7. 2，經O. 22 μ m濾膜濾過，經10000 超濾膜超濾；超濾液濃縮至2. 5g/ml，濃縮液經O. 22 μ m濾膜濾過，經6000-8000超濾膜超濾，即得組合物。
8.權利要求1-5任一項所述的組合物特徵圖譜的測定方法，其特徵在於，該方法中的條件為使用十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑，以O. 1%三氟醋酸水溶液為流動相A，以體積比為400:100:0. 5的水-乙腈-三氟醋酸為流動相B，柱溫37°C，檢測波長為257nm，線性梯度洗脫。
9.權利要求1-5任一項所述的組合物中黃嘌呤的檢測方法，其特徵在於，該方法中的條件為使用十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑，以O. 1%三氟醋酸水溶液為流動相A，以體積比為400:100:0. 5的水-乙腈-三氟醋酸為流動相B，柱溫37°C，檢測波長為257nm，線性梯度洗脫。
10.含權利要求1-5任一項所述的組合物的製劑，其特徵在於，所述製劑由骨肽組合物和藥學上可接受的載體組成，所述製劑優選為注射液或凍乾粉針。
11.權利要求1-5任一項所述的組合物或權利要求10所述的製劑在製備治療骨關節疾病的藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種骨肽組合物及其製備方法，該組合物中含有以下重量份的成分骨肽化合物20-45重量份，胺基酸12-26重量份，核酸0-9重量份，游離脂肪酸0-0.01重量份，高分子量物質不超過2份。試驗證實，本發明的骨肽組合物具有明顯的抗炎活性及明顯的促進骨折癒合作用，且效果優於現有技術。
文檔編號A61K9/08GK103041366SQ201210571589
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月25日 優先權日2012年12月25日
發明者方同華 申請人:黑龍江珍寶島藥業股份有限公司