DNA重組酶Cre基因的改造、重組蛋白表達方法及應用的製作方法

2023-09-09 15:38:45 1

專利名稱：DNA重組酶Cre基因的改造、重組蛋白表達方法及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程，具體地說，涉及Cre重組酶突變體的構建及在胰島beta細胞標記中的應用。
背景技術：
成年胰腺中存在一種自發的再生現象。研究發現，胰腺beta細胞在正常生理狀態下，不斷進行著低水平分裂和死亡。在一些特殊生理(如肥胖、妊娠、胰島素阻抗)和病理 (如胰腺損傷、毒素作用)壓力下，胰腺細胞包括beta細胞都會有一定程度的再生。通過研究各種胰腺再生動物模型(如注射連脲黴素、胰管結紮、胰腺部分切除)，一些觀點認為新生的beta細胞由胰腺祖細胞分裂分化而來。這一結論與形態學上的研究相一致，許多新生的胰島或胰島素陽性細胞與胰管結構密切相關，因此，一部分胰管細胞有可能是腺祖細胞。然而，另外一些研究，利用可誘導的Cre-1oxP系統，特異性地將beta細胞標記上鹼性磷酸酶。 這些譜系追蹤研究表明新生beta細胞是從已有的beta細胞通過分裂而形成的。目前在新生beta細胞的來源及其再生機制上都有嚴重分歧，很大部分原因是目前的細胞標記技術可能存在一些缺陷，從而也就無法確定beta細胞再生的來源。
目前已建立了多種細胞標記與追蹤技術，如螢光染料PKH26和Dil可以通過疏水作用插入到細胞膜的脂雙層，實現對細胞膜的標記；核苷類似物5-溴脫氧尿嘧啶核苷 (BrdU)，可以插入分裂細胞的基因組，然後通過抗BrdU抗體加以檢測；報告基因GFP、β半乳糖苷酶、螢光素酶等被廣泛應用於細胞標記。為實現對細胞的永久性標記則需要改變基因組的結構，如利用慢病毒將報告基因插入染色體。目前最常見的是利用Cre-1oxP系統進行永久性基因組DNA改變，並實現細胞的標記。
Cre是一種來源於卩遼菌體Pl的重組酶,其名稱來源於Causes of recombination, 屬於λ整合酶超基因 家族。Cre基因的表達產物為343個胺基酸的單聚體蛋白，分子量為 38kDa,能對兩個特異位點(IoxP)之間的DNA序列進行重組。整合酶家族重組酶的共同特點是這些酶均由單個多肽構成，作用於核苷酸序列時，不需要其它輔助因子的參與，也不額外消耗能量。
LoxP (locus of X-over Pl)序列來源於Pl卩遼菌體，由兩個13bp反向重複序列和 8bp中間間隔序列共同組成，8bp的間隔序列同時也確定了 LoxP的方向。Cre在催化DNA鏈交換過程中與DNA共價結合，13bp的反向重複序列是Cre酶的結合域。其序列如下5』 - ATAACTTCGTATA - ATGTATGC - TATACGAAGTTAT - 3』3』 - TATTGAAGCATAT - TACATACG - ATATGCTTCAATA - 5』兩個LoxP之間的方向和位置可以決定重組後的三種結果刪除、翻轉、或整合。如果兩個Loxp位點同向且位於一條DNA鏈上，那麼Cre重組酶將切除它們之間的序列；如果這兩個Loxp位點反向位於一條DNA鏈上,它們之間的序列方向發生倒轉；如果LoxP位點位於不同的DNA鏈，兩條DNA鏈將通過LoxP位點進行整合。
在胰腺發育研究中，Melton實驗室採用基於Cre-1oxP重組系統的轉基因小鼠以標記胰島beta細胞。這個系統需要構建兩個品系轉基因小鼠，一個攜帶了融合了突變型雌激素受體(ER)的重組酶CreER，由胰島素啟動子控制其表達，在沒有誘導物時，重組酶定位在胞眾中，如加入Tamoxifen, CreER則進入細胞核；另一個品系攜帶由組成型啟動子(CMV) 控制的一段終止序列和報告基因，在終止序列前後有兩個同向IoxP位點。在無Cre酶存在的情況下，報告基因因終止序列的存在而不能表達。當兩個品系的小鼠雜交，其後代小鼠的 beta細胞表達重組酶CreER,在誘導物Tamoxifen的作用下，CreER進入細胞核，並切除兩個IoxP位點之間的終止序列，報告基因得以表達，實現beta的永久標記，即無論被標記的 beta細胞表型如何變化，報告基因始終表達。Melton研究組利用該項技術發現，生理條件下及病理條件下新產生的beta細胞來自已有的beta細胞的分裂，而不是來自胰腺幹細胞的分化。
但是這個系統有幾項缺陷，一是對實驗條件要求高，需要構建兩個轉基因小鼠品系；二是只能實現一種細胞的標記，如前述實驗中只標記胰島素陽性細胞，而不標記胰島素陰性細胞，因而無法直接地明確回答新生beta細胞是否也有來自胰腺幹細胞的分化；三是CreER的誘導並非絕對特異，即在沒有加入誘導物時，也會有少量的重組酶進入細胞核， 這也許是其他研究組利用同樣的技術卻得到不同的結論的原因；四是RIP的組織特異性在 Cre酶的放大作用下有所減弱，詳細情況將在後面實驗部分敘述。
由於目前的的Cre-LoxP系統在進行組織特異性標記時(如胰島beta細胞)，具有費時費力，及產生非特異性等特點，因此，本發明旨在通過改造Cre重組酶，增強RIP的組織特異性，並構建一個雙質粒的胰島素陽性細胞的標記系統。發明內容
為解決現有技術的不足之處，本發明的目的在於構建一種酶活性減弱的Cre突變體，從而提高RIP的組織特異性。本發明的另一個目的是提供上述酶活性減弱的Cre突變體的構建方法。本發明的第三個目的是提供DNA重組酶活力減弱的重組蛋白的應用。
本發明的目的是通過如下途徑實現的通過PCR技術，對DNA重組酶Cre的基因進行改造，即將其173位點的精氨酸改變為組氨酸，獲得Cre (R173H)。
本發明對DNA重組酶Cre的基因進行改造，其所述Cre (R173H)突變體173位點組氨酸的核苷酸序列為CGT。
本發明對DNA重組酶Cre的基因進行改造，按如下步驟進行i·根據Cre重組酶173位點的核苷酸序列合成兩條單鏈寡核苷酸作為PCR用引物，ii·以 pRIP-Cre 為模板，PCR 採用 TAKARA 試劑盒 PrimStar Mix ；ii1.將PCR產物自連，轉染感受態菌株T0P10，擴增並提取質粒，獲得點突變的 pRIP-Cre (R173H);經測序鑑定後轉染胰島beta細胞NIT-1。
本發明對DNA重組酶Cre進行二次基因改造，其特徵在於所述點突變PCR引物核苷酸序列為前引物 5' -AACACCCTGTTACATATAGCCGAAATT-3'，後引物 5' -ATAAGCAATCCCCAGAAATGCCA-3'本發明進一步提供用作細胞標記的報告載體。
具體地，本發明提供一個選擇性表達報告基因DsRed或EGFP的載體。其特徵在於包括如下步驟採用限制性酶切技術分別獲得CMV啟動子、dsRed和EGFP序列元件；通過寡聚核苷酸合成Cre酶的作用位點IoxP ;採用亞克隆技術將上述各元件組裝成一個細胞標記載體，所述載體具有如下順序排列的原件CMV-loxP2-DsRed-loxP-EGFP。
進一步地，本發明將上述胰島細胞標記系統，即pRIP-Cre (R173H)和 pCMV-loxP-DsRed-loxP-EGFP,轉入Ad293和NIT-1細胞，48小時後檢測細胞標記情況。經螢光顯微鏡檢測，約30%的Ad293細胞呈現紅色螢光，無細胞呈現綠色螢光；約10%的NIT-1 細胞呈現紅色螢光，其中的50%的細胞還同時呈現綠色螢光。上述結果證實胰島細胞標記質粒有效地標記了胰島素陽性細胞，即NIT-1細胞，但不標記胰島素陰性細胞，即Ad293細胞。
本發明與現有技術相比，具有如下優點和有益效果將pRIP-Cre和 pCMV-loxP-DsRed-loxP-EGFP轉入Ad293細胞，48小時後呈現綠色螢光的細胞約佔呈現紅色螢光的細胞的40%。因此，本發明首次在真核細胞中採用雙質粒實現胰島素陽性細胞的標記與追蹤，為研究胰島發育與beta細胞特異性基因治療方案的研製奠定了基礎。


圖1為本發明DNA重組酶Cre突變體Cre(R173H)的構建方案圖。
圖2為本發明點突變PCR電泳鑑定結果圖。
圖3為本發明pCMV-loxP-DsRed-loxP-EGFP的構建方案圖。
圖4為本發明pCMV-loxP-DsRed-loxP-EGFP的電泳鑑定結果圖。
圖5 為本發明用 pRIP-Cre 與 pCMV-loxP-DsRed/loxP-EGFP 共轉染 Ad293 和 NIT-1 細胞細胞48小時後的螢光鑑定圖。a: Ad293細胞紅色螢光照片；b: Ad293細胞綠色螢光照片；c: NIT-1細胞紅色螢光照片；d: NIT-1細胞綠色螢光照片。
圖6 為本發明用 pRIP-Cre 與 pCMV-DsRed/IoxP2-EGFP 共轉染 Ad293 和 NIT-1 細胞48小時後的EGFP陽性細胞與DsRed陽性細胞的比例統計鑑定 7 為本發明用 pRIP-Cre (R173H)與 pCMV-loxP-DsRed/loxP-EGFP 共轉染 Ad293 和NIT-1細胞細胞48小時後的螢光鑑定圖。a: Ad293細胞紅色螢光照片；b: Ad293細胞綠色螢光照片；c: NIT-1細胞紅色螢光照片；d: NIT-1細胞綠色螢光照片。
圖8 為本發明用 pRIP-Cre (R173H)與 pCMV-DsRed/IoxP2-EGFP 共轉染 Ad293 和 NIT-1細胞48小時後的EGFP陽性細胞與DsRed陽性細胞的比例統計鑑定圖。
具體實施方式
下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限於此。
實施例1 Cre突變體的構建。
通過PCR進行Cre的點突變，在後引物中將173位精氨酸的密碼子替換為組氨酸的密碼子，以pRIP-Cre質粒為模板，進行全長質粒的PCR擴增，得到的產物經DpnI消化去除作為底物的PRIP-Cre質粒，PCR產物自連後，轉化E. coli T0P10 (天根公司)感受態細胞，挑取單克隆接種含有抗生素的LB培養基，37° C振蕩培養12小時，質粒提取後經測序鑑定，選取正確pRIP-Cre (R173H)。所述點突變PCR引物核苷酸序列為前引物 5' -AACACCCTGTTACATATAGCCGAAATT-3'，後引物 5' -ATAAGCAATCCCCAGAAATGCCA-3'所述點突變PCR擴增體系為模板(pRIP-Cre) 前引物(10 μΜ) 後引物(10 μΜ)50 ng2x Master Mix ddH2025 μ I 補至50 μ所述點突變PCR擴增條件為94 °C94 °C55 °C72 °C72 °C 3 min (40個循環) 30 s (40個循環) 30 s (40個循環)60 s 5 min hold實施例2用作細胞標記的報告載體的構建。
利用限制性內切酶PacI 和 MluI 切除 pCMV-DsRed-H19-RIP/LoxP2_EGFP (本實驗室已構建)中的H19-RIP的片段，利用NEB公司的T4聚合酶補平末端，然後使載體自連，連接產物轉化E. coli T0P10 (天根公司)感受態細胞，挑取單克隆接種含有抗生素的LB培養基，於37° C振蕩培養12小時，質粒提取後經測序鑑定，選取正確報告載體，即 pCMV-loxP-DsRed-loxP-EGFP。
實施例3胰島素陽性細胞標記載體的功能驗證。
轉染前一天接種Ad293和NIT-1細胞，約16_20小時細胞約鋪滿培養板的70 %面積，且細胞處於對數生長期。於一個0.5 ml離心管中加入0.5 yg的 pRIP-Cre 和 pCMV-loxP-DsRed-loxP-EGFP，或加入 0. 5 yg 的 pRIP-Cre (R173H)和 pCMV-loxP-DsRed-loxP-EGFP,加入無血清培養液將總體積補足至30 μ 1，混勻，加入2. 5 μ I的lipsome。混勻，室溫靜置5-10分鐘，吸去培養板細胞中的培養液，向DNA-1ipsome 複合物中加入100 μ I完全培養液，混勻，馬上加入到細胞。細胞在正常生長條件下培養48 小時，然後於螢光顯微鏡下觀察並統計呈現紅色螢光及綠色螢光的細胞比例。
雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的，因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬於本發明要求保護的範圍。
<110〉汕頭大學
DNA重組酶Cre突變體的構建及應用262Patent In Version 3.215779
權利要求
1.一種DNA重組酶活力減弱的重組蛋白，其特徵在於所述重組蛋白是對DNA酶重組酶Cre的胺基酸序列進行改造，將其173位點的精氨酸改造成組氨酸。
2.根據權利要求1所述的DNA重組酶活力減弱的重組蛋白，其特徵在於所述重組蛋白173位點組氨酸的核苷酸序列為CGT。
3.根據權利要求2所述的DNA重組酶活力減弱的重組蛋白的表達方法，其特徵在於按如下步驟進行i ·根據Cre重組酶173位點的核苷酸序列合成兩條單鏈寡核苷酸作為PCR用引物， 以pRIP-Cre為模板； ·將PCR產物自連，轉染感受態菌株Τ0Ρ10，擴增並提取質粒，獲得點突變的 pRIP-Cre (R173H)；ii1.經測序鑑定後轉染胰島beta細胞NIT-1。
4.根據權利要求3所述的DNA重組酶活力減弱的重組蛋白的表達方法，其特徵在於 所述點突變PCR引物核苷酸序列為前引物 5' -AACACCCTGTTACATATAGCCGAAATT-3'，後引物 5' -ATAAGCAATCCCCAGAAATGCCA-3'。
5.權利要求3所述的DNA重組酶活力減弱的重組蛋白在胰島beta細胞標記中的應用。
全文摘要
本發明涉及DNA重組酶Cre胺基酸序列的改造和應用，其是通過點突變技術將Cre基因第173位的精氨酸改變為組氨酸，上述Cre突變體由一個大鼠胰島素啟動子(RIP)控制其在胰島beta細胞中的表達。另外，本發明對Cre突變體在胰島beta標記中的應用進行了初步研究，利用Cre突變體及其作用位點loxP、CMV啟動子、綠色螢光報告基因(EGFP)、及紅色螢光報告基因(DsRed)，組裝成一個雙質粒的胰島素陽性細胞的標記系統。
文檔編號C12N15/63GK103013934SQ201110297620
公開日2013年4月3日 申請日期2011年9月27日 優先權日2011年9月27日
發明者魏熾炬, 範文竹, 李迪崢 申請人:汕頭大學