一個水稻基因在培育溫敏不育系中的應用的製作方法

2023-09-09 14:53:50

專利名稱：一個水稻基因在培育溫敏不育系中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一個水稻基因的應用，具體涉及一個水稻基因在培育溫敏不育系中的應用。
背景技術：
隨著世界人口的不斷增長以及工業的發展，人們對糧食的需求量日益增加，水稻作為主要的糧食作物之一，普遍受到人們的歡迎。據報導，世界上近一半人口，包括幾乎整個東亞和東南亞的人口，都以稻米為食。同樣，水稻作為我國主要糧食作物之一，是我國人民最受歡迎的日常食物。隨著人口的增長和耕地面積的減少，提高水稻產量成為解決我國糧食問題的重要途徑。
現代生物技術是培育高產水稻的重要手段之一，中國的雜交水稻為糧食增產作出了重要貢獻。目前，中國雜交水稻年種植面積佔水稻種植總面積的5 I %，產量約佔水稻總產的6 O %,中國亞種間雜交稻一般比品種間雜交稻具有2 O %以上的增產潛力。利用水稻亞種間雜交優勢是現階段戰略重點，二系法雜交水稻是突破亞種間水稻雜交困難的重要方法。
水稻光、溫敏兩系不育資源的發現和在雜交水稻上的廣泛應用，為利用兩系法選育超級雜交水稻打開了新的局面。由於光溫敏兩系不育系受隱性核基因控制，與三系不育系相比，兩系不育系具有自我繁殖，配組範圍廣，基因資源豐富等特點。因此，利用兩系不育系選育超級雜交稻成為我國雜交水稻育種的主攻方向和發展趨勢。
根據光周期和溫度對育性的影響，兩系不育系分為光敏型、溫敏型和光溫敏互作型等三個主要類型。農墾58S及其衍生的粳稻不育系屬於典型的光敏型核不育系，在長日照條件下表現為不育，短日照條件下又可以恢復育性。而安農S-1、Y58S、株IS等則屬於典型的溫敏性不育系，即在高溫不育，低溫可育。另外，還有一些不育系既受光照影響同時也受到溫度的調控，這類不育系稱為光溫互作型，如培矮64S等。
株IS和陸 18S是在生產實踐中廣泛應用的兩系不育系，屬於典型的溫敏型不育系。株IS和陸18S是從遺傳距離較遠的不同生態型水稻雜交組合F2群體中發現的不育株， 經「自然環境和人工環境雙重壓力選擇法」選育的新低不育起點溫度核不育系。由於淘汰了低世代變異群體中不育起點溫度高和短期低溫引起的育性波動不育類型，株IS和陸18S 不育起點溫度低，不育性穩定。其中，株IS的育性轉育溫度在22. 6°C左右，陸18S在23°C 左右；並且對連續6天日平均23°C的低溫不敏感，是國內不育起點溫度低，不育性穩定的優良兩系不育系。在實際生產中，株IS和陸18S生殖生長期耐低溫能力強，大面積制種安全可靠，繁殖產量高，解決了低不育起點溫敏不育系的繁殖難題。株IS和陸18S綜合農藝性狀好，抗性強，米質較優，分別於1999、2000年通過湖南省品種鑑定。目前，株IS已成為培育兩系不育系的重要不育基因資源，利用株IS已轉育成湘陵628S、潭農S等6個新不育系。 株IS和陸18S配合力強，親和譜廣，已育成48個組合通過審定，其中國審早稻組合10個， 省審早稻組合34個，分別佔同期長江流域國審和省審兩系早稻組合的62. 5%和44. 2%。株IS和陸18S所配組合亞種間優勢明顯，其中株兩優819比對照增產10%，被農業部認定為首個早熟超級雜交早稻，並作為南方稻區區試對照和農業主導品種。陸兩優819比對照增產 8. 08%，也被農業部認定為超級雜交早稻。截止到2010年，株IS及陸18S所配品種在我國的累計種植面積超過9100萬畝，利用兩系培育超級水稻的重要不育資源。但是目前的優良的不育性比較少，為了加快水稻育種的步伐，特別是為了加快兩系水稻育種，迫切需要新的溫敏不育性，但是，常規的溫敏不育系一般由天然突變造成，育種家從天然突變體中篩選得到，這種獲得溫敏不育系的方法需要很大的運氣，而且溫敏不育系的種類比較少，遠遠不能滿足現代水稻育種的需要。
本發明提供提供了一種利用基因工程獲得溫敏不育系的方法，對於加快我國雜交水稻的新品種的選育、提高水稻產量、解決我國糧食問題具有重要的意義。發明內容
本發明的目的是提供一個水稻基因在培育溫敏不育系中的應用。
本發明所提供的基因，來源於水稻(Oryza sativa L.)，名稱為L0C_0s02gl2290， 是如下(a)的蛋白質Ca)由序列表中序列I所示的胺基酸序列組成的蛋白質；其中，序列表中的序列I由303個胺基酸殘基組成。
所述L0C_0s02gl2290的編碼基因，具體可為如下I)或2)的基因1)其核苷酸序列是序列表中的序列2；2)在嚴格條件下與I)限定的DNA序列雜交且編碼L0C_0s02gl2290蛋白的DNA分子。
所述嚴格條件可為在O.1XSSPE (或O. 1XSSC)，0. 1% SDS的溶液中，在65°C下雜交，並用該溶液洗膜。
序列表中的序列2由909個脫氧核糖核苷酸組成，是L0C_0s02gl2290的⑶S基因序列。
一種轉化載體，所述載體是包括編碼上述水稻L0C_0s02gl2290蛋白的基因全部或部分序列的重組基因沉默或RNAi表達載體，優選為如圖1所示的 pCAMBIA2300-Actinl-ocs-XF003。
一種細菌菌株，所述菌株含有編碼上述水稻L0C_0s02gl2290蛋白基因序列的重組表達載體。
一種水稻的轉化細胞、組織或器官，在所述水稻的轉化細胞、組織或器官中，L0C_ 0s02gl2290基因的表達水平下降。
下面結合附圖及實施例對本發明做進一步說明。


圖1為L0C_0s02gl2290恢復株IS的育性。
圖 2 為 pCAMBIA2300-Actinl-ocs-XF003 圖譜。
圖3為.RNAi敲除L0C_0s02gl2290使日本晴不育。
具體實施方式
實施例1、株IS溫敏不育基因的圖位克隆首先，我們將株is與93-11進行雜交，獲得F1種子。F1種植以後自交，得到F2群體。 在 7500株F2群體中，我們一共鑑定出1872株不育單株。通過SSR引物進行連鎖分析， 我們將控制株IS育性的基因初步定位在標記RM7575與RM5897之間。進一步加密標記，最終將控制株IS育性的基因定位在標記RMZ-17與RMZ-1l之間。對這兩個標記之間的基因組片段進行測序，結果發現L0C_0s02gl2290的編碼區出現了一個單鹼基突變，該突變造成了一個終止密碼子，使翻譯提前終止。這證明L0C_0s02gl2290為造成株IS溫敏不育系的主要候選基因。
實施例2、L0C_0s02gl2290基因組片段恢復株IS的育性我們利用酶切的方法從BAC上克隆了包含L0C_0s02gl2290的基因組DNA片段，並將其構建進PCAMBIA2300的雙元表達載體。通過農桿菌介導的方法，我們將L0C_0s02gl2290的基因組片段導入株IS的基因組中。在高溫條件下，株IS完全不育，沒有花粉產生；而轉基因互補植株能夠恢復株IS的育性，並且能夠很好地結實。這證明L0C_0s02gl2290是控制株IS溫敏不育的育性基因。如圖1所示。
實施例3、植物表達載體的構建從水稻花序中提取總RNA，反轉錄作為模板，以ATCggatccTCGAGATTGGTCAGGAGCAC和 TGCgtcgacTCTCAAACAGATGGGTGTGC為弓丨物進行PCR反應，PCR產物回收以後，經BamH I和 Sal I酶切。
體系如下10XNEB buffer 4 4. O uL BamH IO. 5 uLSal IO. 5 uLPCR 產物10. O uL用H2O補充到 40. O uL 37°C 反應 Ih。
同時用相同的酶來酶切載體pUCCRNAi。酶切完成後，對酶切產物進行回收，進行連接。
室溫放置lh，然後用熱激法轉化大腸桿菌DH5a，塗氨苄青黴素抗性培養基，在 37°C培養，直到有菌斑長出。用PCR的方法鑑定陽性菌斑，PCR引物如前所示，可以擴增出 360bp的特異性條帶。然後再用Bgl II和Xho I分別對前一步回收的360bp PCR產物和新鑑定出陽性克隆進行酶切。酶切完成後，對酶切產物進行回收，進行連接。室溫放置lh，然後用熱激法轉化大腸桿菌DH5a，塗氨苄青黴素抗性培養基，在37°C培養，直到有菌斑長出。 在對新長出的菌斑重新搖菌，提取質粒(按分子克隆進行標準操作)，然後用Pst I對質粒進行酶切驗證。
對酶切產物進行電 泳，並回收正確大小的酶切片段，同時用Pst I酶切帶Actinl 啟動子的PCAMBIA2300。電泳並回收正確的DNA片段，再用T4 DNA連接酶進行連接。室溫放置lh，然後用熱激法轉化大腸桿菌DH5a，塗卡那黴素抗性培養基，在37°C培養，直到有菌斑長出。對新長出的菌斑重新搖菌，提取質粒(按分子克隆進行標準操作)，然後對質粒進行 Pst I酶切驗證。對酶切產物進行電泳，鑑定正確的陽性克隆，得 到植物表達載體，如圖2所/Jn ο
實施例4、新溫敏不育系的獲得將實施例3構建好的RNAi表達載體，利用電擊法轉化農桿菌菌株AGLl，並塗布在卡那黴素和利福平抗性的培養基上，進行培養，獲得農桿菌菌株。經轉基因獲得RNAi植株，從表型看和野生型的日本晴沒有什麼區別，尤其是在營養生長期。到生殖生長期，野生型日本晴能夠正常開花，花粉經1% I2/KI染色正常，表明花粉的育性正常。而RNAi轉基因植株的花粉經1% Ι2/ΚΙ染色，絕大部分花粉不能被染色，花粉呈典敗狀態，僅有少數花粉能夠被染色。到野生型日本晴灌漿成熟的時候，RNAi轉基因植株仍然不能結實，表明RNAi轉基因植株不育。如圖3所不。SEQUENCE LISTING湖南亞華種業科學研究院中國科學院遺傳與發育生物學研究所〈120〉一個水稻基因在培育溫敏不育系中的應用〈130〉I〈160〉3PatentIn version 3. 5〈210〉I〈211〉302〈212〉PRTOryza sativa〈220〉〈221〉 PEPTIDE 〈222〉 (I).· (302)〈400〉 IThr Thr Ala 15Thr Val Glu 30Thr Cys ValCys Pro GlnMet Ala Asn Ser Gly Lys Ser Ser Pro Ala Ala Thr Ser I510Pro Pro Pro Gly Arg Pro Lys Ala Lys Ala Pro Pro Leu 2025Gly Tyr Pro Va l Glu Gly lie Ser lie Gly Gly Gln Glu 354045lie Phe Pro Thr Leu Ser Ala Ala Phe Asp lie Gly Arg
權利要求
1.一個水稻基因在培育溫敏不育系中的應用，其特徵在於所述水稻基因其胺基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
2.根據權利要求1所述，一個水稻基因在培育溫敏不育系中的應用，其特徵在於所述水稻基因的DNA序列在嚴謹條件下與所述序列SEQ ID NO: 2雜交且編碼所述序列I的DNA分子。
3.根據權利要求1或2所述的一種轉化載體，其特徵在於所述載體是包括編碼序列I蛋白的基因全部或部分序列的重組基因沉默或RNAi表達載體。
4.根據權利要求4所述的轉化載體，其特徵在於所述載體優選為pCAMBIA2300-Actinl-ocs-XF003。
5.根據權利要求1或2所述的一種細菌菌株，其特徵在於所述菌株是包括編碼序列I蛋白的基因全部或部分序列的重組基因沉默或RNAi表達載體的細菌菌株。
6.根據權利要求1或2所述的一種水稻的轉化細胞、組織或器官，其特徵在於所述水稻的轉化細胞、組織或器官中，編碼序列I的基因的表達水平低於野生型水稻中該基因的表達水平。
全文摘要
本發明涉及一個水稻基因在培育溫敏不育系中的應用。本發明人通過構建LOC_Os02g12290基因的RNA或基因沉默表達載體，轉化水稻，獲得LOC_Os02g12290基因表達水平下降的突變體，所述突變體表現溫敏不育。這一方法對於加快我國雜交水稻的新品種的選育、提高水稻產量、解決我國糧食問題具有重要的意義。
文檔編號C12N15/63GK103030685SQ20111029731
公開日2013年4月10日 申請日期2011年9月30日 優先權日2011年9月30日
發明者曹曉風, 楊遠柱, 周明, 胡小淳 申請人:中國科學院遺傳與發育生物學研究所, 湖南亞華種業科學研究院