一組雞Cathelicidins抗菌肽及其製備方法和應用的製作方法

2023-09-13 00:58:15

專利名稱：一組雞Cathelicidins抗菌肽及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域,具體地說涉及一組雞Cathelicidins抗菌肽及其製備方法和應用。
背景技術：
近年來，多種傳染性疾病困擾著我國的養殖業，抗生素自發現以來在預防細菌感染、防治畜禽疾病方面發揮了重要作用，對促進畜牧業生產的快速發展起到了巨大的推動作用，但長期大量使用抗生素類藥物使得病原菌逐步產生耐藥性，為疾病防治工作增加了 難度。同時，抗生素引發的藥物殘留使得動物性食品的安全性問題日益突出，耐藥質粒容易交叉散播傳給人類，給人類健康和疾病的預防與治療帶來威脅，為此，國際社會提出減少抗生素生長促進劑(AGP)使用量或取消某些抗生素的使用。從2006年I月開始，歐盟全面禁止食品動物使用抗生素類促生長飼料添加劑，並於3月成立預防抗生素抗藥性擴大研究網，隨後日本和韓國等發達國家也建立了相應的條例，國際奧委會也要求北京為2008年奧運會提供符合歐盟要求的抗生素含量極低的安全肉食品。尋求抗生素替代品，研製既能有效防控畜禽疾病、促進動物生長，又無毒副作用、無殘留、不易產生耐藥性的綠色獸藥和飼料添加劑，已成為動物營養、食品加工、新獸藥研發等領域內面臨的重大課題。抗菌肽(antimicrobial peptide)是在誘導條件下,動物免疫防禦系統產生的一類對抗外源性病原體致病作用的防禦性肽類活性物質，是宿主免疫防禦系統的一個重要組成部分。抗菌肽具有高效、廣譜的抗菌活性，對革蘭氏陰性菌(G_)、革蘭氏陽性菌(G+)、真菌、原生生物、有被膜的病毒和腫瘤細胞均表現出較強的活性(Jenssen H, et al. PeptideAntimicrobial Agents. Clin Microbiol Rev, 2006，19 (3) :491_511)。而絕大多數抗菌妝對哺乳動物正常細胞無害，具有不同於傳統抗生素的獨特抗菌機制，而且對機體無毒副作用、無殘留，這將為解決細菌對青黴素等傳統抗生素日益增強的耐藥性這一棘手的全球性難題提供新途徑，應用前景十分廣闊。迄今已從包括動物、植物、昆蟲、原核生物等多種生物體內分離、鑑定了千餘種抗菌活性肽，有幾十種抗菌肽已進入臨床試驗或臨床前研究階段。目前在家禽體內已發現了三大類抗菌肽，即防禦素類(Gallinacin)、Cathelicidin類和肝內表達抗菌肽2 (LEAP-2)。從目前相關研究結果來看，雞防禦素在體外對多殺性巴氏桿菌及大腸桿菌、白色念珠菌、腸炎沙門氏菌、空腸彎曲桿菌等均有抑菌作用(Harwig S S，etal. Gallinacins: cysteine-rich antimicrobial peptides of chicken leukocytes. FEBSLett，1994，342(3):281-285;Evans E Wj et al. Antimicrobial activity of chicken andturkey heterophil peptides CHP1，CHP2，THP1，and THP3. Vet Microbiol, 1995，47(3-4):295-303)。
Cathelicidins類抗菌肽是最初被發現於哺乳動物的一類結構多變的抗菌肽，因其在信號肽與成熟肽之間含有一高度保守的Cathelin肽段而自成一家族。Cathelicidins在體外具有強的廣譜抗革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌活性，包括抗生素抗性菌，有的在50%血清和生理鹽濃度下仍有殺菌活性。同防禦素一樣，Cathelicidins抗菌肽也是宿主防禦系統的重要組成部分，但它們通常更耐鹽和溶媒。除了主要的殺滅細菌、真菌和病毒活性外，Cathelicidins還具有對免疫細胞的趨化作用、抑制組織損傷、促進創傷修復、結合內毒素、誘導血管生成等多種生物學功能(Zaiou M, et al. Cathelicidins, essentialgene-encoded mammalian antibiotics. J Mol Med, 2002, 80(9):549-61;RamanathanB, et al. Cathelicidins:microbicidal activity, mechanisms of action, and roles ininnate immunity. Microbes Infect, 2002, 4(3):361-372 ；Carretero M, et al, In vitroand in vivo wound healing-promoting activities of human cathelicidin LL-37.J Invest Dermatol, 2008, 128(1) :223-236.)。由於具有如此廣泛的生物學活性和功能，Cathelicidinds抗菌肽已成為免疫學、分子生物學和生物醫藥領域內的研究熱點，其藥用開發前景十分廣闊。然而，家禽體內天然抗菌肽的含量極低，分子量小，分離純化困難，無法滿足需要。 化學合成與基因工程方法就成為獲得抗菌肽的主要手段，但化學合成抗菌肽成本太高，也難以應用於臨床；因此，通過基因工程的方法在特定宿主內大量表達抗菌肽就成為一條有效的途徑。但由於抗菌肽本身對原核宿主菌有一定的殺傷作用，不適宜在原核系統中直接表達，通常採用融合表達或真核表達等方式。大腸桿菌因其遺傳背景清晰、易於培養、周期短、成本低廉而備受青睞，成為目前應用最為廣泛的外源基因表達宿主之一，多種抗菌多肽通過融合形式在大腸桿菌表達系統中成功表達，產物經處理後可產生抗菌活性。

發明內容
本發明的目的在於提供一組具有很強抗微生物活性的雞抗菌肽Cathelicidinl，3，本發明利用基因工程技術從白來航雞的骨髓組織中克隆出Cathelicidins抗菌肽基因(CathL-1, -3)cDNA片段，並將其成熟肽編碼序列克隆至pET_30a(+)等融合表達載體中，在E. coli Rosetta(DE3)表達菌株中重組表達融合蛋白並對其進行初步鑑定,表達產物以可溶形式存在，不需蛋白酶切割，經親和層析方法即可製備一組具有很強抗微生物活性的雞重組抗菌肽 Cathelicidinl, 3。本發明還公開了該組雞Cathelicidins抗菌肽的胺基酸序列及編碼所述雞Cathelicidins抗菌肽的DNA序列。本發明同時提供了該組雞Cathelicidins抗菌肽的基因工程製備方法和固相化學合成法。本發明還進一步公開了該組雞Cathelicidins重組抗菌肽在製備治療雞細菌感染藥物中的用途。為了實現本發明的目的，本發明提供了如下技術方案本發明提供的一組Cathelicidins抗菌肽,是白來航雞基因編碼的抗菌肽,屬於家禽Cathelicidins抗菌肽家族，它們的這一系列序列被命名為Cathelicidinl，3，其前體蛋白的胺基酸序列(從氨基端至羧基端)如下
Cathelicidinl (SEQ ID NO. 5)Met Leu Ser Cys Trp Val Leu Leu Leu Ala Leu Leu Gly Gly Ala Cys Ala LeuPro Ala Pro Leu Gly TyrSer Gln Ala Leu Ala Gln Ala Val Asp Ser Tyr Asn Gln ArgPro Glu Val Gln Asn Ala Phe Arg Leu LeuSer Ala Asp Pro Glu Pro Gly Pro Asn ValGln Leu Ser Ser Leu His Asn Leu Asn Phe Thr He Met GluThr Arg Cys Gln Ala ArgSer Gly Ala Gln Leu Asp Ser Cys Glu Phe Lys Glu Asp Gly Leu Val Lys AspCys AlaAla Pro Val Val Leu Gln Gly Gly Arg Ala Val Leu Asp Val Thr Cys Val Asp Ser MetAla AspPro Val Arg Val Lys Arg Val Trp Pro Leu Val He Arg Thr Val He Ala GlyTyr Asn Leu Tyr Arg Ala IleLys Lys LysCathelicidin3 (SEQ ID NO. 10)Met Leu Ser Cys Trp Val Leu Leu Leu Ala Leu Leu Gly Gly Ala Cys Ala LeuPro Ala Pro Leu GlyTyr Ser Gln Ala Leu Ala Gln Ala Val Asp Ser Tyr Asn Gln ArgPro Glu Val Gln Asn Ala Phe ArgLeu Leu Ser Ala Asp Pro Glu Pro Gly Pro Asn ValGln Leu Ser Ser Leu His Asn Leu Asn Phe Thr IleMet Glu Thr Arg Cys Gln Ala ArgSer Gly Ala Gln Leu Asp Ser Cys Glu Phe Lys Glu Asp Gly LeuVal Lys Asp Cys Ala Ala Pro Val Val Leu Gln Gly Gly Arg Ala Val Leu Asp Val Thr Cys Val AspSer MetAla Asp Pro Val Arg Val Lys Arg Phe Trp Pro Leu Val Pro Val Ala He Asn Thr ValAla AlaGly He Asn Leu Tyr Lys Ala He Arg Arg Lys雞抗菌妝Cathelicidinl 和 Cathelicidin3,其核苷酸序列分別如 SEQ ID NO. I、和 SEQ ID NO. 6 所述。本發明的一組雞Cathelicidins抗菌肽，其編碼基因cathelicidinl, 3,來自於自成年白來航雞骨髓組織中提取總RNA，經反轉錄合成cDNA第一鏈後，再以cDNA為模板，分別用3對基因特異性引物CathLl P1/P2和CathL3 P1/P2進行PCR，擴增產物即為cathelicidinl, 3cDNA全序列。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳分離並回收目的片段(見圖1)，將目的片段與克隆載體PMD18-T連接並轉化E. coli DH5 α感受態細胞，陽性菌株用Μ13F/R引物測序，得到含cathelicidinl，3開放閱讀框(ORF)的完整核苷酸序列，其ORF序列全長分別為447bp、456bp，其自5』端至3』端的序列詳見序列表(SEQ ID NO. I和SEQ IDNO. 6)。本發明提供的一組雞Cathelicidins抗菌肽，其製備方法可以是固相化學合成法，也可以將抗菌肽的編碼基因克隆到表達載體上，然後導入特定的宿主細胞中表達後獲得。其中表達載體可以是質粒或病毒中的一種，宿主細胞可以是原核細胞，包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等，宿主細胞也可以是真核細胞、包括酵母細胞、昆蟲細胞和哺乳動物細胞等。製備的抗菌肽可通過質譜法鑑定。本發明提供一種雞抗菌肽Cathelicidinl，3高效的基因工程製備方法，主要通過以下步驟實現(I)將雞抗菌肽Cathelicidinl和雞抗菌肽Cathelicidin3成熟肽的編碼基因分別克隆到大腸桿菌融合表達載體pET30a ( + )中，得到融合表達載體pET30-CathLlS、pET30-CathL3S ；(2)將 pET30_CathLlS、pET30_CathL3S 質粒分別轉化大腸桿菌 Rosetta(DE3)菌株，得到重組大腸桿菌基因工程菌株；(3)37°C下，在LB培養基中，誘導物IPTG濃度為I. Ommol/L的條件下，對上述重組大腸桿菌基因工程菌進行誘導表達3小時；(4)離心收集上述表達菌體，超聲波破碎，分離細胞可溶組分與包涵體；(5) Ni2+-NTA Sepharose 4B親和層析柱純化融合蛋白。其具體步驟為(I)採用RT-PCR方法從白來航雞骨髓組織中擴增編碼雞抗菌肽Cathelicidinl，3前體蛋白的核苷酸序列(cDNA序列)，將所述基因分別克隆至PMD-18T載體中，轉化大腸桿菌DH5 α菌株，並進行序列測定；

(2) PCR方法擴增編碼雞抗菌肽Cathelicidinl，3成熟肽的核苷酸序列，PCR產物經EcoR I和Xho I雙酶切後與同樣酶切的pET-30a(+)(或pET_32a(+))融合表達載體連接，轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，小量提取質粒，應用PCR和質粒酶切的方法篩選陽性克隆,通過DNA測序驗證插入片段閱讀框的正確性,從而構建出原核表達載體。將構建的融合表達載體分別命名為pET30-CathLlS、pET30-CathL3S ；(3)將測序正確的重組表達質粒pET30-CathLlS、pET30_CathL3S分別轉化大腸桿菌Rosetta(DE3)菌株，挑取陽性菌株接種至LB培養基中37°C培養8 12h。次日離心取菌體重懸至新鮮LB培養基中，待培養液OD6tltol值達到O. 5^0. 6時加入IPTG使其終濃度為
I.OmmoI/L，開始進行誘導；37°C繼續培養4h，每隔I小時取樣lmL。離心收集誘導培養後的菌體，用PBS緩衝液洗滌菌體2次，再加入裂解緩衝液(50mmol/L Tris-HCl, pH8. O, 50mmol/L NaCl, lmmol/LEDTA, 5%甘油，臨用前加入蛋白酶抑制劑PMSF至終濃度為lmmol/L)，冰浴中超聲破碎菌體，每次破碎5s，間隔2s，功率600W，破碎lOmin。超聲後12000r/min，4°C下離心IOmin,分離可溶組分與和包涵體,進行SDS-PAGE電泳和Western Blot檢測。濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為15%。將pET-30a(+)質粒按同樣方法進行轉化、誘導表達，取3h誘導表達產物(上清)作為對照。Western Blot操作參照《分子克隆實驗指南》中的方法進行。電泳後將SDS-PAGE凝膠中的條帶電轉移至硝酸纖維素膜上，以鼠抗His單克隆抗體為一抗，羊抗鼠IgG-HRP為二抗，DAB為顯色底物進行Western-blot分析，鑑定表達產物。(4)融合蛋白表達條件優化與表達產物的親和層析純化通過採用高滲培養基(即LB/SB培養基)、低溫(25°C或15 20°C )長時間誘導、調節誘導物IPTG的濃度等方法，抑制包涵體形成，提高表達產物中可溶性蛋白所佔比例。試驗證明，在25°C、IPTG濃度為I. Ommol/L的條件下誘導培養8小時，可溶性目的蛋白所佔的比例較37°C條件下明顯提高，利於下遊純化操作。按上述優化後的條件進行擴大培養和目的蛋白的誘導表達，取誘導後的菌體，力口入適量結合緩衝液，冰浴中超聲波破碎菌體，分離包涵體和可溶組分，將裂解上清液上樣於固定化金屬配體親和柱層析柱(Ni2+-NTA Sepharose 4B柱),樣品經含O. I "O. 5mol/L咪唑的緩衝液梯度洗脫，收集融合蛋白洗脫峰進行SDS-PAGE檢測。結果顯示，洗脫液中目的蛋白在目標位置呈現單一條帶，表明經親和層析可獲得純度較高的融合蛋白，為成熟產物的獲得創造條件。(5)採用標準瓊脂孔穴擴散法(AWDA)檢測重組雞抗菌肽Cathelicidinl，3的對指示菌株的體外抑菌活性。
本發明的一組新的雞抗菌肽Cathelicidinl, 3,還可方便地採用固相化學合成方法進行製備。從雞Cathelicidinl抗菌肽核苷酸序列推導出其前體蛋白的胺基酸序列(Seq-Ι)，根據目前對雞Cathelicidins類抗菌肽成熟肽酶切加工位點(彈性蛋白酶切割位點)的認識，即雞體內彈性蛋白酶一般是從該基因第四個外顯子編碼胺基酸序列中的第一個纈氨酸(Val)位點進行切割加工，釋放出有生物學活性的成熟肽的N-端；結合對信號肽與成熟肽間高度保守的Cathelin結構域肽段的分析，可以推斷在其前體蛋白中，Arg123-Lys 148為雞Cathelicidinl抗菌肽的成熟肽序列(Seq_4)。根據編碼雞Cathelicidinl抗菌肽的核酸序列推導出成熟抗菌肽的胺基酸序列，按照標準固相肽合成程序用全自動多肽合成儀合成其成熟肽序列(其N端至C端的胺基酸序列為Arg Val Lys Arg Val Trp Pro Leu Val He Arg Thr Val He Ala Gly Tyr AsnLeu Tyr Arg Ala He Lys Lys Lys,見序列表中Seq_4)。合成肽經反相-高壓液相柱層析(RP-HPLC, Column X Bridge 4. 6X 250mm)脫鹽、純化，採用乙腈/水/三氟乙酸系統洗脫，合成肽的樣品純度>95% (95. 4%)。採用電噴霧質譜(ESI-MS)測定其分子量為3142. 80，與理論分子量(3141. 86)基本一致。 本發明通過抑菌活性檢測發現，利用Rosetta(DE3)/pET30a表達體系表達的重組Cathelicidins抗菌肽不需酶切等處理，對革蘭氏陽性、陰性菌均有很好的抑菌活性，對金黃色葡萄球菌、芽孢桿菌、藤黃微球菌、大腸桿菌、雞白痢沙門氏菌C79-13、巴氏桿菌、鴨疫裡默氏桿菌、綠膿桿菌等標準菌株和臨床分離菌株均有較強的抑制作用。與常規藥敏試驗結果比對發現，藤黃微球菌、大腸桿菌等標準菌株對試驗中所使用的大多數抗生素類藥物均耐藥,而重組Cathelicidins抗菌肽對這些菌株卻有明顯的抑制效果。表明重組Cathelicidins抗菌肽對某些細菌菌株的抑制作用在一定程度上可能超過傳統抗生素。本發明通過抗菌肽Cathelicidinl對金黃色葡萄球菌急性感染抑菌活性的雛雞試驗顯示，抗菌肽給予5. Omg/kg劑量，就能達到100%殺菌抑制率，而作為抑殺金黃色葡萄球菌的氨苄青黴素給予5. Omg/kg劑量未能達到明顯的殺菌抑制率，表明本發明抗菌肽對金黃色葡萄球菌急性感染有很顯著的殺菌效果，因此本發明抗菌肽可應用於製備治療革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌或真菌感染引起的疾病的藥物，尤其是應用於製備治療金黃色葡萄球菌、芽孢桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌等的藥物。本發明抗菌肽同時還可以用於製備動物飼料添加劑和防腐劑。本發明的有益效果在於(I)本發明選擇大腸桿菌/融合表達載體作為外源基因的原核表達體系，選擇pET30a等融合表達載體，使雞Cathelicidins抗菌肽獲得高效表達，並避免表達產物對宿主細胞造成直接的殺傷性。(2)本發明提供的方法表達效率高，表達產物分離純化簡單，生產成本低，易放大，穩定性好，適用於大規模工業化生產，具有廣闊的應用推廣前景。(3)本發明應用基因工程技術在原核宿主細胞中高效表達雞Cathelicidins抗菌肽，經實驗證實該組抗菌肽對多種革蘭氏陽性菌、陰性菌均有明顯的抑制作用。該組抗菌肽可應用於製備抗菌藥物，或用於製備動物飼料添加劑和防腐劑。(4)與其它來源的鹼性抗菌肽相比，該組抗菌肽還具有結構簡單、人工合成方便、抗菌譜系廣等有益特點。


圖I為PCR擴增白來航雞Cathelicidinl，3抗菌肽基因產物的2%瓊脂糖凝膠電泳圖。在圖I中，I為DL15000 DNA marker，其中各核酸片段的鹼基數目(數目單位為bp)分別為 15000，10000，7500，5000，2500，1000,250 ;2，4 分別為 Cathelicidin_l，-3cDNA序列的PCR擴增產物；圖中5為DL2000 DNA Marker，其中各核酸片段的鹼基數目(數目單位為bp)分別為 2000，1000，750，500，250，100。圖2為含雞Cathelicidin-I, -3基因cDNA序列的陽性質粒pMD-CathL酶切後2%瓊脂糖凝膠電泳圖。圖2中I為λ-EcoTH I digest DNA marker，其中各核酸片段的鹼基數目(數目單位為 bp)分別為 19329，7743，6223，4254，3472，2690，1882，1489，925 ；2 為質粒pMD-CathLl/EcoR I+Hind III 雙酶切後條帶，3 為質粒 pMD-CathLl/EcoR I+Not I 雙酶切後條帶,6為質粒pMD-CathL3/EcoR I+Hind III雙酶切後條帶，7為質粒pMD_CathL3/EcoRI+Not I雙酶切後條帶，8為DL2000 DNA marker，其中各核酸片段的鹼基數目(數目單位為bp)分別為 2000，1000，750，500，250，100。圖3為重組表達質粒pET30_CathLS酶切後I. 5%瓊脂糖凝膠電泳圖。圖3中I為X-EcoT14 Idigest DNA marker,其中各核酸片段的鹼基數目(數目單位為bp)分別為19329，7743，6223，4254，3472，2690，1882，1489，925 ;2 為質粒 pET-30a Sma I+Xba I 雙酶切後條帶；3為質粒pET30-CathLlS Sma I+Xba I雙酶切後條帶；5為質粒pET30_CathL3SSma I+Xba I雙酶切後條帶。圖4為雞抗菌肽Cathelicidinl，3成熟肽片段融合表達載體pET30_CathLS的構建示意圖。在圖4中，5. 5Kb代表構建的融合表達載體pET30-CathLS大小為5. 5Kb ；P1, P2分別代表Cathe I i c i din I，3cDNA序列克隆所用的上、下遊引物；MCS代表多克隆位點；LacZ代表β-半乳糖苷酶的編碼基因；LacI代表Iac阻抑物的編碼基因；CathL代表連接插入克隆載體的Cathelicidinl, 3cDNA序列；CathLS代表連接插入表達載體的Cathelicidinl, 3成熟肽編碼序列；Amp代表氨苄青黴素抗性基因位點；Kan代表卡那黴素抗性基因位點；pUCorigin, fl origin, pBR322 origin 均代表複製起始位點。圖5為SDS-PAGE及Western-Blot分析雞Cathelicidinl, 3成熟肽融合蛋白的表達產物圖。其中，左側是SDS-PAGE電泳圖，右側是Western blot圖。泳道I，I』是空載體轉化菌株Rosetta(DE3)/pET30a IPTG誘導3h菌體經超聲破碎後可溶性蛋白；泳道2，2』是預染低分子量標準蛋白質Marker，其中各蛋白片段的分子量分別為117，85，48，34，26，19kDa，KDa代表蛋白分子量的單位，即千道爾頓；泳道3，3』是Rosetta (DE3)/pET30-CathLlS菌株IPTG誘導3h菌體經超聲破碎後可溶性蛋白；泳道4，4』是Rosetta (DE3) /PET30_CathLlS菌株IPTG誘導3h菌體經超聲破碎後包涵體蛋白；泳道7，7』是Rosetta (DE3) /pET30_CathL3S菌株IPTG誘導3h菌體經超聲破碎後可溶性蛋白；泳道8，8』是Rosetta(DE3)/pET30-CathL3S菌株IPTG誘導3h菌體經超聲破碎後包涵體蛋白。圖6.固相化學合成雞抗菌肽Cathelicidinl的反相-高壓液相(RP-PHLC)色譜圖。圖7.固相化學合成雞抗菌肽Cathelicidinl的質譜(ESI-MS)圖。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規方法如Sambrook等編著的《分子克隆實驗室指南》(Molecular cloning:A laboratorymanual, 2nd ed. New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)中所述的條件進行，或按照製造廠商提供的說明書進行。具體實施例中所使用的工具酶和其他試劑RNAiso Plus總RNA提取試劑、Reverse Transcriptase M-MLV (Rnase Η-)、核糖核酸酶抑制劑-RNAsin、Taq DNA 聚合酶、限制性內切酶、PMD18-T Vector、T4DNA連接酶除特別指明外均為TAKARA公司產品；鼠抗His單克隆抗體均購自Tiangen公司；UNIQ_10柱式質粒小量抽提試劑盒和UNIQ-IO柱式DNA膠回收試劑盒均為上海生工產品；IPTG為BBI公司產品；HRP標記羊抗鼠IgG為SouthernBiotech公司產品；預染蛋白質分子量標準為Fermentas (MBI)公司產品；金屬螯合層析樹脂Ni2+-NTA S印harose4B購自北京鼎國公司；細菌培養用TMP、TSA等固體培養基為青島高科園海博生物技術公司產品，按說明書提供方法製備；常規藥敏試紙片為杭州天 和微生物試劑有限公司產品，其他試劑均為進口或國產分析純。實施例I :雞Cathelicidinl，3抗菌肽完整編碼基因的克隆及測序測定分析，具體包括I.引物的設計根據GenBank中發表的原雞Cathelicidins類抗菌妝基因序列(DQ092350,DQ092353)和PCR引物的設計原則，並藉助計算機軟體DNASTAR進行輔助分析，設計了三對PCR基因特異性引物分別用於擴增雞Cathelicidinl，3編碼基因的cDNA序列，引物分別為表中CathLl Pl/P2、CathL3 P1/P2，其中Pl為正向引物，P2為反向引物。引物均由上海博尚公司合成。本實施例和實施例2中所用的引物序列如表I所示。在CathLlS F/R，CathL3S F/R引物對中，下劃線處的鹼基分別代表在上下遊引物中引入的EcoR I、Xho I限制性內切酶位點。表I雞Cathelicidins類抗菌肽基因擴增所用引物
pPll名稱引物序列(5, ^ T)SEQID NO.
CathLi Pl5'-tgg gca egg ggt gag gat-3'Il
CathLl P2__S'-ctg ggg atg ttt cac ttc ttc-3'__12_
CathL3 Pl5-atg ctg age tgc tgg gtg c-3'13
CathL3 P2__5-tea ttt tct cct gat ggc ttt gta g-31__14_
CathLlS F 5'-ca GAATTC cgcgtcaagcgcgt-3'15
CathLlS R__5' -ac CTCGAG tcacttcttcttgattgccc-3'__16_
CathUS F 5-caGAATTC cgcgtcaagcgc ttc-3 * 17 I CathL3S R__5'-gcCTCGAG tcattttctcctgatggc-31__18_注下劃線處鹼基分別為在上下遊引物中引入的EcoR I, Xho I限制性內切酶位點。2.雞Cathelicidinl, 3抗菌肽基因cDNA序列的克隆
(I)雞骨髓組織總RNA提取(以下實驗所用器具和試劑均經過處理，無RNase):提取過程按試劑說明書進行操作。無菌採集I月齡白來航雞腿骨新鮮骨髓(lg)，將其加入含ImL RNAiso Plus細胞裂解液(TAKARA公司產品)的玻璃勻漿器中，置於冰浴中勻漿，直至勻漿液呈無顆粒透明狀。將勻漿液轉移至2ml離心管於室溫下作用IOmindPARNAisoPlus 1/5體積量(200yL)的氯仿，用手劇烈振蕩15秒(氯仿沸點低、易揮發，振蕩時應小心離心管蓋突然彈開)。待溶液充分乳化(無分相現象)後，再於室溫下靜置5分鐘；於4°C，12000 Xg條件下離心15min ;從離心機中小心取出離心管，吸取上清液轉移至另一新的2ml離心管中(切忌吸出白色中間層)；向上清中加入等體積的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻後，於-20°C下靜置20min ;4°C，12000X g下離心15min ;小心棄去上清，緩慢地沿離心管壁加入75%的乙醇Iml (切勿觸及沉澱)，輕輕上下顛倒洗滌離心管管壁，12000Xg，4°C離心5分鐘後小心棄去乙醇；室溫乾燥沉澱2 5分鐘，加入適量的RNase-free水溶解沉澱，即可得到雞骨髓細胞總RNAJt RNA沉澱完全溶解後於-80°C保存。(2) cDNA第一鏈的合成(mRNA反轉錄)
首先在O. 2mL微量離心管中按照下列反應體系進行反轉錄反應合成cDNA。在20μ L 反應體系中分別加入以下組分5XRT Buffer 4. O μ L, dNTP (IOmM each) 2. 0 μ L,25mM MgCI2 0. 8 μ L，RNA 酶抑制劑 Rnasin O. 5 μ L ( 20U)，引物 Ρ2 (CathLl Ρ2 或 CathL3Ρ2，20 μ M)l. O μ L，細胞總RNA 10. 7 μ LCl μ g)，將上述反應混合物於臺式離心機上稍作離心，然後在PCR儀上按下列反應條件進行反轉錄反應70°C保溫5min後迅速置於冰上急冷2min ;短暫離心後，在反應體系中加入 Reverse Transcriptase M-MLV (Rnase H-) I. O μ L,混勻後在PCR儀中完成以下程序於42°C反應60min，95°C變性2min後結束反應，將獲得的cDNA溶液貯存於_20°C備用或直接用於下一步PCR擴增。(3)雞Cathelicidins基因的PCR擴增與克隆篩選以獲得的cDNA第一鏈產物為模板，進行cDNA第二鏈合成。按照下列反應體系進行10XPCR Buffer 5. O μ L, 25mmol/L MgCl2 I. 4 μ L，引物 Pl (CathLl Pl 或 CathL3 PI,20 μ Μ) I. O μ L, RT 產物 10 μ L, Taq DNA 聚合酶 O. 6 μ L,補加 ddH20 至總體積為 50 μ L。在PCR儀上設置下列反應程序95°C預變性3min，I個循環；94°C 30S,54°C 30S，72°C 30S，30個循環後以72°C延伸IOmin結束反應，4°C保存。取5 10 μ LPCR產物進行2%瓊脂糖凝膠-TAE電泳，檢測目的條帶，結果如圖I所示。將PCR產物經過2%瓊脂糖凝膠電泳分離，割膠回收並純化(按凝膠回收試劑盒說明進行)目的片段後，與PMD18-T克隆載體連接；熱激法轉化CaCl2法製備的大腸桿菌DH5 α感受態細胞，離心取轉化後菌液均勻塗布在含有100ug/ml氨苄青黴素(Amp)的LB瓊脂培養基平板上，37°C培養過夜。次日挑取單菌落，振蕩培養後，鹼法小量提取質粒(按質粒小量抽提試劑盒說明書操作);通過利用引物CathLl Pl/P2、CathL3 P1/P2分別進行PCR檢測及質粒限制性酶切鑑定的方法篩選陽性克隆(如圖2所示)，並將陽性質粒命名為pMD-CathLl和pMD-CathL3。將鑑定的陽性菌株寄至上海博尚公司測序，測定的DNA序列用Blast程序進行同源性檢索，並進行序列比對分析。4.雞cathelicidins基因的序列測定和結果分析取雞Cathelicidins cDNA 克隆使用 M13 F/R 引物測序,得到 Cathelicidinsl, 3前體蛋白編碼基因的完整核苷酸序列。基因的測序結果如序列表所示。
序列測定結果表明，克隆的Cathelicidin-Ι，_3基因開放閱讀框(ORF)大小分別為447bp，456bp，分別編碼包含148、151個胺基酸殘基的前體蛋白，其中N末端的17個胺基酸殘基為信號肽序列，中間部分105個胺基酸殘基構成Cathelin結構域，C端的26、29個胺基酸殘基分別組成Cathelicidin-I, -3抗菌肽的成熟肽。序列比對分析發現，克隆的白來航雞Cathelicidin-Ι基因序列與參考序列(Fowlicidin-1, GenBank 登錄號 DQ092351) ORF 完全一致。與烏骨雞 Cathelicidin-I(GenBank登錄號FJ938357)0RF序列相似性為99. 6%，只有432位一個鹼基差異，前者為A，後者為G。推導的胺基酸序列相似性為100%。克隆的白來航雞Cathelicidin-3基因序列與參考序列(Fowlicidin_3, GenBank登錄號DQ092353) ORF序列相似性為99. 6%，在168、420位各存在I個鹼基差異，前者分別為A、G，後者分別為G、A。胺基酸序列相似性為100%ο SPF雞Cathelicidin-3 ORF與烏骨雞Cathelicidin-30RF (GenBank登錄號FJ938359)核酸序列相似性為99. 8%，在168位存在I個鹼基差異，前者為A,後者為G。胺基酸序列相似性為100%。序列分析表明，不同品種來源的雞Cathelicidins抗菌肽基因在核苷酸序列上存在微小的差異，胺基酸序列相差甚微，從而表明Cathelicidins抗菌肽基因在進化中是高度保守的。實施例2 重組雞Cathelicidins抗菌肽融合蛋白的基因工程製備方法，包括以下步驟
I.雞Cathelicidinsl, 3成熟肽編碼序列的的製備及其融合表達載體的構建(I)雞Cathelicidinsl, 3成熟肽編碼序列的的擴增根據已克隆的雞Cathelicidinsl, 3抗菌肽基因序列和推導的胺基酸序列,設計3對帶有酶切位點的特異性引物CathLlS F/R，CathL3SF/R，下遊引物帶有終止密碼子TGA，引物序列見表I。分別以含雞 Cathelicidin-I, -3 基因 cDNA 序列的陽性質粒 pMD-CathLl, pMD_CathL3 為模板，用 PCR方法擴增雞Cathelicidinsl, 3成熟肽編碼序列( lOObp)。反應體系為10X PCR Buffer (含 Mg2+) 5. O μ L，dNTP (2. 5mmol/L) 4. O μ L，引物F (CathLlF 或 CathL3 F，20 μ Μ) I. O μ L，引物 R (CathLl R 或 CathL3 R, 20 μ Μ) I. O μ L，pMD-CathL (pMD-CathLl 或 pMD_CathL3)質粒 DNA O. 5 μ L, Taq DNA 聚合酶 O. 5 μ L，補加ddH20 38 μ L，總體積為50 μ L。混勻後在PCR儀上按照下列程序進行反應95°C預變性3min，l 個循環；94°C 30S，55°C 30S，72°C 30S，30 個循環後以 72°C延伸 IOmin 結束反應，4°C保存。將所有PCR反應液進行2%瓊脂糖凝膠-TAE電泳，並用生工公司的凝膠回收試劑盒回收特異性片段。PCR產物經切膠回收後，溶於適量EB洗脫液。(2)預連接DNA片段的製備將上步中回收產物用EcoR I和Xho I進行雙酶切。酶切反應體系具體為10X酶切反應緩衝液H IOyL, PCR回收產物35 μ L，限制性內切酶EcoR I 3. O μ L，Xho I 3. O μ L，雙蒸水49 μ L，總反應體積為100 μ L。將反應液置於37°C水浴中反應3h。將酶切反應液轉移至一新的I. 5ml離心管中，補加TE緩衝液(lOmmol/LTris-HCl, lmmol/L EDTA, pH8. 0)至總體積為500 μ L ;加入等體積的苯酚/氯仿(體積比為25 24)蛋白抽提液，充分振蕩混勻；於41，12000 Xg條件下離心IOmin ;小心吸取上層無機相，轉移至一新的離心管中；加入2. 5倍上清液體積的無水乙醇，於-20°C下靜置30min ；4°C，12000 X g下離心15min ;小心棄去上清，緩慢地沿離心管壁加入75%的乙醇Iml洗滌離心管管壁，12000 X g，4°C離心5分鐘後小心棄去乙醇；室溫乾燥沉澱5 10分鐘，加入適量的TE緩衝液溶解沉澱，即得到含有與處理好的pET-30a(+)線性載體相互配對的粘性末端的預連接成熟肽編碼片段。(3)線性化表達載體的製備取保存的DH5 a /PET_30a(+)原核表達載體轉化菌株，振蕩培養後，小量提取質粒。取pET-30a(+)質粒用EcoR I和Xho I進行雙酶切。酶切反應體系為10X酶切反應緩衝液H8yL，pET_30a(+)質粒20 μ L，限制性內切酶EcoR I
3.O μ L，Xho I 3. O μ L，雙蒸水46 μ L，總反應體積為80 μ L。37°C水浴中3h酶切反應完全後，將反應液進行1% (W/V)瓊脂糖凝膠-TAE電泳後，用凝膠回收試劑盒回收特異性片段，處理好的載體具有EcoR I和Xho I的粘性末端，貯存於_20°C待用。(4) Cathelicidinsl, 3成熟肽片段融合表達載體的構建、轉化與鑑定

將經上述一系列處理後帶有相同粘性末端的pET_30a(+)原核表達載體與含有Cathelicidinsl, 3成熟肽編碼序列的DNA片段進行體外連接,反應體系如下
10xT4 DNA Ltgase Buffer2pL
Cathelicidins I，3 成熟肽編 1 片段 14pL線性化表達載體3PL
T4 DNA LigaseΙμ
總反應體積2_L16°C反應過夜；次日將連接反應液全部轉化至JM109感受態細胞中，塗布在含有卡那黴素(100yg/ml)的LB瓊脂平板上培養過夜。次日挑取單菌落，振蕩培養後，小量提取質粒，利用CathLlS F/R，CathL3S F/R引物對，以質粒為模板，按照前述PCR檢測和質粒酶切方法鑑定陽性克隆菌株。將陽性菌株寄至由上海博尚公司進行核苷酸序列測定，測序結果表明編碼Cathelicidins成熟蛋白基因正確地插入到原核表達載體的目的位點，且各段核苷酸序列的開放閱讀框(ORF)連續，即得到重組表達質粒，將其分別命名為pET30-CathLlS、pET30_CathL3S。重組表達質粒pET30_CathLS的酶切分析結果見圖3，融合表達載體的構建過程詳見圖4。2.雞CathelicidinSl，3成熟肽片段在大腸桿菌中的誘導表達與表達產物鑑定Rosetta(DE3)是Novagen公司用於pET系列原核表達載體表達外源蛋白的受體菌株，Rosetta宿主菌是從BL21衍生而來的λ DE3溶原菌，可增強帶有大腸桿菌稀有密碼子的真核基因在原核系統中的的表達水平。該菌株的基因型為F_ omp T hsdSB(rBmB_)galdcm lac Yl (DE3) pRARE (argU, argff, ileX, glyT, leuff, proL) (CmE)。將 pET30_CathLS 重組表達質粒轉化Rosetta(DE3)受體菌株,可獲得重組表達Cathelicidinsl, 3成熟肽融合蛋白的工程菌 Rosetta (DE3) /pET30_CathLS。(I)表達重組融合蛋白的工程菌Rosetta (DE3) /pET30_CathLS的構建I)取前述經鑑定正確的融合表達質粒pET30_CathLlS、pET30_CathL3S和pET-30a(+)空質粒O. 5 μ L，用熱激法分別轉化CaCl2法製備的Rosetta (DE3)宿主感受態細胞，取200 μ L轉化後菌液均勻塗布於含100 μ g/mL卡那黴素(kana)的LB瓊脂平板上，37 °C培養過夜。2)次日，挑取陽性克隆接種至4ml LB培養基(含100 μ g/mL卡那黴素)中進行液體培養，37°C振蕩培養8h後，取少量菌液，分別利用CathLlS F/R，CathL3S F/R引物對進行PCR檢測確定轉化成功的菌株(PCR方法、條件如前所述)。將成功轉化的工程菌命名為Rosetta(DE3)/pET30_CathLS (分別為 Rosetta(DE3)/pET30_CathLlS 和 Rosetta(DE3)/pET30-CathL3S)，菌株在含15%甘油的LB培養基中於_80°C保存。(2) Cathelicidinsl, 3成熟肽融合蛋白的小規模誘導表達I)分別取構建好的工程菌 Rosetta(DE3)/pET30_CathLlS、Rosetta(DE3)/pET30-CathL3S的單菌落，接種至4ml LB液體培養基(含100 μ g/mL卡那黴素)中37°C振蕩培養8 12h ;2)將菌懸液於4°C保存過夜,次日離心取菌體,重懸於50mL含100 μ g/mL卡那黴素的新鮮LB培養基中；3)37°C振蕩培養3h左右至培養液OD6tltlnm值達到O. 5^0. 6，先取出ImL培養物作為誘導前對照，在餘下培養物中加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)貯存液(500mmol/L)至終濃度為I. Ommol/L進行誘導；4)37°C繼續培養4h，每隔I小時取ImL培養液；離心收集誘導後的菌體，用PBS緩衝液洗滌菌體2次，按ImL菌液離心後加入IOOuL裂解緩衝液的比例，加入冰預冷的裂解緩衝液(50mmol/L Tris-HCl, pH8. O, 50mmol/L NaCl, lmmol/L EDTA, 5%甘油，臨用前加入蛋白酶抑制劑PMSF至終濃度為lmmol/L)重懸菌體，冰浴中超聲破碎菌體，每次破碎5s，間隔2s，功率600W，破碎IOmin。5)超聲後菌體裂解液於12000Xg，4°C下離心lOmin，分離可溶組分與和包涵體，
進行下一步鑑定。6)同時取pET_30a(+)空質粒轉化的Rosetta(DE3)菌株為對照，按照上述條件進行誘導培養和菌體裂解。(3) Cathelicidinsl, 3成熟肽表達產物的鑑定通過表達產物的聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)與蛋白質免疫印跡分析(Western Blot檢測),對融合蛋白進行初步鑑定。SDS-PAGE檢測融合蛋白的表達I)凝膠的配製參照《分子克隆實驗指南》中的配方和方法製備15%分離膠和5%濃縮膠；2)樣品處理取上述待分析鑑定的蛋白質樣品，加入等體積的2XSDS凝膠加樣緩衝液，100°C水浴煮沸5min ；3)加樣將電泳槽內加入IXTris-甘氨酸電泳緩衝液(25mmol/LTris-HCl, pH8. O, 250mmol/L甘氨酸，O. 1%SDS, pH8. 3)，小心拔去點樣梳，然後用注射器吹打加樣孔。用微量加樣器分別吸取待分析樣品，根據蛋白濃度和加樣孔體積決定加樣量；4)電泳開始用低電壓80V恆壓電泳，待溴酚藍指示劑前沿進入分離膠後，提高電壓至120V電泳，直至溴酚藍遷移至分離膠底部後，停止電泳；
取出凝膠，考馬斯亮藍染色、脫色後掃描分析。5)染色輕輕撬開兩層玻璃，取出凝膠，用至少5倍體積的考馬斯亮藍R-250染色液(O. 25g考馬斯亮藍R-25溶於含45%(V/V)甲醇、10%(V/V)乙酸的溶液中)浸泡凝膠，置於平穩脫色搖床上室溫緩慢振蕩染色2h ；6)脫色換掉染色液，用脫色液(10% (V/V)乙酸溶液)浸泡凝膠，緩慢搖動4 8h，其間更換3 4次脫色液，直至背景乾淨，條帶清晰為止。7) SDS-PAGE分析表明，Cathelicidin-1，3成熟肽片段均能成功表達，表達產物以可溶組分和包涵體兩種形式存在，但2段基因的表達量有所差異，其中Cathelicidin-3的表達量較Cathelicidin-Ι產物高些。2種表達產物的表觀分子量約為12kDa。而空載體轉化對照組無相應蛋白條帶，結果見圖5。蛋白質印跡分析(Western-Blot檢測)I)目的蛋白的電轉移(溼式轉移)①按前述方法將誘導表達蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳；
②SDS-PAGE電泳結束後，小心取出凝膠，浸泡在轉膜緩衝液中平衡5 IOmin ；③將濾紙、硝酸纖維素膜(NC)剪成與凝膠同樣大小，將NC膜在蒸餾水中浸泡5min以消除氣泡，再將NC膜、濾紙、吸水海棉層等浸入轉移緩衝液中平衡lOmin。將NC先浸入蒸餾水中10-20min，再浸入轉移緩衝液中平衡30min。④轉膜戴上手套按如下方法安裝好電轉移裝置(北京六一廠)將黑色多孔塑料夾放在最底層，再按自下而上的順序依次放置吸水海棉層、多層濾紙、凝膠、NC膜、多層濾紙、海棉層、無色多孔塑料夾，濾紙、凝膠、NC膜要精確對齊，用一試管或玻璃棒在每層表面緩慢移動，以除去凝膠和NC膜、濾紙之間的氣泡；合攏好電轉印夾放入轉移槽中(黑的靠黑的，白的靠紅的)，加滿轉移緩衝液；正確連接電極，即凝膠朝向陰極，NC膜朝向陽極，使凝膠上的蛋白質向NC膜印跡轉移；200mA恆流(電壓IOOV左右)，加冰條件下電轉移3h。起始電流應小於250mA，結束電流不應超過400mA。2)免疫標記①從電轉移槽中取出NC膜，用TBS緩衝液洗膜2次，以除去NC膜上的凝膠。將NC膜裝入一可加熱封接的塑膠袋中，加入封閉液(3%脫脂奶粉溶於TBS)，放在平緩搖動的搖床上封閉3h ；②封閉結束，將膜轉移至新的可加熱封接的塑膠袋中，按O. lmL/cm2的量加入封閉液和適量的第一抗體(鼠抗His單克隆抗體，1:1000稀釋於封閉液中)，封口，4°C溫和振搖過夜；③剪開塑膠袋，用約200mL TBST漂洗液洗膜3次，每次lOmin，以除去過量的一抗；④將膜轉入另一塑膠袋，加入溶於二抗稀釋液的羊抗鼠IgG-HRP 二抗(I :3000稀釋，7uL羊抗鼠IgG-HRP稀釋至21mL)，封口，室溫下平緩搖動f 2h ；⑤取出NC膜，用大量TBST漂洗液洗膜Γ5次，每次lOmin，以除去未結合的二抗；⑥最後再用TBS洗膜一次，去除Tween-20。3)免疫染色將NC膜轉入適量新鮮配製的DAB顯色液(臨用時加入H2O2)中，置暗處反應，待蛋白條帶顏色深度達到要求時(顯色反應達到最佳程度，約疒3min)，立即用雙蒸水洗滌終止反應，將膜晾乾保存。Western-Blot檢測所用各緩衝液的配製方法如下I.轉移緩衝液39mmol/L 甘氨酸，48mmol/L Tris-HCl, O. 037%(ff/V) SDS, 20%(V/V)甲醇；配製IL轉移緩衝液需稱取2. 9g甘氨酸，5. 8g Tris-base,0. 37g SDS，並加入200mL甲醇，加水至總量為1L。2.封閉液3%(W/V)脫脂奶粉，O. 02%疊氮鈉，溶於TBS ；3.漂洗液 I-TBS 緩衝液(150mmol/L NaCl, 50mmol/L Tris-Cl，ρΗ7· 5)；漂洗液II -TBST 150mmol/L NaCl, 50mmol/L Tris-Cl, pH7. 5,0. 02%Tween-204. 二抗稀釋液(3% 脫脂奶粉，150mmol/L NaCl, 50mmol/L Tris-HCl, pH7. 5)5.顯色液 DAB (3. 3-diaminobenzidine, 3. 3_ 二氛基聯苯胺)配製7. 5mg DAB 溶於IOmL TBS buffer中，臨用時加入30%H202 IOyL (臨用時現配)，混勻後立即使用。SDS-PAGE 和 Western-blot 分析表明，Cathelicidin-l, 3 成熟妝片段均能成功表達，表達產物以可溶組分和包涵體兩種形式存在，但3段基因的表達量有所差異，其中 Cathelicidin-3的表達量較Cathelicidin-Ι產物高些,誘導後產生較為清晰的特異條帶，而空載體轉化對照組無相應蛋白條帶。2種融合蛋白表達產物的表觀分子量約為12kDa(結果見圖5)。實施例3:Cathelicidins融合蛋白表達條件優化與表達產物的親和層析純化I.融合蛋白表達條件優化為提高可溶性組分在表達總蛋白中所佔比例，通過降低誘導溫度(降至25°C或15^200C )，延長誘導時間(3h 8h)，調節誘導物濃度(IPTG分別濃度為O. 4mmol/L, O. 8mmol/L, I. Ommol/L, I. 2mmol/L)等方法,來抑制包涵體的形成,從而簡化純化操作。通過採用高滲培養基(即LB/SB培養基)、低溫(25°C或15 20°C )長時間誘導、調節誘導物IPTG的濃度等方法，達到抑制包涵體形成、提高表達產物中可溶性蛋白所佔比例的目的。試驗證明，在25°C、IPTG濃度為I. Ommol/L的誘導條件下，可溶性目的蛋白所佔的比例較37°C條件下明顯提高(圖略)，利於下遊純化操作。2.融合蛋白表達產物的親和層析純化His標籤蛋白純化樹脂(Ni-NTA Resin)是用於純化帶有6XHis標籤重組蛋白的一種純化介質，該純化介質與His標籤蛋白具有極高的親和力，可用於在非變性或變性條件下純化任何表達系統表達的6XHis標籤重組蛋白。6XHis可與Ni2+螯合，從而使His標籤蛋白結合在Ni-NTA純化介質上，未結合的蛋白被洗滌下去，結合在介質上的蛋白經過一定濃度的咪唑或低pH緩衝液溫和的洗脫下來，從而得到高純度的目的蛋白。本發明利用Ni2+-NTA Sepharose 4B親和層析純化介質，在非變性條件下純化出高純度的Cathelicidins融合蛋白。操作如下(I)蛋白質樣品製備I)取成功表達 Cathelicidins 融合蛋白的工程菌 Rosetta (DE3) /pET30_CathLS,於LB/Kan瓊脂平板上劃線分離單菌落。2)取單菌落接種至4ml LB液體培養基(含100 μ g/mL Kan)中37°C振蕩培養8 12h ；3)離心取菌體，重懸於200mL含100 μ g/mL Kan的新鮮LB培養基中擴大培養，37°C振蕩培養至培養物OD6tltlnm值達到0. 5^0. 6時，加入異丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)貯存液(500mmol/L)至終濃度為I. 0mmol/L進行誘導，按上述優化後變動條件進行誘導；4)離心收集菌體，按照每IOOmL培養物的菌體沉澱懸於4mL結合緩衝液(20mmol/L Tris-HCl, pH8. 0, 500mmol/L NaCl)的比例加入適量結合緩衝液；5)將菌體懸浮起來，加入溶菌酶至終濃度lmg/mL，混勻，冰上放置30min，超聲或勻漿破碎細胞，再將混合物於4°C搖床上孵育lOmin。6)加入 Triton X_100、DNase (5U/μ L)和 RNase (10mg/mL)，至終濃度分別為 1%、5U/mL和5 μ g/mL,再於4°C搖床上孵育lOmin。7) 12000r/m (2 0，000xg以上)，4°C離心15min以上。去掉不溶性細胞碎片，將上
清(細胞裂解液)轉移到另一個新管中，置於冰上備用或_20°C保存。(2)融合蛋白的親和層析純化及洗脫I)柱床準備輕輕顛倒混勻固定化Ni2+-NTA樹脂，將其裝入合適的層析柱內，樹脂自然沉降，用3倍柱床體積的無菌水衝洗樹脂，再用5倍柱體積的結合緩衝液平衡樹脂，放置待用；2)將上步處理好的上清樣品經O. 45 μ m微孔濾膜過濾後上樣於平衡好的Ni2+-NTASepharose4B親和層析柱內，流速控制在15mL/h 20mL/h,收集穿透部分,用於SDS-PAGE分析蛋白質的結合情況；3)用5倍柱床體積的結合緩衝液洗柱，流速控制在30mL/小時左右，以去除未結合的蛋白和菌體的其他可溶性成份；4)用 4 倍柱床體積的洗漆緩衝液(20mmol/L Tris-HCl, pH8. O, 500mmol/LNaCl, 50mmol/L咪唑)洗柱，進一步洗去非特異結合的蛋白成分，直至流過液OD28tlnm 95% (為 95. 4%)，其 HPLC 圖如圖 6 所示；其 ESI質譜分析圖見圖I。其理論分子量為3141. 86，實測分子量為3142. 80，基本一致。將合成的Cathelicidinl抗菌肽溶於滅菌雙蒸水,用於活性檢測。實施例5 :重組雞抗菌肽Cathelicidinl，3的抑菌活性檢測米用標準瓊脂孔穴擴散法(AgarWell Diffusion Assay, AffDA) (Parente E, etal. A comparison of methods for the measurement of bacteriocin activity. JMicrobiol Methods, 1995，22(1) :95-108)檢測重組雞抗菌肽Cathelicidinl，3 的體外抑菌活性，並與傳統抗生素進行比對。抑菌試驗所用的指示菌株金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus CMCC26003;ATCC6538)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtil is CMCC 63501 )、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus CMCC 63501)、藤黃微球菌(Micrococcus luteus CMCC 28001)、大腸埃希氏菌(Escherichia coli CMCC44102;ATCC 8099)、雞白痢沙門氏菌(SalmonellapuIlorum CVCC533, C79-13)、白色念珠菌(Candida albicans ATCC 10231)、多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida CVCC474，C48-7)等為標準菌株，均購自中國獸醫藥品監察所；大腸埃希氏菌K12D31菌株(CGSC#5165)由耶魯大學菌種保藏中心(大腸桿菌菌株庫)贈送;魏氏梭菌(Clostridieum welchii)、血清I型、II型鴨疫裡默氏桿菌(Riemerellosisanatipestifer)、綠胺桿菌(Pseudomonas aeruginosa),奇異變形桿菌(Proteusmirabilis)、亞利桑那菌(Salmonella arizonae,亞利桑那沙門氏桿菌)、甲型副傷寒沙門 氏菌(Salmonella paratyphi A)等為臨床分離、鑑定菌株均由山東省禽病診斷與免疫重點實驗室保存。具體步驟如下I.重組Cathelicidins抗菌肽體外抑菌活性檢測抑菌活性測定採用標準瓊脂孔穴擴散法將上述標準菌株和臨床分離菌株接種於5mL新鮮LB液體培養基中，37°C培養過夜；再以1%接種量轉接於5mL新鮮LB中，37°C繼續振蕩培養2. 5tT3h至對數生長中期；離心收集菌體，用預冷的IOmM磷酸鹽緩衝液(PBS, pH7. 4)洗滌一次，並調節OD6tltl至O. 4^0. 6 ;分別取處於對數生長期的各標準菌株和臨床分離菌株懸浮液(OD6tltl ^ O. 5)200 μ L，與45°C的TSA固體培養基20mL混勻後，到入90mm平皿中，待其凝固後，用滅菌的打孔器(微孔直徑為4_)打孔；每孔分別滴加40 μ L待測樣品，30°C培養過夜，以同體積的pET30a空載體轉化子表達蛋白(誘導表達3h裂解上清液)為陰性對照，Amp (100 μ g/mL)為陽性對照，次日測量抑菌圈直徑。2.金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等標準菌株的體外藥敏試驗參照藥敏試紙盒的說明，選用先鋒V (3(^8/片)、慶大黴素(1(^8/片)、鏈黴素(10 Ug/片)、苯唑青黴素(I μ g/片)等27種藥敏試紙片，對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、大腸桿菌、藤黃微球菌等7株G+、G—標準菌株進行藥敏試驗，作為重組抗菌肽體外抑菌試驗的抗生素對照。抑菌活性檢測發現，利用Rosetta (DE3)/pET30a表達體系表達的重組Cathelicidins抗菌肽不需酶切等處理，對革蘭氏陽性、陰性菌均有很好的抑菌活性，對金黃色葡萄球菌、芽孢桿菌、藤黃微球菌、大腸桿菌、雞白痢沙門氏菌C79-13、巴氏桿菌、鴨疫裡默氏桿菌、綠膿桿菌等標準菌株和臨床分離菌株均有較強的抑制作用，抑菌圈直徑測定結果見表2。與常規藥敏試驗結果(表3)比對發現，藤黃微球菌、大腸桿菌等標準菌株對試驗中所使用的大多數抗生素類藥物均耐藥，而重組Cathelicidins抗菌肽對這些菌株卻有明顯的抑制效果。表明重組Cathelicidins抗菌肽對某些細菌菌株的抑制作用在一定程度上可能超過傳統抗生素。
表2重組Cathelicidins抗菌肽對指示菌株的抑菌活性Table 2 Detection of the antibacterial activity of recombinantCathelicidins against indicator strains
權利要求
1.雞抗菌肽Cathelicidin3，其核苷酸序列如SEQID NO. 6所述。
2.雞抗菌肽Cathelicidin3，其特徵是，其胺基酸序列如SEQID NO. 10所述。
3.如權利要求I或2所述的雞抗菌肽Cathelicidin3的製備方法,其特徵是,所述製備方法為固相化學合成法或基因工程方法，所述基因工程方法是將雞抗菌肽Cathelicidin3的編碼基因克隆到表達載體上，然後導入宿主細胞中表達；所述表達載體為質粒或病毒中的一種，所述宿主細胞為原核細胞或真核細胞。
4.如權利要求3所述的雞抗菌肽Cathelicidin3的製備方法，其特徵是，所述基因工程方法為 (O將雞抗菌肽Cathelicidin3成熟肽的編碼基因克隆到大腸桿菌融合表達載體pET30a(+)中，得到融合表達載體pET30-CathL3S ； (2)將pET30_CathL3S質粒轉化大腸桿菌Rosetta(DE3)菌株，得到重組大腸桿菌基因工程菌株； (3)37°C下，在LB培養基中，誘導物IPTG濃度為I.OmmoI/L的條件下，對上述重組大腸桿菌基因工程菌進行誘導表達3小時； (4)離心收集上述表達菌體，超聲波破碎，分離細胞可溶組分與包涵體； (5)Ni2+-NTA Sepharose4B親和層析柱純化融合蛋白。
5.如權利要求4所述的雞抗菌肽Cathelicidin3的製備方法,其特徵是， (1) 0 方法擴增編碼雞抗菌肽0&訪611(^也113成熟肽的核苷酸序列，PCR產物經EcoR I和Xho I雙酶切後與同樣酶切的pET-30a(+)融合表達載體連接，轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，提取質粒，應用PCR和質粒酶切的方法篩選陽性克隆，通過DNA測序驗證插入片段閱讀框的正確性，從而構建出原核表達載體；將構建的融合表達載體命名為pET30-CathL3S； (2)將測序正確的質粒pET30-CathL3S轉化大腸桿菌Rosetta(DE3)菌株，獲得重組表達Cathelicidins3成熟肽融合蛋白的工程菌Rosetta(DE3)/pET30_CathL3S ;挑取工程菌單菌落接種至LB培養基中37°C培養8 12h ;次日離心取菌體重懸至新鮮LB培養基中，待培養液OD6tltlnm值達到O. 5^0. 6時加入IPTG使其終濃度為I. OmmoI/L,開始進行誘導；37°C繼續培養4h，每隔I小時取樣ImL ;離心收集誘導培養後的菌體,用PBS緩衝液洗滌菌體2次，再加入裂解緩衝液，冰浴中超聲破碎菌體，每次破碎5s，間隔2s，功率600W，破碎IOmin ;超聲後12000r/min, 4°C下離心IOmin,分離可溶組分與和包涵體，進行SDS-PAGE電泳和WesternBlot檢測；電泳後將SDS-PAGE凝膠中的條帶電轉移至硝酸纖維素膜上，以鼠抗His單克隆抗體為一抗，羊抗鼠IgG-HRP為二抗，DAB為顯色底物進行Western-blot分析，鑑定表達產物； (3)然後進行工程菌擴大培養和目的蛋白的誘導表達，條件為:25V、IPTG濃度為I.OmmoI/L的條件下誘導培養8小時；取誘導後的菌體，加入結合緩衝液，冰浴中超聲波破碎菌體，分離包涵體和可溶組分，將裂解上清液上樣於Ni2+-NTA Sepharose 4B親和層析柱，樣品經含O. Γ0. 5mol/L咪唑的緩衝液梯度洗脫，收集融合蛋白洗脫峰進行SDS-PAGE檢測。
6.如權利要求5所述的雞抗菌肽Cathelicidin3的製備方法,其特徵是,所述步驟(I)擴增編碼雞抗菌肽Cathelicidin3成熟肽的核苷酸序列的引物為CathL3S F/R，其中F為正向引物，R為反向引物，所述CathL3S F/R的核苷酸序列如SEQ ID NO. 17-18所述。
7.如權利要求4-6中任意一項所述的雞抗菌肽Cathelicidin3的製備方法,其特徵是，雞抗菌肽雞抗菌肽Cathelicidin3的編碼基因的獲取方法為自成年白來航雞骨髓組織中提取總RNA，經反轉錄合成cDNA第一鏈後，再以cDNA為模板，用I對基因特異性引物CathL3P1/P2進行PCR，擴增產物即為cathelicidin3 cDNA全序列；PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳分離並回收目的片段，將目的片段與克隆載體PMD18-T連接並轉化E. coli DH5a感受態細胞，陽性菌株用M13 F/R引物測序，得到含cathelicidin3開放閱讀框的完整核苷酸序列；所述CathL3Pl/P2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 13-14所述。
8.權利要求I或2所述的雞抗菌肽Cathelicidin3在製備治療革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌或真菌感染引起的疾病的藥物中的應 用。
9.權利要求I或2所述的雞抗菌肽Cathelicidin3在製備治療金黃色葡萄球菌、芽孢桿菌、藤黃微球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、巴氏桿菌、鴨疫裡默氏桿菌或綠膿桿菌感染引起的疾病的藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一組雞Cathelicidins抗菌肽及其製備方法和應用。雞抗菌肽Cathelicidin1和Cathelicidin3的核苷酸序列和胺基酸序列如序列表所示。所述抗菌肽的製備方法為固相化學合成法或基因工程方法，所述基因工程方法是將雞抗菌肽Cathelicidin1和3成熟肽的編碼基因分別克隆到表達載體上，然後導入宿主細胞中表達。本發明應用基因工程技術在原核宿主細胞中高效表達雞Cathelicidins抗菌肽，經實驗證實該組抗菌肽對多種革蘭氏陽性菌、陰性菌均有明顯的抑制作用。
文檔編號C12N15/70GK102864154SQ201210387660
公開日2013年1月9日 申請日期2010年12月22日 優先權日2010年12月22日
發明者吳靜, 宋敏訓, 李玉峰, 馬秀麗, 姜亦飛, 黃兵, 林樹乾, 於可響 申請人:山東省農業科學院家禽研究所