Line－1逆轉錄酶的調節的製作方法

2023-09-10 06:51:50

專利名稱：：Line－1逆轉錄酶的調節的製作方法
技術領域：
：本發明涉及癌症治療領域。特別是，靶分子已經被確認為在端粒酶陰性癌細胞中調節端粒的延長。更特別的是，涉及幹擾人L1(Line-1)逆轉錄轉座子編碼的逆轉錄酶(L1RT)用於治療或預防L1RT誘導的癌症的多種抑制劑化合物的用途。本發明也涉及用於鑑定對治療L1RT介導的增殖疾病有用的藥物活性化合物的篩選方法。
背景技術：
：DNA的前導鏈和後隨鏈合成的不對稱造成了線性基因組複製的「終結問題」8。為了克服這個問題，真核染色體具有特化的末端結構，即由TTAGGG重複組成的端粒9。端粒酶是延長端粒並因此在細胞倍增期間的大多數癌症細胞中保持染色體穩定性的核糖核蛋白酶。在細胞倍增期間DNA從端粒末端的逐漸損失與體細胞中細胞增殖潛能的控制有關10。正常培養的人類細胞在培養物中具有有限的複製潛能。培養中的正常細胞進行複製直到它們達到群體生長停止的離散點。這被稱為M1期，並且由於少數端粒縮短到導致稱為細胞老化的生長停滯的大小而引起。這個階段在體外能夠通過消除p53和pRB人腫瘤抑制基因的功能而被繞過。之後該細胞能增殖直到端粒已經變得相當短，而導致M2或轉折期。生長停滯在M2階段是由細胞增殖和細胞死亡速率之間的平衡引起的。在這個階段，當多數端粒是非常短的時候，末端到末端的融合和染色體斷裂-融合引起顯著的染色體異常和凋亡。在很少情況下，細胞能夠脫離M2並通過穩定其端粒的長度而變為無限增殖。這通過端粒酶活化或替代端粒延長機制(ALT)而發生。人類生殖系細胞2和多數癌症細胞3表達端粒酶。端粒酶是延長端粒並因此在細胞倍增期間保持多數癌細胞的染色體穩定性的核糖核蛋白酶。實際上，端粒酶對已縮短的端粒的延長是人癌細胞中端粒維持的主要機制。端粒酶的抑制通過降低端粒的長度而限制人端粒酶陽性癌細胞11的生長，這些化合物降低了這些癌細胞增殖的能力。逆轉錄酶抑制劑先前已經被用於治療癌症。在體外試驗中，用逆轉錄酶抑制劑處理的腫瘤細胞在14天後經歷凋亡。通過端粒酶延長已縮短的端粒是在人癌細胞中維持端粒的眾所周知的機制。但是多達30％的不同類型的人腫瘤不表達端粒酶。在多達30％的不同類型的人腫瘤、腫瘤來源的細胞系和在體外無限增殖的人細胞系中，都報導有ALT的存在4，5，12，13，且在腫瘤和無限增殖細胞系的某些亞型中多達50％也報導有ALT存在。當前，目標為選擇性治療來自端粒酶陽性細胞的癌症的策略涉及通過反義策略、顯性失活突變體或藥理藥物來調節TERT的功能或端粒的長度(見，Bisoffi等，EurJCancer，1998，341242-1249；Roth等，Leukemia，2003，172410-2417；Damm等，EMBOJ.，2001，206958-6968；美國專利6,294,332、6,194,206、6,156,763和6,046,307)。如果在這些細胞中負責端粒延長的靶分子是已知的，則端粒酶陰性癌細胞的選擇性調節(即選擇性抑制或促進)也可能是可行的。因此，需要在端粒酶陰性細胞中確定負責延長端粒的靶分子，以及鑑定選擇性幹擾已確定靶分子的試劑，以使得不表達端粒酶的人腫瘤類型也能夠被預防或治療。發明概述現已發現L1(LINE-1)逆轉錄轉座子逆轉錄酶核酸的產物與某些癌細胞中端粒的延長有關，並因此與其維持有關。特別是，已經發現幹擾由L1逆轉錄轉座子編碼的逆轉錄酶的表達抑制癌細胞中端粒的延長。更特別的，已經發現在端粒酶陰性細胞中幹擾L1逆轉錄酶的表達導致例如端粒縮短、細胞周期停滯和凋亡或細胞死亡的表型表現。相信逆轉錄酶可能通過端粒DNA合成的「滑移」機制和/或端粒末端靶向的L1轉座子的逆轉錄轉座而涉及端粒維持。更特別的，已經發現用逆轉錄酶抑制劑3』-疊氮-2』，3』-雙脫氧胸苷(AZT)對端粒酶陰性細胞(ALT細胞)的處理，或用反義策略對L1逆轉錄酶(L1RT)的抑制，誘導進行性的端粒丟失、G2期停滯、染色體異常和最終的細胞死亡。因此，在本發明的一個實施方案中，提供一種治療特徵在於L1RT表達和/或端粒酶表達缺失的腫瘤的方法。幹擾L1RT的表達或活性會直接導致細胞死亡，或增強化療藥物最終通過凋亡殺死細胞的效果。特別是，本發明提供一種通過施用L1RT的抑制劑和拮抗劑來抑制具有持續增加細胞數量能力的L1RT表達細胞增殖的方法。例如，通過獲得具有可操作地連接於啟動子的cDNA序列的DNA分子，以使其以反義方向表達，其中該cDNA具有L1RT的全部或部分序列，並且用該DNA分子轉染具有不可控制的增殖潛力的L1RT細胞，能夠抑制或下調L1RT的表達。該抑制劑或拮抗劑任選地與藥物學上可接受的載體一起給藥。在本發明的另一個實施方案中，提供一種在需要這種預防的個體(例如人)中預防癌症的方法。該癌症是由於人體中存在顯示由該人細胞中L-1(LINE-1)逆轉錄轉座子編碼的逆轉錄酶誘導或介導的替代端粒延長的細胞而引起的。細胞中端粒的延長誘導人體中這種細胞的持續增殖潛能。該預防方法包括對人施用治療有效量的組合物。該組合物具有所述逆轉錄酶的抑制劑或拮抗劑。該抑制劑或拮抗劑阻斷端粒酶陰性細胞中端粒的延長，因此抑制L1RT表達細胞的增殖。優選該抑制劑是一個或多個核苷類似物，或這種類似物的藥物學上可接受的鹽。用抑制劑或拮抗劑強化液體或固體的食材。食品可以是例如黃油、人造黃油、餅乾、麵包、蛋糕、蜜餞、糖果、酸奶酪或其他發酵牛奶產品、或適於人類消費的穀類食品形式的功能性食物。或者可以是營養補充物、營養物、藥品、食品、營養品、健康食品和/或特製食品。周期性地測試人體中ALT細胞的存在。一旦不再檢測到ALT細胞，即可以停止使用抑制劑或拮抗劑。在本發明的另一個實施方案中，提供一種篩選候選藥物或化合物用來選擇能夠降低腫瘤細胞積聚速率的藥物的方法，其中通過與候選藥物一起培養或處理表達L1RT的細胞，並監測該候選藥物可能對細胞具有的一個或多個所需要的生物學效果。如果候選藥物引起了所需要的生物學效果，則選擇該藥物。在這種篩選中特別優選的生物學效果包括漸進性的端粒損失、G2期停滯、染色體異常或癌細胞死亡。生物學效果也可包括用不同癌基因例如ras轉化的端粒酶陰性細胞的增殖的抑制。本發明進一步提供用於檢測病理性增殖的表達L1RT的細胞的方法和試劑盒。這些和其他本發明的實施方案將會在下文更為詳細地描述。附圖簡述圖1是端粒特異性探針對來自ALT和端粒酶陽性細胞系的胞內總RNA的斑點印跡。1，U-2OS.2，Saos-2.3，沒有RNA.4，HEC-1.5，HeLa。圖2說明用AZT處理ALT細胞系14天後顯示端粒長度縮短、大規模凋亡和細胞周期變化的流式細胞術數據。(a)Saos-2；(b)U-2OS細胞中，處於細胞周期的G2期的端粒特異性螢光。(c)Saos-2；(d)U-2OS細胞中細胞周期的分布22。未處理的細胞-灰色，處理過的細胞-黑色。圖3說明顯示用AZT處理不同時間的U-2OS細胞中，DNA合成速率、細胞周期分布和端粒長度改變的流式細胞分析數據。a、b、c、d未處理和分別處理10、17和40天。細胞周期分布24-左邊。BdU摻入(FITC)和PI24染色-中間。PNA-FITC和PI染色-右邊。數字分別指出G1和G2期以任意單位22測得的端粒特異性螢光。圖4說明顯示更昔洛韋處理14天後端粒長度縮短、大規模凋亡、和細胞周期改變的PNA-FITC和PI染色的流式細胞術數據。(a)未處理的U-2OS細胞；(b)更昔洛韋處理的U-2OS細胞。圖5顯示L1逆轉錄酶反義靶向策略的圖示說明。圖6說明顯示用L1靶向的反義構建體轉染40天的U-2OS細胞中細胞周期分布和端粒長度變化的流式細胞分析數據，(a)未處理；(b)有義構建體；(c)反義構建體。發明詳述本發明公開了LINE-1(LI)逆轉錄轉座子編碼的逆轉錄酶(L1RT)與某些人癌細胞中端粒的延長有關。具體地，本發明公開了L1RT與包括端粒酶陰性腫瘤的某些腫瘤組織和該腫瘤來源的細胞系中端粒的延長有關，並且確定L1RT酶或其編碼序列為用於控制該腫瘤細胞增殖特性或誘導這些細胞凋亡的靶標。端粒酶陰性的腫瘤和該腫瘤來源的細胞系不表達端粒酶，或具有內源端粒酶，但仍然顯示端粒延長，在此也稱為替代端粒延長(ALT)。細胞中L1RT介導的端粒延長的特徵在於相對於端粒酶介導的端粒延長出現長且異質性的端粒。本領域的技術人員已知如何通過例如TRF檢測(見Bryan等，1997，NatureMedicine，31271-1274)來確定細胞中存在ALT特有的長且異質性的端粒。由L1逆轉錄轉座子的ORF2編碼的L1逆轉錄酶已經表徵，且其核酸和蛋白序列是本領域已知的(GeneBankGI5070620；Ostertag等，2000，DeterminationofL1retrotranspositionkineticsinculturedcells，NucleicAcidsRes.28，1418-1423；Kimberland等，1999，Full-lengthhumanL1insertionsretainthecapacityforhighfrequencyretrotranspositioninculturedcells，Hum.Mol.Genet.8(8)，1557-1560)。在本發明中，已經發現在端粒酶陰性細胞中L1RT向染色體添加端粒DNA重複片段。因此，在本發明的一個方面，提供預防或治療由於動物中存在不恰當或病理性增殖的細胞或無限增殖的細胞所引起的病症的方法。這些不恰當或病理性增殖的細胞存在，並且獨立於細胞正常的調控機制而複製。這些細胞是病理性的，因為它們由於細胞元件，即L1RT的活性而不同於正常細胞。當然，這裡所使用的不恰當增殖的細胞有可能是良性的高度增殖細胞，但是除非另作說明，否則這些細胞是指惡性的高度增殖細胞，如例如成骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、腎上腺皮質癌或黑素瘤特有的癌細胞。特別是提供了預防或治療以表達L1RT為特徵的人腫瘤的方法。根據本發明，病症的預防和治療是通過使用L1RT的抑制劑或拮抗劑而獲得的。用於本發明的抑制劑或拮抗劑直接或間接與L1RT相互作用從而抑制其表達(或活性)，和/或被整合到端粒中並因此阻止端粒進一步延長，儘管L1RT是功能性的，因此抑制了表達L1RT細胞的生長。因此，L1RT的抑制劑或拮抗劑用於抑制細胞的生長。例如，當向患者施用L1RT的抑制劑或拮抗劑時，這引起進行性的端粒縮短、細胞中細胞周期停滯、和/或表達L1RT細胞的大規模凋亡。在本發明中，術語「抑制生長」或「生長的抑制」也可以指減少或阻止細胞分裂。在本發明中表達L1RT的細胞的生長抑制可以是大約100％或小於100％，但不是0％。例如，與對照細胞相比較，抑制可以是大約10％至大約100％，優選至少約25％，更優選至少約50％，再更優選至少大約90％、95％或正好100％(對照細胞表達L1RT但是不用抑制劑或拮抗劑處理)。生長的抑制能夠用本領域已知的任何方法來測量。例如，可以將被處理樣品中的活細胞數與對照樣品中的活細胞數相比較，與活性染料一起孵育後進行測定。而且，生長抑制可通過能夠檢測體外或體內細胞增殖的減少的測定方法來測量，例如含氚氫摻入測定、BdU摻入測定、MTT分析、形成病灶的能力的改變、貼壁依賴或喪失無限增殖能力、喪失腫瘤特異性標記、和/或當被注射進動物宿主體內時沒有形成或抑制腫瘤的能力(Dorafshar等，2003，JSurgRes.，114179-186；Yang等，2004，ActaPharmacolSin.，2568-75)。人體中從單個或幾個這種無限增殖的細胞發展為癌性腫瘤可能要幾個月至幾年。但是通過實施本發明，癌症能夠被預防，因為用L1RT處理的致瘤的ALT細胞在有機會生長為腫瘤之前，就喪失了其增殖能力。而且，在有癌症的臨床表現之前，對危險人群定期預防性施用L1RT的抑制劑或拮抗劑以停止腫瘤的發展可明顯降低新發癌症病例的速度。本發明使用的L1RT抑制劑或拮抗劑可以是無機化合物、有機化合物、反義序列、與L1RTmRNA中確定的目標區域相應的雙鏈RNA(dsRNA)、L1RT蛋白的顯性失活突變體、抗體或小分子。在本發明的一個實施方案中，有機化合物，例如，核苷類似物，用作L1RT的抑制劑和拮抗劑。因此，用於靶向L1RT的一種方法是將核苷類似物施用於癌症患者。該核苷類似物能夠模擬L1RT所使用的構件來延伸端粒酶陰性細胞中染色體的末端。這些通過L1RT摻入染色體末端的偽構件(例如核苷類似物)，可以幹擾端粒的功能並因此促進端粒縮短、細胞周期停滯和細胞死亡。很多核苷類似物是本領域技術人員已知的。實際上，核苷類似物是已知的抗逆轉錄病毒的種類，並且很多核苷類似物藥物已經被批准用於治療HIV感染者。這些藥物通過幹擾HIV遺傳物質(RNA)複製為DNA形式而阻止HIV增殖。可用於本發明的核苷類似物的實例是3』-疊氮-2』，3』-雙脫氧胸苷(AZT)、2′，3′-雙脫氧肌苷(ddI)、2′，3′-雙脫氫-3′-脫氧胸苷(d4T)、阿昔洛韋、更昔洛韋。也可使用這些核苷類似物的前體(或藥物前體)(例如，纈更昔洛韋)。由於L1RT是端粒酶陰性細胞的癌症中的關鍵因素，這個關鍵酶活性的非競爭性抑制劑的本發現代表癌症研究和治療中潛在的突破性進展。在廣泛接受的模型系統中(下文有描述)核苷類似物(例如，AZT和更昔洛韋)明確阻斷ALT癌症的證明證實了本發明真正代表了引人注目的突破性進展。儘管沒有提示本發明可能的有益應用，但是先前對AIDS病人的AZT給藥意味著可容易地對癌症病人施用AZT。實際上，核苷類似物已經用於改變癌細胞中端粒酶的活性至接近正常細胞中所發現的水平來作為癌症的治療方法。但是，抑制L1RT所需的核苷類似物的濃度可比抑制端粒酶所需的濃度低幾倍。例如，抑制L1RT活性所需的AZT濃度可比抑制端粒酶活性所需的濃度低幾個數量級(例如低10至1000倍)。L1RT對於這樣低水平的核苷類似物的敏感性是出乎意料的，並且這個出乎意料的發現現在為L1RT特異性癌症的治療提供了有益的治療途徑。重要的是，本發明提供選擇明顯低於其他可用於癌症患者的水平的有效劑量。本發明的研究表明，AZT在達到納摩爾藥物水平而不是200μM至800μM的水平時即可用於癌症。進一步的，目前核苷類似物對AIDS患者的用途，與使用顯著比HIV療法的AZT劑量低的能力相結合，將會加速AZT用於治療L1RT誘導和/或介導的癌症的管理批准。而且，本發明並不限於只將AZT用於治療L1RT誘導和/或介導的癌症。實際上，L1RT抑制劑的用途廣泛適合於一系列以L1RT為要素的其他病症。這些包括，例如誘導血友病A的血液因子VIII基因、X-連鎖的視網膜色素變性2、肌營養不良蛋白基因、引起X-連鎖的擴張型心肌病的DMD基因、以及引起慢性肉芽腫病的X連鎖的基因CYBB中L1誘導的突變(Woods-Samuels等，1989，Genomics，4290-296；Schwahn等，1998，Nat.Genet.，19327-332；Holmes等，1994，NatGenet.，7143-148；Yoshida等，1998，HumMolGenet.，71129-1132；Brouha等，2002，AmJHumGenet.，71327-336)。核苷化合物也可單獨或與不同類似物組合且可通過任何給藥途徑，包括口服施用來給藥。AZT和更昔洛韋或其藥物前體，纈更昔洛韋，是優選的核苷類似物。AZT是可以商業獲得的，並且AZT製劑在很多美國專利中有描述，例如，見美國專利5,683,990。具有AZT的細胞將被選擇性地靶向，因為這些細胞依賴於L1RT來延長或保持端粒，並且端粒的延長或保持需要核苷和/或其類似物的摻入。需要任何特異性的靶向試劑遞送類似物來實現抗癌效果，這裡預期使用靶向AZT和/或其他類似物。因此在一些實施方案中，藥物組合物可能具有已經連接到靶向試劑(例如肽)上的活性化合物，在這種情況下為AZT或另一種核苷類似物，用於專門遞送給特定的靶細胞或細胞內的核部分。在本發明的另一個方面，也被稱為反義寡核苷酸或反義多核苷酸的反義序列用作L1RT的抑制劑或拮抗劑。本發明的反義序列與編碼L1RT的核酸是基本互補或完全互補的。反義序列的互補性(無論是完全互補還是基本互補)使得其與靶核酸序列特異雜交，並且幹擾L1RT的功能、表達等，該幹擾足以抑制細胞的生長。編碼L1RT的核酸可以是DNA，從這種DNA轉錄的RNA，或該RNA的cDNA。不同哺乳動物，例如小鼠、猴子和人類的L1核酸和胺基酸序列已經被測序(見GenBank登錄號AY053456、AF036235、AF148856和GI5070620)(對於L1RTORF2序列見GenBank蛋白登錄AAD39215)。本發明的上下文中，L1RTmRNA是用於設計反義核酸序列的優選核酸。例如，設計靶向編碼L1RT的核酸、長度為20個或20個以上核苷酸的一系列反義硫代磷酸寡核苷酸。通常本發明的反義序列可被設計成結合啟動子或其他調控區，以及L1RT的編碼和/或非編碼區。反義序列優選靶向包括起始密碼子的L1RT核酸序列部分。也預期最有效的反義序列或構建體包括與L1RT的編碼和非編碼區相互補的區域。僅僅通過體外檢測構建體來確定正常細胞的功能是否受到影響，技術人員就可容易地檢測給定反義構建體的效果。優選所選擇的反義序列抑制L1RT活性或表達，至不足以誘導或介導ALT細胞中端粒延長的水平。L1RT表達的幹擾能夠由於任何機制而發生。例如，認為這種反義序列結合有義L1RTmRNA，並幹擾其翻譯。另外，反義序列可使得L1RTmRNA易受核酸酶或核酶消化，幹擾轉錄，或幹擾L1RTmRNA的加工，抑制從L1RT基因轉錄mRNA，或通過一些其他的機制，例如通過核酶起作用。核酶，為本領域技術人員所熟知，是具有催化活性的RNA分子。本發明的核酶是結合併且酶促切割L1RTRNA以及使其失活的反義序列。有用的核酶可包括與L1RTRNA互補的5』-和3』-末端序列，並且可由技術人員以L1RTRNA序列為基礎加以工程化。但是，只要達到最終結果，反義序列幹擾L1RT表達的特定機制並不是關鍵。通常為了確保特異性雜交，反義序列與目標L1RTmRNA序列基本互補。在某些實施方案中，可使用與目標核酸序列完全或精確互補的反義序列，或與給定的L1RT目標核酸序列的不同亞序列完全互補的兩個或多個反義序列。亞序列是作為更長核酸殘基序列的一部分的核酸殘基或核苷酸序列，例如，相應於人L1逆轉錄轉座子(GenBankGI5070620)的第1987-2800位核苷酸的反義序列。表.用於幹擾L1RTmRNA的序列實例。反義序列，例如，DNA、RNA、修飾物、類似物等，可通過使用任何適合生產核酸的方法製備，例如化學合成和在此公開的重組方法(見實施例部分)或本領域技術人員已知的這些方法。例如，在一個實施方案中，本發明的反義RNA分子可通過從頭化學合成或克隆來製備。例如，與L1RTmRNA雜交的反義RNA可通過如下步驟來製備將如SEQIDNO1所示的序列以相反方向插入(連接)，將其可操作地連接於啟動子，並在表達載體(例如質粒)中表達。倘若啟動子以及優選終止子或多聚腺苷酸化信號定位正確的話，相應於非編碼鏈的插入序列的鏈將被轉錄，並且作為本發明的反義序列起作用。在一些實施方案中，反義序列也可包括具有核苷酸添加、替代、缺失或修飾的修飾反義核酸序列，或其他核酸序列或非核酸部分，只要保留與相關的目標序列，即L1RTRNA或其基因/cDNA的特異性結合作為該序列的功能特性。例如，由與SEQIDNO2、3、4、5或6所示相同的核苷酸組成的修飾的反義核酸序列，除了在整個長度上相應於SEQIDNO2、3、4、5或6的核苷酸序列的以外，修飾的反義核酸序列具有一個或多個核苷酸取代、缺失或插入。如本領域已知的，同一性或相似性是通過比較序列確定的兩個或多個多核苷酸序列之間的關係。同一性也意味著如通過從多核苷酸5』到3』末端對序列串之間進行匹配所確定的多核苷酸序列之間的序列相關程度。「同一性」能夠通過本領域已知的方法容易地計算。例如見Altschul等，NucleicAcidsRes.，253389-3402(1997)。例如，序列同一性也可通過本領域中已知的排列算法進行優化，並且計算核苷酸序列之間的百分比差異。有效的反義序列能夠通過使用例如GCG(GeneticsComputerGroup，MadisonWis.)或寡核苷酸組合陣列或DNA微陣列來確定，這些技術是本領域技術人員已知的。本發明中，L1RT反義多核苷酸、RNA、DNA、或能夠通過直接化學合成而生產的修飾核酸也都可以使用。通常化學合成優選用於生產寡核苷酸，或含有非標準核苷酸的寡核苷酸和多核苷酸(例如，探針、引物和反義寡核苷酸)來用於本發明。核酸的直接化學合成可按本領域已知的程序進行。本領域的普通技術人員將認識到，DNA的化學合成通常可能被限制在大約100或150個鹼基的序列，更長的序列可通過較短序列的連接或更為複雜的合成方法來獲得。應了解的是，本發明的L1RT反義寡核苷酸能夠用非標準的鹼基或非標準的主鏈結構製備，來提供所需的特性，例如，增強的核酸酶抗性、更緊密的結合、穩定性或所需要的Tm。可生產多種有用的修飾的寡核苷酸，包括肽核酸(PNA)。肽核酸是DNA類似物，其中主鏈是假肽(醯胺，特別是N-乙氨基甘氨酸主鏈)而不是糖(見，PeterE.Nielsen(Ed)，PeptideNucleicAcidsProtocolsandApplications，FirstEdition，1999，HorizonScientificPress)。已經報導這種主鏈比通常獲得的主鏈產生更強的結合和更高的特異性。而且，已經利用PNA獨特的化學、物理學和生物學特性來生產有效的生物分子工具、反義和反基因劑、分子探針和生物傳感器。PNA化合物的深入教導可以在美國專利號5,539,082；5,714,331和5,719,262中找到。在一些實施方案中，可以合成和使用嵌合的寡核苷酸、形成三鏈的反義序列、RNA-DNA寡核苷酸(RDO)、具有主鏈類似物的寡核苷酸，例如磷酸雙酯、硫代磷酸、二硫代磷酸酯，和本領域中已知的其他物質。例如，可使用長度為30個核苷酸、靶向L1RT編碼核酸的一系列反義硫代磷酸寡核苷酸。標記本發明的反義多核苷酸通常是有益的，例如，當使用L1RT多核苷酸來檢測L1RT的表達，或用於診斷和預測與不適當的高度增生有關的狀況時。該標記可以用本領域技術人員已知的許多方法中的任何方法引入。合適的標記是可通過光化學、生物化學、免疫化學、化學、或光譜學方法檢測到的任何化合物。例如，有用的標記包括32P、35S、螢光染料、酶(例如在ELISA中所普遍使用的)、生物素-鏈親合素、洋地黃毒苷、半抗原、和可獲得抗血清或單克隆抗體的蛋白質，或具有與靶標互補的序列的核酸分子。標記通常產生可測量的信號，例如放射性，能夠用於對結合的可檢測部分的量進行定量。在本發明的另一方面，將相應於L1RTmRNA中已確定的目標區的雙鏈RNA(dsRNA)用作L1RT的抑制劑和拮抗劑。dsRNA誘導L1RT的RNA-靶向的基因沉默，這導致靶向的細胞中L1RT表達的降低或喪失。RNA-靶向的基因沉默是本領域技術人員所熟知的(Ahlquist，2002，Science，2961270-1273)。dsRNA可內源性合成或外部施加，但只需要催化量的dsRNA來誘導沉默。選擇來自L1RT基因一部分的核苷酸序列來生產抑制性的RNA，其可以是部分或全部的雙鏈型。該抑制是特異性的，因為選擇了來自靶基因一部分的核苷酸序列來生產抑制性的RNA。本領域中已知有不同的方法來誘導RNA-靶向的基因沉默，例如小幹擾RNA、短髮夾RNA、表達的長幹擾RNA、表達的小幹擾RNA和表達的短髮夾RNA。優選某些dsRNA(小幹擾RNA和短髮夾RNA)包括對磷酸-糖骨架或核苷的修飾。RNA雙鏈體的形成可在細胞的內部或外部開始。可按照容許每個細胞遞送至少一個拷貝，而更高的雙鏈物質劑量可產生更有效抑制的量導入RNA。抑制是序列特異的，因為相應於RNA雙鏈區的L1RTmRNA核苷酸序列是遺傳性抑制的目標。相對於目標序列具有插入、缺失和單個點突變的RNA序列也被發現對抑制是有效的。RNA可被遞送到細胞，或直接導入組織的細胞間隙內，或導入生物體的血管系統。其也可通過口服遞送給患者。口服導入的方法包括將dsRNA與患者的食物直接混合，以及工程化方法，其中用作食物的物種通過工程化而表達RNA，之後飼餵給待作用的生物體。導入核酸的物理方法包括將RNA溶液直接注射進入細胞，或胞外注射進入患者。另一方面，施用L1RT蛋白的顯性失活突變體或具有編碼顯性失活突變體L1RT蛋白的序列的核酸、或其非功能性片段、或其衍生物，通過幹擾細胞中L1RT與其他分子的相互作用來抑制L1RT的功能。據認為L1RT必須直接與端粒的部分相互作用來延長端粒。因此，功能缺陷但有效結合端粒該部分的L1RT突變體能夠被用作顯性失活突變體來與野生型L1RT競爭。能夠工程化顯性的非功能性L1RT用於在不恰當地過度表達L1RT的癌細胞中表達。考慮到野生型L1RT的蛋白質和核酸序列是已知的，本領域的技術人員能夠產生適用於本發明的L1RT的顯性失活突變體。按照本領域已知的標準遞送方法，這種顯性失活突變體可在體外或體內施用於細胞。在本發明優選的方面，治療性的核酸具有L1RT核酸，該L1RT核酸是在癌細胞中表達顯性非功能性L1RT蛋白或其片段或其嵌入蛋白的表達載體的部分。在本發明的另一個方面，特異於L1RT的抗體或其結合部分用作L1RT的抑制劑或拮抗劑。特別的，本發明預計通過使用L1RT的抗體來預防和治療人以及其他動物中L1RT誘導的癌症。多克隆和單克隆抗體以及這些抗體的結合部分(Fab片段和Fv片段)在本發明的內容中是可預期的。這種抗體可在各種各樣的動物中製備，包括小鼠、兔子、猴子、黑猩猩、奶牛(例如在牛奶中)和鳥。本發明也涉及人和人源化抗體。抗體可以預防性使用或在細胞病理性增殖的急性階段期間使用。在一個實施方案中，本發明涉及其中施用結合L1RT蛋白的抗體以使得該抗體與L1RT反應的方法。在另一個實施方案中，抗體與包括但不限於其他抗體的其他試劑組合。抗體的給藥可通過口服、非腸道地、或其他合適的途徑來進行。抗體的生產可通過本領域已知的技術來完成。例如，通過用人L1RT蛋白或多肽體內免疫動物(例如小鼠)而免疫哺乳動物淋巴細胞。這種免疫必要時以可達幾周的間隔重複，以獲得足夠的抗體效價。可以生產及培養雜交瘤，並且篩選所得到的克隆來生產所需要的單克隆抗體。將產生這種抗體的克隆進行克隆，並在體外或體內生長來產生大量的抗體。如下面所進一步論述的，不同的抑制劑或拮抗劑的效率在施用於受試個體或患者之前可在標準實驗動物模型中顯示。將接受本發明方法治療的受試個體或患者優選是人，且可以是胎兒、兒童或成人。可被治療的其他哺乳動物可以是小鼠、大鼠、兔子、猴子和豬。抑制劑或拮抗劑可單獨施用，或與其他化學療法或其他方法結合使用。例如，L1RT誘導的癌症的治療可與化學和/或放射性療法相結合來治療由端粒酶或一些其他因素誘導的癌症。本領域技術人員已知的化療劑的實例包括但不限於抗癌藥物，例如博萊黴素、絲裂黴素、氮芥、苯丁酸氮芥、5-氟尿嘧啶(5-FU)、氟尿嘧啶脫氧核苷(5-FUdR)、甲氨喋呤(MTX)、秋水仙鹼和己烯雌酚(DES)。為了進行組合治療，以在動物或患者體內有效導致其組合抗癌作用的方式，簡單地對動物施用與另一種抗癌劑組合的本發明的抑制劑成分。因此應以有效導致其在目標細胞區域中組合存在的劑量和時間周期提供該藥劑。為了達到這個目的，該藥劑可以在單一組合物中或作為使用不同給藥途徑的兩個單獨組合物同時給藥。或者，兩個治療可以先後進行，例如間隔幾分鐘到幾小時或幾天。例如但不限於，全身使用的AZT平均每天劑量可以是，對成年人為每天10mg/kg，對小鼠是每天20mg/kg。一些劑量上的變化可依照被治療對象的狀況而進行。負責給藥的內科醫生將能確定用於患者個體的合適劑量，並且可依賴於多個因素，例如，所述患者的年齡、狀況、病史等。因此，本發明的方法能夠用於與L1RT誘導的病理性細胞增殖有關的狀況和疾病的治療應用。可從本發明的治療應用中受益的疾病包括，以細胞高度增殖為特徵的所有疾病，包括例如實體瘤和白血病，以及非癌症狀況。進一步預期本發明的方法不僅在體內背景下，而且在離體(exvivo)條件下，能夠用於抑制癌症細胞的生長。本發明的方法對於抑制病理性增殖的人細胞的離體生長尤其有用，包括但不限於人癌細胞-骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、腎上腺皮質癌、或黑素瘤。本發明提供用於鑑定由細胞中L1RT表達引起的不適宜的、病理性或非正常增殖的細胞的方法和試劑盒。該方法能夠用作通過確定來自病人的組織中L1RT表達的存在(和/或水平)幫助診斷患者中存在癌細胞或腫瘤的篩選方法，其中L1RT表達的存在表明患者體中有癌細胞或病理性的細胞增殖。例如，癌腫瘤樣品能夠如下診斷，通過檢測以多種方法測定的L1特異性mRNA表達，這些方法包括但不限於，利用核酸的雜交、Northern印跡法、原位雜交或RNA微陣列，或通過多種方法測定L1逆轉錄轉座子ORF1和/或ORF2編碼的蛋白的存在，這些方法包括但不限於，Western印跡法、免疫沉澱或免疫組化、或逆轉錄酶的酶活性。顯示ALT的癌細胞也能夠通過測定催化亞基mRNA表達的缺失而確定(通過多種方法測定，包括但不限於，Northern印跡法、RNA保護分析、原位雜交、RT-PCR、實時RT-PCR或RNA微陣列)，或通過測定端粒酶催化亞基翻譯的缺失來確定(通過多種方法測定，包括但不限於，Western印跡法、免疫沉澱或免疫組化)。顯示ALT的細胞的另一個特徵是存在長且異質性的端粒(Bryan等，1997，NatureMedicine，31271-1274)。因此，診斷方法可包括檢測長且異質性端粒的存在作為具有ALT細胞的指標。方法包括但不限於，末端限制性消化及其修飾、使用端粒特異性探針的原位雜交、或使用端粒特異性DNA或PNA探針的流式細胞術。在優選的實施方案中，直接針對L1RT的核酸探針能夠被用來檢測經歷快速增殖的組織中L1RTmRNA水平的存在和/或增加，例如原代癌細胞，包括人骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、腎上腺皮質癌或黑素瘤。因此，本發明提供使用與L1RT亞序列互補的核酸探針來檢測和確定病理性增殖的細胞包括癌細胞的方法。例如，確定病理性增殖的細胞的方法可包括用直接針對L1RTmRNA的核酸探針來將檢測細胞中L1RTmRNA的表達水平與對照細胞中L1RTmRNA的表達水平進行比較。當觀察到L1RT的表達水平與對照細胞相同時，檢測細胞就被確定為病理性增殖細胞。優選用於本發明方法的核酸探針與人L1RT核酸序列，優選mRNA完全互補，並且檢測細胞是人細胞。與人L1RTRNA序列完全互補的核酸探針的一個實例是5′-TCCTGCTTTCTCTTGTAGGCA-3′(SEQIDNO6)。但用於本發明方法的核酸探針也可以與人、小鼠或其他哺乳動物的L1RTmRNA或L1RT逆轉錄轉座子RT序列基本互補。對於本領域的技術人員顯而易見的是，核酸探針中可以進行不會影響該探針有效檢測病理性增殖細胞(例如癌細胞)中L1RTRNA的能力的取代，且因此這種取代是在本發明的範圍之內。用於本發明方法中的核酸探針可以是DNA探針、或修飾的探針，例如肽核酸探針、硫代磷酸探針、或2′-O甲基探針。核酸探針的長度可以是大約8或10個到50個核苷酸，優選大約15到25個核苷酸長度。本發明的方法可以在來自人、哺乳動物、或其他脊椎動物的細胞提取物、培養的細胞、或組織樣品中很容易地進行。本發明的方法可用於檢測由於L1RT在體外細胞、細胞培養液、以及人細胞和組織，例如實體瘤和癌(人骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、腎上腺皮質癌、或黑素瘤)中表達而引起的不恰當、病理性或非正常增殖的細胞。本發明也提供檢測和/或抑制高度增殖細胞或癌細胞的試劑盒。該試劑盒可具有與L1RTmRNA的序列完全互補或基本互補的核酸探針。用於抑制病理性增殖細胞的增殖的試劑盒，包括使細胞接觸試劑的步的試劑盒，可具有當接觸細胞時能夠影響病理性增殖的試劑，例如，與L1RT核酸的亞序列基本互補的，優選完全互補的反義寡核苷酸。該試劑盒可以是含有一種或多種上述核酸探針、反義寡核苷酸、或含有或不含這裡所討論的檢測標記的其他合適試劑的容器形式。該試劑盒可包含用於樣品RNA、DNA或蛋白分離和雜交的適合的膜，優選為適合所要求保護的方法使用的分析裝置的形式。該試劑盒也可包括用來進行本發明方法的說明書手冊。試劑盒也可包括用於檢測出現可檢測標記的試劑，和/或在進行多種檢測中有用的材料，包括陽性、陰性對照、內部和/或外部對照。試劑和材料的例子是RNA抽提緩衝液、雜交緩衝液、試管、移液管等。能夠用於本發明方法的L1RT抑制劑或拮抗劑應該不以任何方式限於本申請中提及的特異性化合物。考慮到本發明公開了負責細胞高度增殖的靶標，一些其他有用的L1RT抑制劑或拮抗劑可通過簡單的篩選方法加以確認。活性化合物可包括天然存在或現有技術中的化合物的片段或部分。但是，在人體中測試這種化合物之前，必須在篩選測試中檢測各種候選試劑來確定哪些具有作為抗腫瘤藥物的潛力。用於檢測藥物對癌症影響的許多檢測是本領域已知的。因此，在特別的實施方案中，本發明涉及確定或選擇可調節L1RT表達或活性的化合物的方法。幹擾L1RT生物活性的藥物是抗腫瘤藥物的優良候選者，因為它們影響導致不受控制的增殖或細胞數量持續增長的步驟之一。化合物或藥物的篩選可用純化的L1RT酶、體外模型、細胞培養物、遺傳改變的細胞或動物、或異種移植模型抗腫瘤分析進行。特別有意義的是篩選對人細胞有低毒性的試劑的檢測。候選試劑包括很多化學品種類，儘管其一般是有機分子、反義多核酸、或具有大於50小於大約2,500道爾頓分子量的小有機分子、嘌呤和嘧啶的類似物、或其組合。已知的藥物抗腫瘤劑可進行進一步的化學修飾，例如醯胺化，來生產結構類似物。如果篩選分析是結合分析法，可使一個或多個分子與標記結合到一起，其中該標記能夠直接或間接地提供可檢測到的信號。也可使用不同的標記，例如放射性同位素、螢光染料、化學發光試劑、酶和特異性結合分子、顆粒，例如磁性微粒。其他多種試劑，諸如鹽、中性蛋白，例如白蛋白，去汙劑等，也可用於促進優化的蛋白-蛋白結合和/或減少非特異性或背景相互作用。也可使用提高分析效率的試劑，例如蛋白酶抑制劑、核酸酶抑制劑、抗微生物劑。例如，最簡單形式的用於確定化合物或試劑的篩選檢測或方法可包括使候選化合物或待測化合物在一定條件下與表達L1RT的細胞一起溫育，其中對於該化合物或待測化合物的存在，L1RT和其他細胞成分的相互作用誘導可檢測或可測量的生物學效應或化學效應(例如向端粒添加核苷或類似物，或保持端粒長度)，之後在存在該化合物或待測化合物時，確定L1RT與細胞成分相互作用誘導可檢測或可測量的生物學效應或化學效應的能力。如果候選化合物和待測化合物調節L1RT與其他細胞成分的相互作用，則選擇這個化合物。感興趣的其他檢測可以是，例如，可將表達L1RT的細胞系或具有L1RT基因的表達構建體在允許L1RT表達的條件下導入細胞系。向這個細胞系加入候選試劑，檢測抑制或下調L1RT活性的能力。L1RT的活性水平可通過功能性讀取或檢測來確定，包括L1RT表達水平的變化、與端粒或一些其他底物的結合或結合的抑制、凋亡、生長的存在或缺乏、轉移的存在或缺乏、細胞分裂的存在或缺乏、細胞遷移的存在或缺乏、軟瓊脂集落形成的存在或缺乏、接觸抑制的存在或缺乏、侵入性的存在或缺乏、和/或腫瘤進展或其他惡性表型的存在或缺乏。例如，確定候選化合物降低細胞中野生型L1RT表達能力，以及在這些細胞中伴隨誘導凋亡的能力的方法，可如下進行獲得表達L1RT的細胞，混合候選物質與細胞；以及確定該候選物質降低L1RT含量和/或細胞染色體上端粒長度的能力。用來確定候選物質能夠幹擾L1RT表達的另一個簡單的實施例可如下進行可以測量或確定細胞的L1RT狀態。如果細胞具有表達L1RT的能力，則在沒有添加候選化合物時測定其基礎的L1RT含量。之後向細胞添加候選化合物，並且在存在候選化合物時再次測定野生型L1RT的表達。相對於在缺少待測或候選化合物時細胞的L1RT表達，減少L1RT表達的候選化合物表明該候選化合物具有野生型L1RT表達抑制能力。因此，它能夠具有預防和治療性的癌症緩和與凋亡的能力。本發明也包括不同動物模型的使用。通過研發或分離表達L1RT的細胞系，能夠在不同的實驗動物中產生疾病模型。這些模型可以採用皮下、正位(orthotopic)或全身細胞給藥，以模擬各疾病狀態。例如，IIICF/c成纖維細胞系(ALT)可用pSV2neo-EJras質粒DNA(含有來自EJ膀胱癌細胞系的活化c-Ha-ras癌基因)轉染，用G418選擇，並皮下注射進裸鼠體內以獲得ALT腫瘤。產生的腫瘤在端粒重複擴增法(TRAP)分析中並不顯示任何可檢測到的端粒酶活性，並且Southern分析顯示它們保持診斷ALT的TRF長度模式(Yeager等，CancerRes.1999，59(17)4175-9)。最終，端粒酶敲除的動物(例如，端粒酶KO小鼠-/-；Rudolph等，1999，Cell，96701-712)或在動物中作為轉基因表達野生型L1RT的轉基因動物可用作治療模型。當然，動物模型也提供檢測試劑組合的有用工具。在體內確定化合物的效果可涉及多種不同的標準，包括但不限於，存活率、腫瘤消退、腫瘤進展停滯或減緩、腫瘤的消除和轉移的抑制或防止。用待測化合物治療動物涉及將化合物以合適的形式施用於動物。給藥將通過任何能夠用於臨床或非臨床目的的途徑來進行，包括但不限於，口、鼻、頰、直腸、陰道或局部給藥。或者，給藥也可通過氣管內滴注、支氣管滴注、皮內、皮下、肌肉內、腹膜內或靜脈內注射。特別預期的是全身性靜脈內注射，通過血液或淋巴供應的局部給藥和腫瘤內注射。當然，篩選可包括合適的對照值(例如，在缺少候選化合物時在顯示ALT的分離細胞或動物中L1RT的表達或生產水平)。被認為是陽性的待測化合物或候選化合物，即可能有益於癌症治療的化合物，是具有實質的生長抑制效果的化合物(例如能夠使細胞生長減少優選至少20％，更優選至少50％，最優選至少80％，最優選大約90-100％的待測試劑)。這樣的化合物在許多方面是重要的。它們在L1RE-相關癌症的治療方案中至關重要，無論在癌症治療中是單獨給藥，還是與本領域技術人員已知的化學和放療方案相組合。另外，僅僅通過減少L1RT，這些化合物將有助於選擇性誘導癌症細胞的大規模凋亡。選擇具有所需藥物活性的化合物，並且可以將其在生理學或藥物可接受的載體中施用於宿主來治療增生性疾病等。藥物可接受的載體部分取決於待給藥的特定組合物(例如核酸、蛋白質、有機化合物、載體或轉導的細胞)，以及用於施用該組合物的特定方法。因此本發明的藥物組合物存在廣泛種類的適當製劑。本發明的藥物組合物可包含重組產物。例如可將靶向L1RT的反義寡核苷酸或dsRNA插入用於轉染靶細胞和生物體的許多已知載體中的任何載體內。例如，核酸以DNA質粒、裸核酸和與遞送載體如脂質體複合的核酸的形式進行遞送。病毒載體遞送系統包括DNA和RNA病毒(Porter，2004，Retroviralvectorsforsuicidegenetherapy，MethodsMolMed.，9091-106；Wang等，2004，ProlongedandinducibletransgeneexpressionintheliverusinggutlessadenovirusApotentialtherapyforlivercancer，Gastroenterology，126278-289)。在具體的實施方案中，使用含有反義L1RT核酸的病毒載體。例如，可以使用本領域已知的用於癌症基因治療的逆轉錄病毒載體或腺病毒載體。將用於基因治療的反義L1RT核酸克隆進合適的載體中，其有利於該基因遞送進入患者。核酸的非病毒遞送方法可包括裸多核苷酸、試劑增強的多核苷酸攝取、顯微注射，粒子轟擊、脂質體、免疫脂質體、聚陽離子或脂質核酸共軛物。遞送可以是到細胞(離體給藥)或到靶組織(體內給藥)(Narayanan，Antisensetherapyofcancer，InVivo.1994，8(5)787-793；Zhang等，Anti-oncogeneandtumorsuppressorgenetherapy--examplesfromalungcanceranimalmodel，InVivo.1994，8(5)755-769)。在特別的實施方案中，使用一種核酸分子，其中反義L1RT序列和任何其他需要的序列的側翼為促進在基因組中所需要的位點發生同源重組的區域，由此提供反義L1RT核酸的染色體內表達。位於L1RTORF(ORF2)的5』末端一側的序列的一個實例是5′-agaccatcaagactaggaagaaactgcatcaactaatgagcaaaatcaccagctaacatcata-3′(SEQIDNO7)。本發明的藥物組合物、抑制劑或拮抗劑能夠以多種方式給藥，包括口服、局部、非腸道給藥，例如皮下、腹膜內、通過病毒感染、血管內給藥等。根據導入的方式，化合物可以多種方式配製。適用於口服給藥的製劑可以是液體溶液。適用於非腸道給藥的製劑(例如通過關節內、心室內、鼻內、靜脈內、肌肉內、皮內、腹膜內和皮下途徑)包括含水和非含水的、等滲無菌注射溶液。在本發明的實踐中，組合物能夠通過例如靜脈輸液、口服、局部、非腸胃或腹膜內給藥。口服和非腸道給藥是優選的給藥方法。配製和給藥的技術是本領域常規的，進一步的細節可在例如″Remington′sPharmaceuticalSciences(2000)，GennaroAR(ed)，20thedition，MaackPublishingCompany，Easton，PA中發現。含有用於調節L1RT的化合物(例如核酸、蛋白質、有機化合物、載體和轉導的細胞)的藥物組合物以能獲得預期目的的有效量施用於需要該組合物的患者。治療有效量或藥理學有效量是本領域公知的措辭，是指藥物產生預期藥理學效果的有效劑量。例如，治療有效量是足以隨時間在患者中產生有益治療反應(即，治療疾病或狀況或緩和被治療患者中疾病的症狀)的量。實際的給藥量將根據被施加治療的個體情況而定，優選是獲得所需效果且沒有明顯副作用的優化劑量。如下文進一步詳細描述的，劑量也可根據所施用的特定抑制劑或拮抗劑的效果和患者的狀況，以及被治療患者的體重或表面積來確定。劑量的大小也根據對特定患者施用例如特定試劑、載體或轉導細胞類型所伴隨的任何不良副作用的存在、特性和程度來確定。能夠防止、抑制或減少ALT介導的癌症發病率的藥物的治療有效量，利用來自在此公開的細胞培養分析，和/或來自利用動物模型的體內分析所獲得的數據，是很容易確定的。有鑑於此，可使用本領域已知的任何L1RT誘導的癌症動物模型(Hahn等，1999，NatureMedicine，5(10)1164-1170；Yeager等，1999，CancerResearch，59(17)4175-4179)。動物模型也能夠用來評估對人體的合適劑量範圍和給藥途徑。在轉變為臨床環境之前，荷有人來源實體瘤的實驗動物(或本領域公認的動物模型)經常被用來優化合適的治療劑量。這種模型已知在預測有效的抗癌策略中是非常可靠的。例如，荷有實體瘤的小鼠或本領域公認的小鼠模型被廣泛用於前期臨床測試，以確定獲得有益抗腫瘤效果而毒性最小的治療劑的工作範圍。由於在本領域公認的模型中已經證實了安全性，至少對於AIDS和端粒酶介導的癌症中使用的核苷類似物來說，本發明的臨床前檢測主要是常規實驗。體內效果可利用測量腫瘤形成(進展)的抑制、腫瘤消退或轉移等的試驗來預測。以下描述了利用從U-2OS人骨肉瘤細胞系生長的裸鼠皮下(s.c.)腫瘤作為模型(即，攜帶異種移植物的小鼠)測定AZT抗腫瘤效力的體內測定的實例。體內測定需要的人癌細胞例如可如下製備從例如ATCC的公共來源獲得端粒酶陰性，但ALT陽性的U-2OS人骨肉瘤細胞系。細胞於37℃，5％CO2的潮溼空氣中保持在補充有10％胎牛血清的McCoy5培養基中。初步檢測顯示，對於明顯的抗腫瘤活性，U-2OS腫瘤模型需要癌基因表達。因此，按照廠商說明書通過Lipofectamine2000TM轉染，將活化的ras-癌基因表達載體導入接近匯合的U-2OS細胞。轉染前一天，將U-2Os細胞以1×105個細胞的密度接種於6孔板中。用ScaI酶限制性消化使質粒pBABE-puro-ras-V12(可公開獲得)線性化。用線性化的構建體轉染細胞並在培養中生長。轉染一天後可稀釋細胞。之後用嘌呤黴素(0.5mg/ml-1)選擇細胞8天。另一個會在小鼠模型中產生腫瘤的人ALT細胞系的實例是用pSV2neo-EJras質粒(含有來自EJ膀胱癌細胞系的活化c-Ha-ras癌基因)DNA轉染並用G418選擇的IIICF/c成纖維細胞系。對於體內檢測，獲得免疫缺陷的小鼠，例如大約5-7周齡的瑞士純合裸鼠(nu/nu)(或免疫缺陷小鼠，Balb/c-ByJ-Hfhllnu)，在施用癌細胞之前保持於不含病原體的環境中。將包含在200μl無血清培養液中的大約5×105個U-2OS/ras-V12細胞通過體側皮下注射(s.c.)輸送給用Metofane暫時麻醉的全部動物以產生腫瘤。或者，腫瘤發生可在皮下注射大約30×106個未轉化的U-2OS細胞後實現(Manara等，2000，Reversalofmalignantphenotypeinhumanosteosarcomacellstransducedwiththealkalinephosphatasegene，Bone26(3)215-220)。之後小鼠被分為試驗組和對照組。在一個實施方案中，評估皮下腫瘤生長或進展時間的影響，而不是已建立腫瘤的大小縮減。在這個實施方案中，從第0天開始，試驗組中的小鼠例如在飲用水中獲得AZT(RetrovirtmIV，GlaxoSmithKline)。水中AZT的濃度可以是2mg/ml。每3天提供AZT的新鮮溶液。對照組中的小鼠只接受飲用水。每2-3天測量腫瘤。當腫瘤超過1cm3時，處死小鼠。腫瘤體積用公式4/3πr3計算，其中r是腫瘤的半徑。對照組中的所有小鼠應長出腫瘤，而試驗組中的全部小鼠保持沒有腫瘤。在另一個實施方案中，本發明的試劑和方法可用於促進攜帶預先已建立腫瘤的動物體內腫瘤的衰退；即本發明的試劑可用來治療具有預先存在的腫瘤的動物。在這種情況下，將癌細胞皮下注射入裸鼠(nu/nu)側腹來建立腫瘤。腫瘤細胞植入後一旦腫瘤建立，即向試驗組中的小鼠施用含有有效針對L1RT活性的核苷類似物的組合物，而對照組中的小鼠接受不含有該核苷類似物的相同組合物(例如水或鹽)，每天2-3次。每2-3天監測腫瘤生長。當在腫瘤細胞植入10-14天後向這些荷瘤動物施用核苷類似物時，觀察到腫瘤生長遲緩。這種腫瘤細胞生長的抑制在對照組中未發現。腫瘤植入幾周後，只有用核苷類似物處理的動物顯示100％的存活率。例如，異種移植的腫瘤能夠通過注射轉化的IIICF/c成纖維細胞而在免疫缺陷的小鼠皮下產生。可將大約2×106個細胞皮下注射進用Metofane短暫麻醉的小鼠中。優選細胞沿著其背側注射。每2-3天測量生長中的腫瘤。能夠用卡鉗測量腫瘤的最長軸以及與該軸垂直的軸來監測腫瘤的生長。腫瘤體積可用公式4/3πr3計算，其中r是腫瘤的半徑。可切下腫瘤並在處理前稱重。用於分子生物學分析的組織可在液氮中速凍並儲存於-80℃。異種移植的腫瘤在端粒重複擴增方案(TRAP)檢測中沒有可檢測到的端粒酶活性。診斷顯示ALT的細胞的TRF長度模式可通過Southern分析來驗證。誘發腫瘤後，試驗組中的小鼠可以用AZT治療。小鼠可一天2次腹膜內注射溶於PBS中的AZT溶液，每天總劑量為10mg/kg。對照組小鼠可注射PBS。或者，相同每日劑量的AZT可在飲用水中給予。對照組中的小鼠將具有活躍生長的腫瘤，而試驗組中的小鼠均沒有腫瘤。作為單獨的一組對照，可通過用WM1175(惡性黑素瘤)或HUT292DM(肺癌)細胞代替轉化的IIICF/c成纖維細胞注射細胞免疫缺陷小鼠而在裸鼠中誘導端粒酶陽性腫瘤。應注意的是免疫缺陷小鼠中的端粒酶陽性細胞不能被用於抑制ALT癌細胞生長的劑量的AZT所抑制。在另一個實施方案中，也可使用測定凋亡促進的體內分析。在這個實施方案中，可檢測用治療性組合物處理的異種移植小鼠中凋亡病灶的出現並與未處理的對照異種移植小鼠相比較。在處理小鼠的腫瘤中發現的凋亡病灶的程度提供了該組合物治療效果的指標。在設計用於治療人ALT-介導的癌症(早期腫瘤和血管化的腫瘤)的藥劑的適當劑量時，可從在此描述的動物研究很容易地外推以獲得臨床給藥的合適劑量。為了獲得這個轉換，將考慮每單位質量的實驗動物所施用的藥劑質量，優選考慮實驗動物和人患者之間體表面積的差異。所有這些計算對本領域普通技術人員來說是已知和常規的。因此，治療有效量的確定是本領域技術人員力所能及的。例如，在採用在細胞培養測定和小鼠研究中成功的AZT劑量時，以及在基於質量和表面積進行標準計算時，用於人患者的有效劑量是每個患者每天大約100mg到大約1000mg的AZT，優選每個患者每天大約500mg到大約600mg的AZT。因此，利用這些信息，在此預期用於人給藥的治療劑(例如，核苷類似物3』-疊氮-2』，3』-雙脫氧胸苷(AZT)、2′，3′-雙脫氧肌苷(ddI)、2′，3′-雙脫氫-3′-脫氧胸苷(d4T)、或更昔洛韋)的低劑量可以是每個患者每天大約1、5、10、20、25或大約30mg；用於人給藥的治療劑的有用高劑量可以是每人每天大約250、300、400、450、500、1000、3000或大約6000mg。有用的中等劑量可以是每個患者大約500到大約3000mg。儘管有這些註明的範圍，應當理解考慮到這裡所述的參數和詳細指導，活性或最佳範圍的進一步變化也包括在本發明的範圍內。本發明的治療方案的目的一般是產生明顯的抗腫瘤效果，同時仍然將劑量保持在與不可接受的毒性相關的水平以下。除了改變劑量本身外，也可改變給藥方案以優化治療策略。目前優選的治療策略是在大約40天周期內，每天施用大約1-500mg，優選大約10-100mg的L1RT抑制劑或拮抗劑或包含其的治療性混合物。給藥能通過口服的單個或分開劑量，或例如直接向實體瘤部位給藥，或以緩釋製劑形式來完成。負責給藥的醫師根據本發明所公開的內容，將能夠為受試個體確定合適的劑量、給藥的形式和途徑。這種優化和調整是本領域常規進行的，並且決不會反映過多的實驗。在施用特定劑量本身時，根據無菌性、致熱原性、純度和對人患者全身性的一般安全性的管理標準，優選提供藥物學上可接受的組合物。當然，身體檢查、腫瘤測量和實驗室檢測應在治療前進行，並且在治療後以最多為1到幾個月的間隔進行，本領域的技術人員應知道如何進行這種常規程序。臨床反應可通過任何可接受的測量來確定。例如，完全的反應可通過治療後指定期間內全部可測量的腫瘤的消失來確定。實施例下列實施例進一步闡明了本發明。下面的實施例用本領域技術人員已知且是常規的標準技術進行，除非另有詳細說明。這些實施例用例證說明而非限制的方式提供。實施例1AZT或更昔洛韋處理後端粒酶陰性ALT細胞中端粒縮短、G2停滯和凋亡的誘導為了檢測據報導通過ALT機制4保持端粒的兩個細胞系(U-2OS和Saos-2骨肉瘤)中L1特異的RNA，通過使用L1逆轉錄轉座子特異性探針的斑點印跡法分析總mRNA。報告的端粒酶陽性細胞系(HEC-1和HeLa)用來進行比較4，21(圖1)。兩個ALT細胞系(U-2OS和Saos-2骨肉瘤)在這個檢測中都是陽性。如以前所報導的20，HEC-1細胞是完全陰性的，HeLa細胞中只有痕量的L1轉錄物。用治療性濃度的AZT處理ALT細胞系，來測定滑動端粒DNA合成是否能被AZT-TP所抑制，並因此誘導端粒變短。AZT處理的和未處理的細胞系中的端粒長度通過使用端粒特異的肽核酸(PNA)探針的流式細胞術進行測定22，23。為了確定細胞周期分布，用碘化丙啶(PI)染色細胞22。AZT處理14天後，兩個ALT細胞系均證實發生端粒縮短、大量凋亡和G2停滯(圖2)。為了確定AZT誘導的端粒縮短對ALT細胞的特異性，用AZT在相同條件下處理已知端粒酶陽性的HeLa細胞系。在HeLa細胞中，選定濃度的AZT對端粒的長度或細胞周期分布沒有影響(未顯示)。為了證明端粒縮短和DNA合成速率的動態變化，用AZT處理U-2OS細胞不同的時間，並同時用流式細胞術分析。DNA合成速率通過5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BdU)摻入法24來確定。結果(圖3)顯示漸進性的端粒縮短和DNA合成減少。重要的是注意到細胞周期分布、DNA合成和端粒長度的變化迅速，並且在AZT處理僅僅10天後就能檢測到。同時，PI染色證實在處理後期，與未處理的細胞相比較，AZT處理的細胞中有更高的DNA含量。這一事實的合理解釋是短的端粒誘導染色體末端到末端的連接12，26。由於U-2OS和Saos-2代表p53+/+和p53-/-癌細胞系27，AZT處理的ALT細胞中凋亡的誘導看來不依賴於p53。另外，U-2OS細胞也用治療濃度的鳥嘌呤類似物更昔洛韋(GCV)處理，來證實滑動端粒DNA合成能夠被GCV-TP抑制，並且端粒的縮短能夠被誘導。未處理的(圖4a)和GCV處理的細胞(圖4b)中，端粒長度可如上所述，用端粒特異性PNA探針通過流式細胞術測量。為了確定細胞周期分布，用碘化丙錠(PI)染色細胞。用濃度為0.3μg/ml的GCV處理14天後，U-2OS細胞證明發生端粒縮短、大規模凋亡(程序性細胞死亡)和G2停滯。應該注意的是，例如AZT和GCV的核苷類似物一旦進入宿主細胞，就被轉化為它們的三磷酸酯形式。例如，如本領域技術人員熟知的，GCV首先被磷酸化為GCV-單磷酸(GCV-MP)。之後GCV-MP被內源性激酶進一步磷酸化為GCV-雙磷酸(GCV-BP)和GCV-三磷酸(GCV-TP)。GCV-TP缺乏脫氧核糖上的3』OH，以及DNA鏈延長所必需的2』和3』碳之間的鍵。因此，GCV-TP向U-2OS細胞或其他宿主細胞基因組內的整合抑制DNA聚合酶，並且導致DNA鏈終止，這引起了細胞的凋亡。已經報導端粒延長受到抑制的腫瘤失去了產生腫瘤的能力12，26，並且AZT已經被臨床用於治療AIDS。本公開的內容證明AZT能夠用來治療多達30％的癌症病例。也可使用其他一些已經在臨床上應用的核苷逆轉錄酶抑制劑(例如2′，3′-雙脫氧肌苷(ddI)或2′，3′-雙脫氫-3′-脫氧胸苷(d4T))。實施例2L1逆轉錄酶反義抑制後端粒酶陰性ALT細胞中端粒縮短、G2停滯和凋亡的誘導為了確證ALT只通過L1逆轉錄酶進行，用含有有義和反義方向的人L1ORF2部分的表達構建體轉染U-2OS細胞。如下產生L1特異性逆轉錄酶靶向的反義構建體用RT-F(5′-ATGACAGGATCAACTTCACAC-3′)(SEQIDNO8)、RT-R(5′-TCCTGCTTTCTCTTGTAGGCA-3′)(SEQIDNO6)引物，以pBS-L1RP-EGFP質粒作為模板進行PCR。將929bp的PCR產物克隆到pTargetT載體(Promega)中。包含有義和反義方向插入的重組構建體，用PlasmidMidi試劑盒(Qaigen)純化，用XmnI(Promega)消化，並根據製造商的指導用″Lipofectamine″(Gibco)將其轉染進U-2OS細胞中。在含有0.5mg/mlG418(Gibco)的培養基中選擇40天後，收穫細胞，用PNA和PI染色，並且用流式細胞術22分析。L1逆轉錄酶反義靶向的示意圖在圖5中顯示。圖6所示的數據顯示攜帶反義構建體的細胞證實有如預期的大量凋亡、G2停滯和端粒縮短。相反，表達有義構建體的細胞沒有顯示端粒長度或細胞周期的差異。下列材料和方法用於上文的工作實施例細胞系本研究中使用的全部細胞系獲得自美國典型培養物保藏中心(Rockville，MD)。細胞的來源包括骨肉瘤(Saos-2和U-2OS)、肝(HEC-1)和宮頸(HeLa)。細胞按照ATCC推薦來培養。為了用AZT處理細胞，培養液中補充有0.2μM的3』-疊氮-2』，3』-雙脫氧胸苷(Sigma)28。斑點印跡分析用″RNA-STA60″溶液(Tel-Test，Inc.)分離總細胞RNA。利用30μg總RNA和「HRPNorth2South″(Pierce)標記的pBS-L1RP-EGFP質粒29作為特異性探針，按照製造商的方案進行反應。溴脫氧尿嘧啶核苷摻入法對於BdU摻入，利用與10mMBrdU(Sigma)溫育2.5小時的細胞進行細胞染色，用BU-33抗-BrdU單克隆抗體(Sigma)和FITC標記的Alexa488山羊抗小鼠IgG(H+L)(Fab′)片段(MolecularProbes)染色，用50μg/mlPI(Sigma)復染，並通過所描述的的流式細胞術分析24。通過流式細胞術的端粒長度測量細胞用端粒特異性FITC共軛的(C3TA2)3PNA(AppliedBiosystems)探針染色，並如所描述的用0.06μg/mlPI復染21。利用反義策略的L1逆轉錄酶的抑制為了產生L1特異性逆轉錄酶靶向的反義構建體，使用RT-F(5′-ATGACAGGATCAACTTCACAC-3′)(SEQIDNO8)、RT-R(5′-TCCTGCTTTCTCTTGTAGGCA-3′)(SEQIDNO6)為引物，並以pBS-L1RP-EGFP質粒為模板進行PCR。將929bp的PCR產物克隆到pTargetT載體(Promega)中。含有有義和反義方向插入的重組構建體用PlasmidMidi試劑盒(Qaigen)純化，用XmnI(Promega)消化，並根據製造商的指導用″Lipofectamine″(Gibco)將其轉染進U-2OS細胞。在含有0.5mg/mlG418(Gibco)的培養基中選擇40天後，收穫細胞，用PNA和PI染色，並通過流式細胞術分析22。下列編號1-29的參考文獻在上述說明書中被引用(帶有相應的上標號)，如此本領域的技術人員會將該參考文獻與上文中適當的上標號相匹配。1.Greider，C.W.，Blackburn，E.H.IdentificationofaspecifictelomereterminaltransferaseactivityinTetrahymenaextracts.Cell43，405-413(1985).2.Wright，W.E.，Piatyszek，M.A.，Rainey，W.E.，Byrd，W.，Shay，J.W.Telomeraseactivityinhumangermlineandembryonictissuesandcells.Dev.Genet.18，173-179(1996).3.Kim，N.W.，Piatyszek，M.A.，Prowse，K.R.，Harley，C.B.，West，M.D.Specificassociationofhumantelomeraseactivitywithimmortalcellsandcancer.Science266，2011-2015(1994).4.Bryan，T.M.，Englezou，A.，Dalla-Pozza，L.，Dunham，M.A.，Reddel，R.R.Evidenceforanalternativemechanismformaintainingtelomerelengthinhumantumorsandtumor-derivedcelllines.Nat.Med3，1271-1274(1997).5.Reddel，R.R.，Bryan，T.M.，Colgin，L.M.，Perrem，K.T.，Yeager，T.R.Alternativelengtheningoftelomeresinhumancells.Radiat.Res.155，194-200(2001).6.Kazazian，H.H.Jr，Moran，J.V.TheimpactofL1retrotransposonsonthehumangenome.Nat.Genet.19，19-24(1998).7.Nozawa，K.，Suzuki，M.，Takemura，M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4的方法，其中所述核苷類似物是3』-疊氮-2』，3』-雙脫氧胸苷(AZT)。30.權利要求24的方法，其中所述反義序列是DNA寡核苷酸、2′-O甲基寡核苷酸、肽核酸寡核苷酸或硫代磷酸寡核苷酸。31.權利要求30的方法，其中所述反義L1RT核酸具有包括SEQIDNO1的核苷酸序列。32.權利要求24的方法，其中所述反義序列長度為大約8個到大約50個核苷酸。33.權利要求32的方法，其中所述反義序列長度為大約15個到大約25個核苷酸。34.權利要求24的方法，其中使細胞接觸兩個或多個與所述核酸的不同亞序列完全互補的反義序列。35.權利要求24的方法，其中所述反義序列是核酶的一部分。36.權利要求24的方法，其中所述端粒酶陰性細胞是癌細胞，其中該癌細胞選自骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、腎上腺皮質癌或黑素瘤。37.一種在能夠進行L1RT轉錄的系統中幹擾L1RT活性的方法，包括向該系統提供有效幹擾該系統中L1RT活性的一定量的核苷類似物或反義化合物，其中該系統是體內或體外生長的細胞。38.權利要求37的方法，其中所述核苷類似物是3』-疊氮-2』，3』-雙脫氧胸苷(AZT)、2′，3′-雙脫氧肌苷(ddI)、2′，3′-雙脫氫-3′-脫氧胸苷(d4T)、更昔洛韋或纈更昔洛韋或其組合。39.一種在需要這種預防的患者中預防癌症的方法，其中所述的癌症是由於顯示由所述人類細胞中L-1(LINE-1)逆轉錄轉座子編碼的逆轉錄酶誘導或介導的替代端粒延長的細胞造成的，該方法包括對該人施用包括一種或多種核苷類似物、或其藥物學上可接受的鹽的治療有效量的組合物。40.根據權利要求39的方法，其中所述的癌症選自骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、腎上腺皮質癌或黑素瘤。41.一種組合物，其包括能夠編碼在細胞中能夠幹擾L-1(LINE-1)逆轉錄轉座子活性的核酸節段的多聚核苷酸。42.權利要求41的組合物，其中所述核酸節段包括SEQIDNO1。43.包括權利要求41的組合物的分離的宿主細胞。44.權利要求41的分離的細胞，其中所述細胞是人細胞。45.權利要求41的分離的細胞，其中所述細胞是癌細胞。46.一種選擇能夠在端粒酶陰性癌細胞中縮短端粒的化合物的方法，該方法包括對所述細胞施用測試化合物；評估該測試化合物的抗-L-1(LINE-1)逆轉錄轉座子的活性，或評估該化合物是否下調所述細胞中由L-1逆轉錄轉座子編碼的逆轉錄酶的表達；以及選擇顯示下調逆轉錄酶表達的抗-L-1逆轉錄轉座子活性的化合物。47.權利要求46的方法，其中所述評估步包括，檢測所述細胞中的端粒縮短或G2停滯，或所述細胞的凋亡。48.權利要求46的方法，其中所述的細胞是體外培養的細胞，或是非人類的動物模型中的細胞。49.權利要求46的方法，其中所述動物模型選自小鼠、大鼠、兔子、豬、牛、猴子和豚鼠。50.一種檢測端粒酶陰性細胞樣品中癌細胞的存在的方法，該方法包括使所述樣品接觸由L-1(LINE-1)逆轉錄轉座子編碼的逆轉錄酶的抑制劑或拮抗劑；以及檢測顯示端粒縮短或所述細胞中G2停滯，或所述細胞的凋亡的細胞。51.一種檢測能夠在哺乳動物組織內病理性增殖的細胞的方法，包括從所述組織獲得細胞樣品，使該細胞樣品接觸與L1RTmRNA的亞序列基本互補或完全互補的核酸探針，或L1RT逆轉錄酶的特異性抗體；以及檢測所述細胞中L1RT的表達。52.權利要求51的方法，其中所述核酸探針包括可檢測部分。53.權利要求52的方法，其中所述可檢測部分是放射性同位素、螢光分子、生物素或洋地黃毒苷。54.權利要求51的方法，其中所述的核酸探針包括選自5′-CCAGAGATTCTGGTATGTGGTGTCTTTGTT-3′(SEQIDNO2)、5′-CTTTCTCTTGTAGGCATTTAGTGCTATAAA-3′(SEQIDNO3)、5′-CTCTTGCTTTTCTAGTTCTTTTAATTGTGA-3′(SEQIDNO4)、5′-CTTCAGTTCTGCTCTGATTTTAGTTATTTC-3′(SEQIDNO5)和5′-TCCTGCTTTCTCTTGTAGGCA-3′(SEQIDNO6)的序列。55.一種抑制L-1(LINE-1)逆轉錄轉座子的聚合酶活性、或誘導表達所述逆轉錄轉座子的分離細胞或組織凋亡的方法，包括使所述的細胞或組織接觸包含至少一種核苷類似物或反義序列或包含此二者的組合物，以抑制聚合酶活性。56.權利要求55的方法，其中所述的核苷類似物是3』-疊氮-2』，3』-雙脫氧胸苷(AZT)、2′，3′-雙脫氧肌苷(ddI)、2′，3′-雙脫氫-3′-脫氧胸苷(d4T)、更昔洛韋或纈更昔洛韋或其組合。57.權利要求55的方法，其中所述反義序列選自5′-CCAGAGATTCTGGTATGTGGTGTCTTTGTT-3′(SEQIDNO2)、5′-CTTTCTCTTGTAGGCATTTAGTGCTATAAA-3′(SEQIDNO3)、5′-CTCTTGCTTTTCTAGTTCTTTTAATTGTGA-3′(SEQIDNO4)、5′-CTTCAGTTCTGCTCTGATTTTAGTTATTTC-3′(SEQIDNO5)和5′-TCCTGCTTTCTCTTGTAGGCA-3′(SEQIDNO6)。58.一種用於檢測病理性增殖細胞的試劑盒，包括與L1RTmRNA的亞序列基本或完全互補的核酸探針。59.權利要求58的試劑盒，其中該核酸探針包括可檢測部分。60.權利要求59的試劑盒，其中所述可檢測部分是放射性同位素、螢光分子、生物素或洋地黃毒苷。61.權利要求58的試劑盒，其中該核酸探針包括選自5′-CCAGAGATTCTGGTATGTGGTGTCTTTGTT-3′(SEQIDNO2)、5′-CTTTCTCTTGTAGGCATTTAGTGCTATAAA-3′(SEQIDNO3)、5′-CTCTTGCTTTTCTAGTTCTTTTAATTGTGA-3′(SEQIDNO4)、5′-CTTCAGTTCTGCTCTGATTTTAGTTATTTC-3′(SEQIDNO5)和5′-TCCTGCTTTCTCTTGTAGGCA-3′(SEQIDNO6)的序列。全文摘要由L－1(LINE－1)編碼的逆轉錄酶已被確定為治療或預防由該分子誘導或介導的癌症的靶分子。治療或預防患者的這種癌症的方法涉及施用具有患者細胞中逆轉錄酶的抑制劑或拮抗劑的治療有效量的組合物。該抑制劑或拮抗劑阻斷端粒酶陰性細胞中端粒的延長。也公開了用來檢測表達L1RT的病理性增殖細胞的方法和試劑盒。文檔編號A61K31/522GK1925750SQ200580006450公開日2007年3月7日申請日期2005年1月18日優先權日2004年1月15日發明者艾戈爾·E·邦達裡夫,約翰·S·伯特拉姆申請人:Alt解決方案公司