細胞活力檢測試劑盒及其製備方法、應用的製作方法
2023-10-10 14:24:29
專利名稱：細胞活力檢測試劑盒及其製備方法、應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及的是一種細胞活力檢測試劑盒及其製備方法、應用， 用於活細胞計數，直接檢測細胞增殖的測定方法，也是一種評價藥物、 多肽生長因子等物質細胞毒性的檢測方法，適用於細胞培養板中培養 的懸浮和貼壁細胞的檢測。
背景技術：
細胞增殖檢測的傳統方法因為放射性汙染、操作繁瑣、靈敏度低、 儀器設備要求高、費用昂貴等原因而逐步被替代。目前廣泛應用於細
胞增殖檢測的是四甲基偶氮唑鹽(MTT)微量酶反應測定。在20世 紀60年代，科學家發現MTT可被活細胞線粒體內的琥珀酸脫氫酶還 原為藍紫色甲月贊產物，並認為其有反映活細胞的生存和增殖的潛在 價值，於1983年確認了MTT法是正確評價細胞增殖和存活情況的一 種客觀指標。被美國NCI選作為體外抗癌藥物篩選的常規方法。20世 紀90年代以來，MTT法以其簡便、快速、易標準化、不使用同位素 等優點，從眾多藥敏試驗方法中脫穎而出，其藥敏結果指導臨床治療 胃癌、結腸、直腸癌與消化道腫瘤均取得良好效果。
隨後研究者對MTT進行了各種實驗改進，出現了MTT的衍生物XTT， 可形成水溶性甲月贊(Formazan)產物，由此省略了常規MTT法中 需加酸化異丙醇溶解甲月贊的步驟。但XTT法本身不穩定，相對難溶，需要新鮮配製，而且XTT法形成的甲月贊產物為桔黃色，培養
體系中一些黃色代謝物和試劑均可影響檢測結果；因此又設計出一種
新型的MTT類似物MTS， MTS在電子載體1-甲氧基_5-甲基吩嗪硫酸 二甲酯(1-MethoxyPMS)存在的條件下，可被活細胞還原形成水溶性 的甲月贊產物。與XTT法相比具操作簡便，特異性強，形成的甲月 贊產物為深棕色，檢測時外部因素影響少；隨後又出現了靈敏度更高 的2-(4-碘代苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2,4-二硫代苯)-2H-四唑鹽 (wst-1)，同樣在pms存在的條件下進行脫氫酶反應形成水溶性的 甲月贊產物，但WST-1溶液和PMS粉末需要單獨配置，使用時進行比 例混合，操作比較繁瑣；目前市場公認的無論是檢測靈敏度還是操作 簡易程度最佳的是2- (2-甲氧基-4-硝基苯基)-3- (4-硝基苯基) -5- (2， 4-二磺酸苯)-2h-四唑單鈉鹽(WST-8)， 一種新型的四氮 唑鹽，與wst—;l作用條件一樣，需要pms的存在。以wst-8為試劑配 置主要成分，國內外出現了眾多基於WST-8的細胞增殖檢測試劑盒， 但普遍存在的問題是l.試劑存放有效期短，容易造成浪費；2.檢測 靈敏度相比較傳統3H摻入法還有待提高；3.顯色反應結束後沒有終 止反應液進行終止反應，需要自行選擇配置，給實驗帶來不便，導致 檢測時間重複性差。
發明內容
本發明的目的在於針對上述現有產品的不足之處，提供一種細胞 活力檢測試劑盒及其製備方法、應用，以WST-8為主要成分配方的細 胞增殖檢測試劑盒，應用於活細胞計數、細胞增殖和細胞毒性的檢測，能有效提高其有效使用期和檢測靈敏度，避免不必要的浪費。
細胞活力檢測試劑盒及其製備方法、應用是採取以下方案實現
細胞活力檢測試劑盒由WST-8混合溶液儲存液、反應終止液、緩 衝稀釋液組成。其中WST-8混合溶液儲存液包含有50 mmol/L WST-8 溶液、2mmol/LPMS、 lraol/L PIPES緩衝液；反應終止液為10% (W/V) 十二垸基磺酸鈉；緩衝稀釋液為lmol/L PIPES溶液。
細胞活力檢測試劑盒的製備方法
(1) lmol/L PIPES緩衝液的配置
按配比稱取PIPES (哌嗪-N， N-雙(2-乙磺酸))自由酸，溶解於 去離子水中，用NaOH調節PH至6.9，加去離子水定容至lmol/L，微 孔濾器過濾除菌，4'C保存備用；
(2) WST-8混合儲存液的配置
按配比分別稱取WST-8粉末，PMS粉末，溶解於lmol/L PIPES緩 衝液中，混合均勻，微孔濾器過濾除菌，4'C避光保存；
(3) 反應終止液的配置
按配比稱取十二烷基磺酸鈉溶解於去離子水中，攪拌均勻，配置 成10% (W/V)的十二垸基磺酸鈉溶液，4'C保存備用；
(4) 試劑盒的組裝過程
將上述配置的溶液，以10ml、 100ml或500ml規格無菌操作分 裝於試劑瓶中，組成細胞活力檢測試劑盒；
其中WST-8混合溶液儲存液包含有50 ramol/L WST-8溶液、2 mmol/L PMS和lmol/L PIPES緩衝液；反應終止液為10% (W/V)十二烷基磺酸鈉；緩衝稀釋液為lmol/L PIPES溶液。
所述的WST-8為市售2- (2-甲氧基-4-硝基苯基)-3- (4-硝基 苯基)-5- (2， 4-二磺酸苯)-2h-四唑單鈉鹽。
所述的細胞活力檢測試劑盒用於活細胞計數、細胞增殖和細胞毒 性的檢測。
本發明試劑盒中採用PIPES作為溶液緩衝液，能提供穩定的 WST-8試劑反應條件和反應靈敏性，PIPES的pKa值接近生理pH， 在通過細胞膜的時候不能被吸收，而且可透過紫外線，在37'C PIPES 能穩定172小時，優於其它緩衝液，常被用來配置染液檢測腫瘤細胞 等；另外WST-8混合溶液配置成儲存液濃度，為工作濃度的5-10倍， 這樣能夠有效延長試劑的存放時間；最後為保持檢測產物的穩定，配 置了反應終止液，能有效控制實驗反應時間，利於實驗的重複性。
具體實施例方式
細胞活力檢測試劑盒由WST-8混合溶液儲存液、反應終止液、緩 衝稀釋液組成。其中WST-8混合溶液儲存液包含有50咖ol/L WST-8 溶液、2mmol/LPMS、 1mol/L PIPES緩衝液;反應終止液為10% (W/V) 十二垸基磺酸鈉；緩衝稀釋液為lmol/L PIPES溶液。所述的WST-8 為市售2- (2-甲氧基-4-硝基苯基)-3- (4-硝基苯基)-5- (2， 4-二磺酸苯)-2h-四唑單鈉鹽；
所述的WST-8為市售2- (2-甲氧基-4-硝基苯基)-3- (4_硝基苯 基)-5- (2， 4-二磺酸苯)-2h-四唑單鈉鹽。細胞活力檢測試劑盒的製備方法 實施例1、
細胞活力檢測試劑盒10ml規格、100次使用量製備方法
(1) lmol/L PIPES緩衝液的配置
稱取15. 12g PIPES (哌嗪-N， N-雙(2-乙磺酸))自由酸，溶解 於40ml去離子水中，用NaOH調節PH至6. 9，加去離子水定溶至50ml， 微孔濾器過濾除菌，4'C保存備用；
(2) WST-8混合儲存液的配置
稱取WST-8粉末0. 06g， PMS粉末0. 61268g，溶解於10ml lmol/L PIPES緩衝液中，混合均勻，微孔濾器過濾除菌，4t:避光保存；
(3) 反應終止液的配置
稱取5g十二垸基磺酸鈉溶解於50ml去離子水中，攪拌均勻，配 置成10% (W/V)的十二烷基磺酸鈉溶液，4'C保存備用。
(4) 試劑盒的組裝過程
將上述配置的溶液，按照下面描述取溶液體積，無菌操作分裝 於試劑瓶中組成10ml規格的細胞活力檢測試劑盒
1) WST-8混合溶液儲存液1ml:
2) 反應終止液，10% (W/V)十二烷基磺酸鈉10ml;
3) lmol/L PIPES緩衝稀釋液，10 ml
4) 稀釋瓶l個。 實施例2、
細胞活力檢測試劑盒100ml規格、1000次使用量製備方法(1) lmol/L PIPES緩衝液的配置
稱取151. 2g PIPES (哌嗪-N， N-雙(2-乙磺酸))自由酸，溶解 於400ml去離子水中，用NaOH調節PH至6.9，加去離子水定溶至 500ml，微孔濾器過濾除菌，4t:保存備用；
(2) WST-8混合儲存液的配置
稱取WST-8粉末0. 6g， PMS粉末6. 1268g，溶解於100ml lmol/L PIPES緩衝液中，混合均勻，微孔濾器過濾除菌，4'C避光保存；
(3) 反應終止液的配置
稱取100g十二烷基磺酸鈉溶解於1000ml去離子水中，攪拌均勻， 配置成10% (W/V)的十二烷基磺酸鈉溶液，4'C保存備用；
(4) 試劑盒的組裝過程
將上述配置的溶液，按照下面描述取溶液體積，無菌操作分裝於 試劑瓶中組成100ml規格的細胞活力檢測試劑盒
1) WST-8混合溶液儲存液10ml:
2) 反應終止液，10% (W/V)十二烷基磺酸鈉100ml;
3) lmol/L PIPES緩衝稀釋液，100 ml
4) 稀釋瓶1個。 實施例3、
細胞活力檢測試劑盒500ml規格、5000次使用量製備方法 (1) ltnol/L PIPES緩衝液的配置
稱取302. 4g PIPES (哌嗪-N， N-雙(2-乙磺酸))自由酸，溶解 於800ml去離子水中，用NaOH調節PH至6.9，加去離子水定溶至lOOOml，微孔濾器過濾除菌，4"保存備用； (2) WST-8混合儲存液的配置
稱取WST-8粉末3g， PMS粉末30, 634g，溶解於500ml lmol/L PIPES緩衝液中，混合均勻，微孔濾器過濾除菌，4'C避光保存；
(3) 反應終止液的配置
稱取500g十二垸基磺酸鈉溶解於5000ml去離子水中，攪拌均勻， 配置成10% (W/V)的十二垸基磺酸鈉溶液，4t:保存備用；
(4) 試劑盒的組裝過程
將上述配置的溶液，按照下面描述取溶液體積，無菌操作分裝於 試劑瓶中組成500ml規格的細胞活力檢測試劑盒
1) WST-8混合溶液儲存液50ml:
2) 反應終止液，10% (W/V)十二垸基磺酸鈉500ml;
3) lmol/L PIPES緩衝稀釋液，500ml
4) 稀釋瓶l個。
所述的細胞活力檢測試劑盒用於活細胞計數、細胞增殖和細胞毒 性的檢測。
細胞活力檢測試劑盒使用
一、所述的細胞活力檢測試劑盒應用於活細胞計數、細胞增殖的
檢測使用流程
(1)取生長狀態良好的細胞製備成一定細胞濃度懸液，每孔
100ta加入96孔細胞培養板中，如果是貼壁細胞，需要37。C培養箱 進行預培養2-4小時，如果是懸浮細胞，則不需要預培養；(2) 將試劑盒中WST-8混合溶液儲存液按照需要用量，在稀釋 瓶中使用lmol/L PIPES緩衝稀釋液l: IO稀釋，備用；
(3) 將稀釋瓶中的溶液按照每孔10 u 1加入96孔細胞培養板， 37'C培養箱培養1-4小時；
(4)顯色反應後，加入10% (W/V)十二烷基磺酸鈉每孔10ul 終止反應，酶標儀上450-490nm測光吸收度。建議每份樣本做三個重 復孔，將不含細胞，只加入培養基和試劑的孔作為空白對照孔。所測 每孔的吸光度OD值可間接反應每孔中的細胞數，以一組細胞數梯度 為X軸，吸光度OD值為Y軸，作回歸曲線，可根據OD值推算每孔細 胞數。
二、所述的細胞活力檢測試劑盒應用於活細毒性的檢測使用流
程
(1) 取生長狀態良好的細胞製備成一定細胞濃度懸液，每孔
100txl加入96孔細胞培養板中，如果是貼壁細胞，需要37'C培養箱 進行預培養2-4小時，如果是懸浮細胞，則不需要預培養；
(2) 加入不同濃度的毒性物質，37。C培養箱進行培養，時間根據 毒性物質的性質和細胞的敏感性確定；
(3) 將試劑盒中WST-8混合溶液儲存液按照需要用量，在稀釋瓶 中使用lmol/L PIPES緩衝稀釋液l: IO稀釋，備用；
(4) 將稀釋瓶中的溶液按照每孔10y 1加入96孔細胞培養板， 37。C培養箱培養1-4小時；
(5) 顯色反應後，加入10% (W/V)十二烷基磺酸鈉每孔10ul終止反應，酶標儀上450-490nm測光吸收度。建議每份樣本做三個重 復實驗孔As,將不含細胞和毒性物質，只加入培養基和試劑的孔作 為空白對照孔Ab;含有細胞的培養基和試劑，但不加毒性物質的孔 作為陽性對照孔Ac。按照細胞存活率公式細胞存活率aX(As-Ab) / (Ac- Ab) ]xlOOy。計算出細胞存活率，按照細胞存活率反應出被檢 測物質的細胞毒性。
下面使用本發明以小鼠骨髓瘤細胞SP2/0來檢測HEPES粉末的細 胞毒性，以確定HEPES能用於細胞培養基的配置。
將生長狀態良好的完全1640培養基培養的小鼠骨髓瘤細胞 SP2/0，血球計數板計數後，製備成濃度為lx 104細胞懸液。在96 孔細胞培養板中每孔滴加100u 1細胞懸液，37'C細胞培養箱預培養 2小時；然後加入按比例濃度配置10"1HEPES溶液，WDMSO作為細 胞毒性陰性對照，37t:細胞培養箱培養4小時；取試劑盒中WST-8混 合溶液儲存液100iU，在稀釋瓶中用900" 1 lmol/L PIPES進行稀 釋至lml，然後將稀釋瓶中溶液每孔10ul加入細胞培養板，37'C培 養箱培養3小時；當觀察到顯色反應後，每孔加入10u110。/。 (W/V) 十二垸基磺酸鈉終止反應，酶標儀上450nm、 490nm雙波長檢測光吸 收度。每個孔做三個重複，將不含細胞和毒性待測樣本HEPES，只加 入培養基和試劑的孔作為空白對照孔，含有細胞的培養基和試劑，但 不加毒性待測樣本HEPES的孔作為陽性對照孔。
實驗結果顯微鏡下觀察到加入DMSO作為細胞毒性陰性對照的 孔中，細胞全部死亡，而不加毒性待測樣本HEPES的陽性對照孔中，細胞生長狀態良好。分析試劑盒檢測數據，陰性對照孔檢測平均值為
0.051，空白對照平均值為0.021，陽性對照平均值為1.654，實驗數 據與顯微觀察結果相一致。本實驗檢測的HEPES溶液在不同濃度下， 檢測數據讀數平均值為1.398，對細胞無毒性，能用於生物緩衝液的 配置。
所述的PMS採用市售1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯 (l一Methoxy PMS)。
權利要求
1、一種細胞活力檢測試劑盒，其特徵在於由WST-8混合溶液儲存液、反應終止液、緩衝稀釋液組成，其中WST-8混合溶液儲存液包含有50mmol/L WST-8溶液、2mmol/L PMS和1mol/L PIPES緩衝液；反應終止液為10％(W/V)十二烷基磺酸鈉；緩衝稀釋液為1mol/L PIPES溶液。
2、 權利要求1所述的細胞活力檢測試劑盒的製備方法，其特徵 在於(1) lmol/L PIPES緩衝液的配置按配比稱取PIPES自由酸，溶解於去離子水中，用Na0H調節PH 至6.9，加去離子水定容至lmol/L，微孔濾器過濾除菌，4'C保存備 用；(2) WST-8混合儲存液的配置按配比分別稱取WST-8粉末，PMS粉末，溶解於lmol/L PIPES緩 衝液中，混合均勻，微孔濾器過濾除菌，4'C避光保存；(3) 反應終止液的配置按配比稱取十二烷基磺酸鈉溶解於去離子水中，攪拌均勻，配置 成10% (W/V)的十二烷基磺酸鈉溶液，4'C保存備用；(4) 試劑盒的組裝過程將上述配置的溶液，以10ml、 100ml或500ml規格無菌操作分 裝於試劑瓶中，組成細胞活力檢測試劑盒；其中WST-8混合溶液儲存液包含有50 mmol/L WST-8溶液、2 mmol/L PMS和lmol/L PIPES緩衝液；反應終止液為10% (W/V)十二 烷基磺酸鈉；緩衝稀釋液為lmol/L PIPES溶液。
3、 根據權利要求1或2所述的細胞活力檢測試劑盒，其特徵在 於所述的WST-8為2- (2-甲氧基-4-硝基苯基)-3- (4-硝基苯基) -5- (2， 4-二磺酸苯)-2h-四唑單鈉鹽。
4、 權利要求1或2所述的細胞活力檢測試劑盒應用於活細胞計 數、細胞增殖和細胞毒性的檢測。
5、 根據權利要求4所述的細胞活力檢測試劑盒應用於活細胞計 數、細胞增殖的檢測使用流程(1) 取生長狀態良好的細胞製備成一定細胞濃度懸液，每孔 100ul加入96孔細胞培養板中，如果是貼壁細胞，需要37。C培養箱 進行預培養2-4小時，如果是懸浮細胞，則不需要預培養；(2) 將試劑盒中WST-8混合溶液儲存液按照需要用量，在稀釋瓶 中使用lmol/L PIPES進行l: IO稀釋，備用；(3) 將稀釋瓶中的溶液按照每孔10 u 1加入96孔細胞培養板， 37'C培養箱培養1-4小時；(4) 顯色反應後，加入10% (W/V)十二烷基磺酸鈉每孔10ul 終止反應，酶標儀上450-490nm測光吸收度，每份樣本做三個重複孔， 將不含細胞，只加入培養基和試劑的孔作為空白對照孔，所測每孔的 吸光度0D值可間接反應每孔中的細胞數，以一組細胞數梯度為X軸， 吸光度OD值為Y軸，作回歸曲線，可根據OD值推算每孔細胞數。
6、根據權利要求4所述的細胞活力檢測試劑盒應用於活細毒性的檢測使用流程(1) 取生長狀態良好的細胞製備成一定細胞濃度懸液，每孔100ul加入96孔細胞培養板中，如果是貼壁細胞，需要37。C培養箱 進行預培養2-4小時，如果是懸浮細胞，則不需要預培養；(2) 加入不同濃度的毒性物質，37'C培養箱進行培養，時間根據 毒性物質的性質和細胞的敏感性確定；(3) 將試劑盒中WST-8混合溶液儲存液按照需要用量，在稀釋瓶 中使用lmol/L PIPES進行l: IO稀釋，備用；(4) 將稀釋瓶中的溶液按照每孔10u 1加入96孔細胞培養板， 37'C培養箱培養1-4小時；(5) 顯色反應後，加入10% (W/V)十二烷基磺酸鈉每孔10ul 終止反應，酶標儀上450-490nm測光吸收度，每份樣本做三個重複實 驗孔As，將不含細胞和毒性物質，只加入培養基和試劑的孔作為空 白對照孔Ab;含有細胞的培養基和試劑，但不加毒性物質的孔作為 陽性對照孔Ac;按照細胞存活率公式細胞存活率(％) =[ (As-Ab) / (Ac- Ab) ]xlO(m計算出細胞存活率，按照細胞存活率反應出被檢 測物質的細胞毒性。
全文摘要
本發明涉及的是一種細胞活力檢測試劑盒及其製備方法、應用。用於活細胞計數，直接檢測細胞增殖的測定方法，也是一種評價藥物、多肽生長因子等物質細胞毒性的檢測方法，適用於細胞培養板中培養的懸浮和貼壁細胞的檢測。由WST-8混合溶液儲存液、反應終止液、緩衝稀釋液組成，其中WST-8混合溶液儲存液包含有50mmol/L WST-8溶液、2mmol/L PMS和1mol/L PIPES緩衝液；反應終止液為10％(W/V)十二烷基磺酸鈉；緩衝稀釋液為1mol/L PIPES溶液。
文檔編號G01N21/31GK101551382SQ20091002654
公開日2009年10月7日 申請日期2009年5月12日 優先權日2009年5月12日
發明者季紅峰, 忠 李 申請人:鎮江旋光生化有限公司