芹菜素在製備預防和治療腎臟纖維化的藥物中的用途的製作方法
2023-09-12 20:15:05 4
本發明涉及醫藥領域，特別涉及芹菜素在製備預防和治療腎臟纖維化的藥物中的用途。
背景技術：
：腎纖維化是所有腎臟疾病發展到終末期腎衰竭的共同變化，所有慢性腎臟疾病最終可發展為腎臟纖維化。其主要發病機制為：腎臟纖維化過程中，細胞變化會激活成纖維細胞及繫膜細胞，促使T淋巴細胞、單核細胞或巨噬細胞發生浸潤以及小管上皮細胞向繫膜質細胞的轉變(EMT)。多種浸潤細胞和自身細胞相互影響，共同參與腎臟纖維化的形成過程。當腎臟受損後，其組織會發生一系列修復反應，產生大量ECM，而激活產生的ECM效應細胞通常被是腎臟纖維化的核心。ECM持續性沉積通過形成纖維瘢痕，破壞正常腎組織，導致腎實質塌陷、腎功能喪失。分子機制腎主要包括4個階段:①細胞的活化與損傷，由炎症損傷所致的腎小管上皮細胞的活化及腎間質中單核細胞或巨噬細胞的浸潤；②生長因子、細胞因子、趨化黏附因子及血管活性因子等促纖維化因子的釋放；③纖維化的形成，主要表現為基質蛋白降解減少、合成增多，腎間質出現沉積；④腎結構和功能受到損傷，此階段，腎小管周圍毛細血管出現堵塞，有效腎單位急劇減少，且腎小球過濾明顯降低。目前，臨床上主要通過控制加劇腎功能惡化的危險因素的方法來治療腎臟纖維化。主要包括：1.TGF-β阻滯劑或拮抗劑：研究表明一種小型富含亮氨酸的蛋白多糖，Decorin(DCN)通過直接阻止TGF-β1生物活性來調整膠原的原纖維生成，顯著減少尿蛋白，緩解ECM沉積，有效抑制腎臟纖維化形成。2.血管緊張素轉換酶抑制劑與血管緊張素2受體阻滯劑：此類藥物可改善腎功能，減輕腎間質纖維化。其機制可能與腎臟組織中TGF-β1信號蛋白Smad2/3活性受到抑制有關。3.酪氨酸激酶特異性受體阻滯劑：PDGF酪氨酸激酶受體阻滯劑AG1295能抑制PDGF酪氨酸激酶受體，減少成纖維細胞及巨噬細胞的數量，降低纖連蛋白的表達，從而阻止腎臟纖維化。4.基因治療:目前，基因治療腎臟疾病主要採用反義技術，即連接特異性反義基因與表達載體，導入靶細胞後對反義RNA進行轉錄，而後者通過與其相應mRNA形成雙鏈來抑制mRNA翻譯，從而發揮治療作用。研究發現TGF-β1反義寡脫氧核苷酸，導入腎間質成纖維細胞，單側輸尿管阻塞的大鼠腎臟纖維化明顯改善。克老素(KL)基因表達上調能減輕糖尿病腎肥大，保護腎臟功能，延緩纖維化進程。基因治療腎臟纖維化前景開闊，但目前尚缺少有效的方法向人體腎臟進行基因轉導。5.膠原合成抑制物，抑制賴氨醯氧化酶和脯氨醯4-羥化酶活性及膠原轉錄後的進程能有效緩解腎臟纖維化。己酮可可鹼、己可可鹼、γ-幹擾素等藥物也可降低纖連蛋白的合成及α-SMA表達，抑制膠原合成及腎纖維細胞的增殖，從而阻止腎臟發生纖維化。6.中藥治療：近年來，中藥治療慢性腎臟纖維化的研究越來越受到人們的關注，其中研究最多的為大黃、黃芪、丹參等藥。大黃素通過抑制腎臟固有細胞的異常變化及利尿作用來發揮保護腎臟的作用。丹參具有抗氧化、清除自由基的功效，可增加c-myc蛋白表達，抑制腎成纖維細胞增殖，誘導細胞凋亡，改善腎間質纖維化。黃芪甲苷通過使腎小管及間質單核細胞趨惡化因子蛋白I表達下調來緩解腎缺血-再灌注損傷所致大鼠腎臟的長期損害。7.終末期腎病可選擇血液、腹膜透析或移植，進而延長患者生命，但終未解決根本問題。患者預後改善並不顯著。因此，尋找能有效延緩腎功能不全進展的藥物，有效防治腎臟纖維化成為腎內科醫生面臨的一個重要難題，及早阻止甚至逆轉腎纖維化對防治終末期腎衰竭有重大意義。芹菜素是一種黃酮類化合物，又稱芹黃素、洋芹素，廣泛分布於溫熱帶的蔬菜和水果中，尤以芹菜中含量為高，既往研究表明，芹菜素具有多種生物學作用，如降血壓、擴張血管、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒等。但芹菜素用於治療腎臟纖維化，國內外文獻均未見報導。技術實現要素：發明的目的是提供一種芹菜素在製備預防和治療腎臟纖維化的藥物中的用途。該藥物用於纖維化前期的治療，改善腎臟纖維化進展，且無明顯的不良反應，安全、毒副作用小，特別適合纖維化前期患者。本發明的技術方案是：芹菜素在製備預防和治療腎臟纖維化的藥物中的用途。所述芹菜素通過激活TRPV4通道，增肌細胞內Ca2+內流。所述芹菜素通過TRPV4介導的Ca2+內流，激活AMPK/SITR1信號通路，抑制腎臟纖維化。所述藥物的用量為每公斤體重每天150-300mg。本發明所述芹菜素與藥用載體或賦形劑組成用於預防和治療腎臟纖維化的藥物組合物，其中芹菜素為預防和治療腎臟纖維化的有效劑量。本發明所述芹菜素(apigenin)的分子式為C15H10O5，其分子量為270.24，化學式為4',5,7-三羥基黃酮(5,7-Dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-one).其結構式為：本發明具有以下有益效果：所以藥物的有效成分——芹菜素為植物來源的天然化合物，非人工合成，無明顯毒副作用、安全有效。該藥物能改善腎臟纖維化，特別適合腎臟纖維化患者和用於治療腎損害，效果尤其明顯。經實驗驗證，本發明所述藥物用於預防、治療腎臟纖維化，能延緩腎臟纖維化進程，且無明顯的不良反應。附圖說明圖1為腎臟HE染色，膳食芹菜素減輕大鼠腎臟腎小球硬化指數，其中，a，b，c和d分別為普食組，芹菜素組，DOCA(醋酸皮質酮)組和DOCA加芹菜素組示意圖，e為統計圖；圖2為PAS糖原染色，芹菜素膳食減少腎臟膠原纖維，其中，a，b，c，d和e分別所示為普食組，芹菜素組，DOCA(醋酸皮質酮)組和DOCA加芹菜素組；圖3為Masson染色，膳食芹菜素減少腎臟纖維化產生，其中，a，b，c，d和e分別所示為普食組，芹菜素組，DOCA(醋酸皮質酮)組和DOCA加芹菜素組；圖4為膳食芹菜素改善DOCA所致腎臟形態增大，其中，a，b，c，d和e分別所示為普食組，芹菜素組，DOCA(醋酸皮質酮)組和DOCA加芹菜素組；圖5為膳食芹菜素減少DOCA所致腎臟重量及腎臟/體重比值增大。a為腎臟重量，b為腎臟重量比體重；圖6為膳食芹菜素降低DOCA所致的尿蛋白增加，增加肌酐清除率，其中，a為肌酐清除率，b為尿微量白蛋白；圖7為免疫螢光染色，TRPV4可以定位於大鼠腎小球；圖8為PTI鈣螢光比率測定，芹菜素可以增加細胞Ca2+內流的，其中a為螢光比率示意圖，b為統計圖；圖9為膜片鉗單通道檢測，芹菜素激活HBZY-1腎小球繫膜細胞上表達的特異性TRPV4通道，其中，a為電壓依賴示意圖，b為TRPV4通道電導圖；圖10為蛋白免疫印跡，醛固酮加高鹽刺激能使SIRT1和p-AMPK表達下降，芹菜素能逆轉這一效應，其中，a為蛋白免疫印跡示意圖，b為SIRT1統計圖，c為p-AMPK統計圖；圖11為蛋白免疫印跡，芹菜素使SIRT1和p-AMPK表達增加，而EDTA可以抑制芹菜素這一效應，說明芹菜素該效應主要是通過TRPV4介導的Ca2+內流起作用，其中，a為蛋白免疫印跡示意圖，b為p-AMPK統計圖，c為SIRT1統計圖；圖12為蛋白免疫印跡，芹菜素抑制腎臟纖維化進程能夠被EX-527(SIRT1特異性抑制劑)逆轉，提示明芹菜素通過TRPV4介導的Ca2+內流可以激活AMPK/SITR1信號通路。其中，a為蛋白免疫印跡示意圖，b為TRPV4統計圖，c為p-AMPK統計圖，d為SIRT1統計圖；圖13芹菜素抑制腎臟纖維化進程的機製圖。具體實施方式主要儀器和試劑1.大鼠，購自第三軍醫大學大坪醫院動物實驗中心；2.芹菜素(98％純度，杭州天草科技有限公司，中國)3.醋酸脫氧皮質酮(Sigma公司，美國)4.烏拉坦(國藥集團化學試劑有限公司)；5.鹽酸(重慶川江化學試劑廠)6.甲醛(成都科龍化工試劑廠)7.harris蘇木素染液(北京中杉生物技術公司)8.碳酸鋰(生工生物工程有限公司)9.鹽酸(重慶川江化學試劑廠)10.二甲苯(成都科龍化工試劑廠)11.水性伊紅染液(北京中杉生物技術公司)12.中性樹膠(中國上海標本模型廠)13.去離子水過濾器(Millipore，德國)14.倒置相差顯微鏡(Nikon公司，日本)15.冰凍切片機(Leica公司，德國)16.電子天平(CAV31020，美國)17.比率螢光成像系統(PTI104B，PTI公司，美國)28.HEKAEPC-10膜片鉗系統(HEKA公司，德國)本發明的整個機制如圖13所示。實施例1DOCA-鹽致腎臟纖維化動物模型1.DOCA-鹽致腎臟纖維化動物模型：健康雄性2月齡SD大鼠24隻(由第三軍醫大學大坪醫院動物實驗中心提供)，體重250g～300g，鼠分籠餵養，自由進食飲水。自然晝夜採光，室溫18℃-26℃，每日早晚餵食，隔日換水。溼度50％左右。手術前適應性飼養1周，然後行左側腎臟摘除術。大鼠稱重後腹腔注射10％的烏拉坦溶液麻醉(1m1/kg)，然後背部術區剪毛，俯臥位固定於手術板上，嚴格消毒後於脊柱左側、第十二肋下緣作一長約2cm的切口，分離肌肉，游離腎包膜，暴露左腎，緊貼腎門處結紮腎動、靜脈，切除左側腎臟，清除淤血後縫合肌肉層和皮膚。2.術後給予青黴素鈉腹腔注射3天，1周後將大鼠隨機分成4組：第一組為對照組(Cont組，n＝6)，皮下注射植物油，飼飲自來水；第二組為芹菜素組(Api組，n＝6)，皮下注射植物油，飼飲自來水，餵食含0.2％芹菜素的飼料；第三組為DOCA組(n＝6)，每周皮下注射DOCA油劑(11-去氧皮質酮三甲基醋酸)(40mg/kg)一次，飼飲水含有10g/L的NaC1和2g/L的KC1；第四組為DOCA+芹菜素組(DOCA+Api組，n＝6)，每周皮下注射DOCA油劑(40mg/kg)一次，飼飲水含有10g/L的NaC1和2g/L的KC1，餵食含0.2％芹菜素的飼料。術後幹預時間4周，期間每周測一次體重。按照分組情況，分別配製普通飼料和芹菜素飼料。飼料配方如下：普通飼料，脂肪10％，蛋白質22％，碳水化合物68％。飼料中各成分所佔比例(％)普辣飼料中芹菜素的添加方法為每100g普通飼料中加入0.2g的芹菜素。實施例2動物實驗1.體重的測定：普通稱量法。2.尿白蛋白和肌酐測定，其結果如圖6所示。2.124小時尿標本的採集飲食幹預結束後，清晨將大鼠置於代謝籠中，分籠餵養，每籠1隻，禁食，自由飲水。自然晝夜採光，室溫18℃-26℃，溼度50％左右。專人添加飼料，每日定時用天平稱取飼料重量，計算每日每隻大鼠進食量。收集24小時尿量，4000r/min，常溫下離心10min後，-70℃冰箱保存備用。2.2試劑配製、使用方法和保存Alb.標準品：各標準品分別準確加入0.5ml緩衝液溶解，溶解15分鐘後搖勻。溶解後其濃度分別為1、2、5、10、20、50μg/ml。保存於4℃冰箱。125I-Alb.：將全部樣品用10ml緩衝液溶解，保存於4℃冰箱。兔抗-ALB.抗體：用緩衝液溶解，保存於4℃冰箱。2.3取圓底聚苯乙烯試管若干，用記號筆編號NSB、S1-S6和待測樣品管等，然後用微量取樣器加樣。充分搖勻後，室溫放置15分鐘，3500轉/分鐘離心15分鐘，吸棄上清，測各沉澱管的放射性計數(cpm)3.腎臟重量的測量和腎臟/體重比值的計算，其結果如圖5所示。飲食幹預結束後，動物禁食12小時。將動物稱重，10％烏拉坦溶液液(0.1ml/10g小鼠體重)腹腔注射麻醉，處死大鼠並取材。大鼠處死後濾幹水分後腎臟稱重。腎臟/體重比值＝KW(g)/BW(g)×100％；KW為腎臟重量，BW為體重。4.組織切片染色，其結果如圖1，圖2，圖3和圖4所示。4.1石蠟切片4.1.1已取材的腎臟用濾紙片吸乾水分。4.1.2取出組織支承器，滴上包埋劑讓其冷凍，形成一個小臺後，再放上細小組織，滴上包埋劑，速放於冷凍臺上，-20℃冰凍1小時。4.1.3將冷凍好的組織塊，夾緊於切片機持承器上，啟動粗進退鍵，轉動旋鈕，將組織修平。4.1.4調好厚度至10um，調好防卷板。4.1.5切片。4.1.6固定標本1小時。4.2HE染色4.2.1切片蘇木精染色10min，自來水衝洗，3次。4.2.21％鹽酸酒精分化，自來水衝洗，3次。4.2.3稀碳酸鋰水溶液中促藍，自來水衝洗，3次。4.2.4伊紅5min。4.2.5入80％乙醇1次，數秒。4.2.6入95％乙醇一次，數秒。4.2.7入無水乙醇三次，每次1min。4.2.8入二甲苯兩次，每次5min。4.2.9晾乾，中性樹膠封片。4.3腎小球硬化指數(Glomerulosclerosisindex，GSI)腎小球硬化指數(GSI)採用半定量計分法評估，放大倍數為200。每個腎取20個視野進行檢查，評分標準為：沒有變化，被評為0分；病變涉及25％腎小球，被評為1分；病變涉及25％至50％腎小球，評為2分；病變涉及50％以上腎小球，評為3分。每個動物的腎小球硬化指數為平均每個視野的平均得分。所有評分有2位實驗者獨立檢測。4.4糖原(PAS)染色4.4.1石蠟切片脫蠟至水(細胞塗片，冰凍切片直接水洗)4.4.2蒸餾水洗4.4.3過碘酸酒清夜10min4.4.4自來水衝洗10min4.4.5Schiff氏液10min4.4.6流水衝洗5min4.4.7用哈瑞蘇木精或邁耶蘇木精染核3min(細胞核染色過深可用鹽酸酒精分化)4.4.8流水衝洗5min4.4.9常規脫水、透明、封固4.5Masson染色4.5.1組織固定,切片,脫蠟至水.4.5.2Masson複合染色液5分鐘.4.5.30.2％醋酸水溶液稍洗.4.5.45％磷鉬酸5～10分鐘.4.5.50.2％醋酸水溶液浸洗2次.4.5.6亮綠染色液5分鐘,0.2％醋酸水溶液洗2次.4.5.7無水乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片.5.免疫螢光染色，其結果如圖7所示。5.1將腎臟組織埋於冰凍包埋劑。5.2冰凍切片機將組織切成厚度為4-6μm，並將其吸附於蓋玻片上。5.3將組織浸泡在10％中性甲醛溶液(甲醛用0.1MPBS溶液稀釋10倍)中，固定40-60min。5.4在雙氧水甲醇溶液(雙氧水：甲醇＝1：50)中浸泡30min，以去除組織內源性過氧化物。5.5蒸餾水清洗2遍後，用5％牛血清封閉20min。5.6加1：200稀釋的兔抗小鼠TRPV4抗體，室溫2h或4℃過夜。PBS洗3次，每次5min。5.7加1：200稀釋的TRITC標記二抗(抗兔)，室溫避光染30min。PBS洗3次，每次5min。5.8在TE2000-U倒置螢光顯微鏡下觀察，結合NIS-Elements成像軟體照相和分析。實施例3分子實驗1.蛋白免疫印跡，其結果如圖10，圖11和圖12所示。1.1組織和細胞總蛋白提取方法1.1.1取100mg組織加入適量預冷的RIPA裂解液(蛋白質勻漿緩衝液1ml加PMSF50ug，Leuptin5ug)，勻漿機勻漿，收集勻漿液於1.5ml的離心管中；如為細胞樣品，則將適量裂解液直接加入到培養瓶或六孔板中，用細胞刮刀收集細胞。1.1.2-20℃放置20min以沉澱蛋白。1.1.34℃12000rpm離心20min，收集上清液即組織蛋白，用於蛋白定量及免疫印跡實驗，或者於-70℃凍存備用。1.1.4蛋白定量方法(Bradford法)1.1.5蛋白標準液的配製：用雙蒸水配製1mg/ml的牛血清白蛋白作為濃縮標準液，按下表加樣製作標準曲線。管號12345濃縮標準液ul05102080H20ul807570600蛋白定量試劑ml333331.1.6上述試劑加完後，混勻，室溫靜置3min，以空白管調零，用BeckmanDU-640分光光度計在595nmol/L處讀取各管的吸光光度值。1.1.7在乾淨試管中加入1ml蛋白定量試劑，準確吸取2ul待測蛋白樣品或蒸餾水(空白對照)加入試管中(即1:500稀釋)，混勻後比色，記錄各樣品的濃度。1.1.8取500ug樣品於乾淨EP管中，用蛋白加樣緩衝液定容至200ul，混勻，置於沸水中變性6分鐘。4℃保存，Westernblot上樣備用。1.2蛋白免疫印跡操作步驟1.2.1灌制聚丙烯凝膠：先灌下層的分離膠(檢測不同分子量的蛋白，分離膠濃度不同)，再灌上層的4％濃縮膠，然後上樣，每孔上樣量為50ug，每個樣本至少上二塊平行膠；1.2.2蛋白電泳：電泳電壓濃縮膠為90V，分離膠為140V，電泳液為甘氨酸緩衝液；1.2.3轉膜：電泳結束後，將凝膠與大小相同的PVDF膜(事先用95％乙醇固定)置於上下各三層濾紙中間，置入轉移槽，加滿轉移液，4℃95mA電泳轉膜14h左右；1.2.4封閉：取出PVDF膜，自然晾乾後，置於95％乙醇中固定；0.01mol/LPBST洗15min×3次；5％脫脂奶粉中封閉非特異性蛋白，37℃搖床中封閉約4h；1.2.5抗原抗體反應：分別加一抗和內參照β-actin抗體(用PBST稀釋成1：1000的濃度)，37℃搖床中結合3～4h或置於4℃過夜，PBST洗15min×3次；加IgG二抗(用PBST稀釋成1：1000)，37℃搖床中結合1～2h，PBST洗15min×3次；1.2.6顯影：將PVDF膜置於化學發光試劑中反應1～3min；在暗室中使X光片曝光，常規方法顯影定影；1.2.7定量：凝膠成像系統掃描分析條帶光密度值(OD值)。計算每個蛋白條帶光密度值與內參照β-actin光密度值的比值，代表各樣品的蛋白表達水平。2.細胞內鈣離子的測定,其結果如圖8所示。2.1接種在六孔板內2×2cm玻片上的HBZY-1腎小球繫膜細胞，測定前去除培養基，用PSS洗兩次；每孔加入1ml含4umol/LFura-2/AM和0.02％PluronicF-127的PSS，於37℃孵箱中避光孵育40min，用PSS洗兩次，去除細胞外殘餘的Fura-2/AM；將負載了Fura-2/AM的細胞玻片置於螢光顯微鏡下(PTI104B)，鈣螢光的激發波長為340nm/380nm，發射波長為510nm；螢光信號經Felix專用軟體處理，以細胞內游離鈣螢光強度F(340nm/510nm)與結合鈣螢光強度F380nm/510nm之比反映細胞內游離鈣濃度([Ca2+]i)的變化，該比值(以F340nm/380nm表示)升高表明[Ca2+]i升高。總記錄時間為300s-600s，系統每秒鐘採集數據1次。2.2先測定基礎狀態下HBZY-1細胞F340nm/380nm，若曲線平穩則說明[Ca2+]i基線穩定，在50s後加不同濃度辣椒素刺激，記錄細胞F340nm/380nm的變化，計算F340nm/380nm曲線的瞬時升高幅度，即(瞬時最高值-基礎值)/基礎值×100％，每種濃度的辣椒素刺激重複3-6次。3.膜片鉗記錄TRPV4通道，其結果如圖9所示。3.1電極內外液的配製Kgluconate140,KCl2.5,MgCl21,HEPES5,EGTA1.5,使用KOH溶液將pH調至7.4，電極液和細胞外液一致。3.2電極的製備根據實驗的目的而設置電極拉制儀的參數，通常情況下，電極分兩步拉制，第一次粗拉制使玻璃管中間拉成一細窄的管狀，第二次將窄細部位拉斷成兩根，其尖端直徑一般為1-5μm，在顯微鏡下觀察時其尖端應光滑而不呈斷裂狀，並用拋光儀對電極進行拋光，電極必須保持清潔，在實驗當日拉制，避免電極尖端有灰塵進入，充入電極內液時電極的電阻在5-10M。3.3電流的記錄我們應用HEKAEPC-10膜片鉗系統，採用細胞粘附式膜片鉗技術記錄被檢測的通道活性，用Clampfit10.0分析所得數據。當電極尖端輕輕壓在細胞膜的表面後，用連接在電極把持器上的注射器輕輕地回吸，而使電極與細胞膜密切接觸形成千兆歐姆封接。該方法是在細胞內成分保持不變的情況下研究離子通道的活動，進行單通道電流的記錄。以上所述僅為本發明的較佳實施例，並非用以限定本發明的實質性技術內容範圍，本發明的實質性技術內容是廣義的定義於申請的權利要求範圍中，他人完成的技術實體或方法，若是與申請的權利要求範圍所定義的完全相同，也或是一種等效的變更，均將被視為涵蓋於該權利要求範圍之中。當前第1頁1 2 3