具有免疫增強活性和抗腫瘤活性的來自奇果菌的低分子量物質的製作方法

2023-09-12 06:00:55

專利名稱：具有免疫增強活性和抗腫瘤活性的來自奇果菌的低分子量物質的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種從「舞茸(Maitake)」菇(奇果菌(Grifola))的菌絲體或子實體 中提取和分級的具有提高的免疫增強活性和抗腫瘤活性的低分子量的蛋白質-葡聚糖復 合物。
背景技術：
一種從奇果菌的菌絲體或子實體中提取的具有β-1，6-連接的葡萄糖作為主 鏈，以β_1，3-連接的葡萄糖作為支鏈的多糖(葡聚糖)和以β-1，3-連接的葡萄糖 作為主鏈，以β_1，6-連接的葡萄糖作為支鏈的多糖(葡聚糖)已知具有免疫增強活 性(日本專利公開(Kokai)No. 59-210901Α(1984)(專利文獻1)；日本專利公開(Kokai) No. 9-238697Α(1997)(專利文獻 2)) 此外，製備抗癌物質的方法也是已知的，其中「舞茸」(貝葉奇果菌(Grifola frondosa)) ,"Tonbimaitake"(巨大奇果菌(Grifola gigantea))，或者"Masutake」(硫磺 多孔菌(Laetiporus sulphureus))用熱水來提取，提取物減壓濃縮，以使得產物經歷用有 機溶劑的沉澱步驟、除去低分子量物質的透析步驟和用脂溶性有機溶劑提取的除去雜質步 驟的組合(日本專利公開(Kokoku)No. 43-16047B(1968)(專利文獻3))。由專利文獻1、2和3公開的傳統技術獲得的葡聚糖_蛋白質複合物的實例是高分 子量葡聚糖-蛋白質複合物，其分子量為大約1，000，000。當在細胞水平上考察其詳細的 免疫增強活性機理時，複合物具有大分子量的事實意味著其主要的活性結構不能被明確說 明。此外，由於這種葡聚糖-蛋白質複合物具有高分子量，它們不能經靜脈內施用。本發明人以前進行的研究目的是在舞茸的熱水提取物中找到具有例如免疫增強 活性、抗癌活性等活性的低分子量物質。結果，他們成功的得到了一種具有10，000-150，000 分子量的葡聚糖-蛋白質複合物(日本專利公開(Kokai)No. 2007-31665A(專利文獻4))。但是處理這樣的具有10，000-150，000的分子量的非常大的葡聚糖-蛋白質複合 物很不方便。專利文獻1 日本專利公開(Kokai)No. 59-210901A (1984)專利文獻2 日本專利公開(Kokai) No. 9-238697A (1997)專利文獻3 日本專利公開(Kokoku) No. 43-16047B (1968)專利文獻4 日本專利公開(Kokai)No. 2007-31665A

發明內容
本發明要解決的技術問題本發明的目的是開發一種具有卓越的免疫增強活性和抗腫瘤活性的低分子量的 來自舞茸的物質，其優選被用作藥品、食品或飲料、和飼料的原料。解決技術問題的手段
本發明人將舞茸的熱水提取物分級，從而新得到一種包含蛋白質_葡聚糖複合物 (其中蛋白質的比例要大於葡聚糖的比例)的具有5000或更低的分子量的物質，其在結構 上不同於常規所知的葡聚糖_蛋白質複合物(其中葡聚糖的比例要大於蛋白質的比例)。然 後，他們發現，這樣的物質具有促進建立的T輔助1型人細胞系(THP-I)和小鼠脾細胞體外 生長和增殖的活性。由此，本發明人完成了包含具有免疫增強活性的低分子量蛋白質-葡 聚糖複合物的物質的純化，其在分子量和蛋白質含量方面明顯不同於專利文獻1，2，3和4 所公開的物質。本發明涉及以下(1)-(7)(1) 一種具有免疫增強活性和抗腫瘤活性的物質，其包含蛋白質_葡聚糖複合物， 所述複合物在蒽酮反應和茚三酮反應中顯示陽性結果，所述物質通過包含下列1)_4)的步 驟來製備1)用水熱提取奇果菌的菌絲體或子實體的步驟；2)將醇加入到得到的水溶性提取物級分至終體積濃度為10 % -80 %，將得到的溶 液在1°C -40°c的溫度下靜置，除去浮在溶液上或者溶液中，或者粘附在容器壁表面的物質 以及其中形成的沉澱物的步驟；3)從經步驟2)後得到的包含醇的水溶性級分中除去醇，並經陰離子交換柱層析 從得到的水溶性級分中收集被吸附的級分的步驟；4)經將吸附的級分進行分子篩分離，收集分子量為5000或更低的級分的步驟；(2)根據(1)所述的具有免疫增強活性和/或抗腫瘤活性並包含蛋白質_葡聚糖 複合物的物質，其中蛋白質與葡聚糖的比為85 15-99.5 0.5；(3)根據(1)或⑵所述的具有免疫增強活性和/或抗腫瘤活性並包含蛋白 質-葡聚糖複合物的物質，其中的奇果菌為「舞茸」(貝葉奇果菌(Grifola frondosa)), "Shiromaitake(Grifola albicans Imaz.), 或 者「豬 茶，，(Dendropolyporus umbellatus)；(4) 一種免疫增強劑或抗腫瘤劑，其包含(1)、(2)和(3)中任一項所述的包含蛋 白質_葡聚糖複合物的物質作為活性成分；(5) 一種化療佐藥，其包含⑴、(2)和(3)中任一項所述的包含蛋白質_葡聚糖 複合物的物質作為活性成分；(6) 一種食品或飲料，其包含(1)、(2)和(3)中任一項所述的包含蛋白質_葡聚 糖複合物的物質；以及(7) 一種寵物食品、牲畜飼料或者寵物食品或牲畜飼料的添加劑，其包含(1)、(2) 和(3)中任一項所述的包含蛋白質-葡聚糖複合物的物質。以下更詳細的描述本發明。本發明中的術語「蛋白質_葡聚糖複合物」涉及一種包含蛋白質和葡聚糖的物質。 該物質包含主要由蛋白質組成，並且蛋白質和葡聚糖的比為如上述(2)所述的99.5 0.5 的物質。本發明中，可以使用所有類型的奇果菌，包含「舞茸」(貝葉奇果菌(Grifola frondosa))、「Shiromaitake，，(Grifola albicans Imaz.)，「豬 等」 (Dendropolyporus umbellatus)等。新鮮的奇果菌可以直接使用或者必要的時候將其切塊後使用。幹的奇果菌也可以直接使用，或者必要時切塊後使用，或者以粉末的形式使用。用水熱提取處理在50°C _135°C下進行，時間為15分鐘_3小時。對於快速提取， 提取可以在壓力下於100°c或更高的溫度下進行，例如，在1-2個大氣壓、約110°C到125°C 的壓力罐中進行15-60分鐘。使用蒸餾水，純淨水，離子交換水，自來水等作為水。每重量份幹奇果菌，使用約 2-50體積份的水。如果使用新鮮的奇果菌，每重量份奇果菌，使用約2-20體積份的水。作為加入到用水熱提取得到的提取物中的醇，可使用甲醇，乙醇，丙醇等。這樣的 醇被加入到提取物中直至終體積濃度為10-80%。而且，可以使用含有0-50%水的醇。在 加入醇之後，得到的溶液被靜置1-25小時，由此出現了浮在溶液上或溶液中或附著到容器 壁表面的物質。隨後經過濾，移液，離心或用網狀材料濾出從溶液收集這些物質。經上述步驟之後，將醇從得到的包含醇的水溶性級分中除去。通過陰離子交換柱 層析，從得到的水溶性級分中收集被吸附的級分。為了進行陰離子交換層析，使用通常所用 的陰離子交換樹脂，如強鹼性離子交換樹脂和弱鹼性離子交換樹脂。然而，優選使用化學和 物理穩定的且具有大的離子交換容量的高滲透性樹脂。將吸附的級分通過常規方法洗脫並進行分子篩分離。由此，可以收集到一種具有 5000或更低分子量的低分子量級分。作為分子篩分離的手段，可以使用凝膠過濾層析、超 濾、透析等。作為凝膠過濾材料，可以使用廣泛用於常規目的的材料，如葡聚糖基、瓊脂糖 基、纖維素基或丙烯醯胺基材料。同樣，對於超濾、透析等，多種裝置是可商業上獲得的。可 以使用適當的裝置。希望選擇本發明人發現的具有5000或更低分子量的級分。然而，取決於裝置，可 接受的分子量變化範圍可以是士20%。在這個範圍內，能夠達到期望的目標。此外，分子量 的下限優選500或更高。通過上述得到的本發明的目標產物描述如下。外觀無色至微黃色液體溶解性溶於水、醇溶液、鹼溶液、酸溶液和二甲亞碸水性溶液的性質中性至弱酸性顯色反應在蒽酮反應和茚三酮反應中呈陽性分子量5，000或更低經柱層析純化的結果表明，本發明中得到的具有免疫增強活性和抗腫瘤活性的物 質中蛋白質與葡聚糖的比在85 15-99.5 0.5的範圍內。該比例會隨用作起始原料的 奇果菌的質量以及提取和純化的條件而發生適量的變化。本發明的蛋白質_葡聚糖複合物是一種具有免疫增強活性和抗腫瘤活性的物質。 因此，它可以作為免疫增強劑或抗腫瘤劑施用給人類或動物，或者可以與化療劑例如抗腫 瘤劑或抗生素聯合使用(即，以化療佐藥的方式)以給人類或動物施用。此外，這種物質還 可以添加到食品或飲料、寵物食物、牲畜飼料等中。當本發明的物質用作藥品或獸藥時，由於具有低分子量並能溶於水或醇中，其可 以製備成多種劑型。劑型的實例包括用於口服的溶液、糖漿、片劑、顆粒劑、粉劑、膠囊和藥 丸；用於腸胃外給藥的腸胃外注射劑、滴液、栓劑、外用製劑、滴鼻劑和滴眼劑。本發明的物 質顯著有利於藥品的開發。
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本發明的物質來自奇果菌，其已經用作食品多年，因此具有很高的安全性。因此， 本發明的物質可以食品或飲料的形式使用或者與食品或飲料混合。本發明中所用的術語 「食品或飲料」不僅限於日常消費的飲料如牛奶和果汁以及加工食品。這樣的食品或飲料的 實例包括所有類型的食品，其中包括普通的食品和飲料如所謂的健康食品、保健功能食品 如有營養功能聲明的食品和特種保健用途的食品，藥用輔助食品，特殊用途食品如老年人 食品和病人食品。本發明的效果根據本發明所述的通過分級奇果菌的熱水提取物得到的，具有5000或更低分子 量的新的蛋白質-葡聚糖複合物，顯示了免疫增強活性和抗腫瘤活性。它可以用作免疫增 強劑、抗腫瘤劑或用於包括抗生素或抗腫瘤劑的化療用佐藥。此外，這樣的來自奇果菌的高安全性的物質是一種非常常見的食品，不但可被用 於藥品和獸藥，也可以被用於食品或飲料、飼料和寵物食品。或者，與它們進行混合。本說明書包含了本申請的優先權文件日本專利申請No. 2008-032935的說明書和 /或附圖中所公開的部分或全部內容。


圖1顯示了細胞增殖活化檢測的結果。細胞增殖活化率通過以下公式得到 細胞增殖活化率(％ )=處理組的吸光度(Abs. 450nm/Abs. 650nm) /對照組的吸光度 (Abs. 450nm/Abs. 650nm)X100圖2顯示了產生的IL-12和IFN-γ的量。本發明的最佳實施方式下文中，本發明將參考以下實施例進行具體描述。(1)提取方法用1. 5L蒸餾水在110 °C -125 ！下熱提取幹舞茸(貝葉奇果菌(Grifola frondosa))的子實體(150g) 15-60分鐘。將乙醇加入到500ml得到的可溶級分中，直至終 體積濃度為10% -80%。將得到的溶液在1°C -40°C下靜置12小時左右，由此產生了粘性 的褐色物質漂浮在溶液上或溶液中或粘附在容器壁表面上。在通過移液等收集所述物質之 後，收集通過更進一步的離心步驟除去沉澱物質得到的包含醇的水溶性級分。通過除去醇， 從溶液中得到水溶性級分。然後通過陰離子交換柱層析(DEAE-Sephadex)收集被吸附的級 分。通過將溶液進行凝膠過濾層析(S印hadex或者Cellulofine)得到一種具有THP-I細 胞增殖活性的級分。這種物質在蒽酮反應和茚三酮反應中顯示陽性結果。然後，將這種物 質通過柱色譜純化，發現蛋白質與葡聚糖的比(在複合物中)為85 15-99.5 0.5。通過凝膠過濾層析對分子量進行分析的結果發現，分子量為5，000或更低。由本 發明得到的物質顯示了紫外吸光度而沒有可見光吸光度。(2)細胞增殖活化測試(體外)小鼠脾細胞在5% CO2的條件下在37°C用所述物質培養18小時。圖1顯示了細 胞增殖活化率(％)。用上述(1)中得到物質處理的組顯示了比對照組更強的小鼠脾細胞 增殖促進效果。(3)抗腫瘤測試
上述(1)中得到的物質和作為對照的普通鹽溶液，分別對Balb/cA小鼠腹膜內施 用七次，在Balb/cA小鼠中已經以250μ Ι/kg體重的量植入結腸26癌。檢測該物質對腫瘤 的生長活性。得到的結果列在表1中。表 權利要求
一種具有免疫增強活性和抗腫瘤活性的物質，其包含蛋白質 葡聚糖複合物，所述複合物在蒽酮反應和茚三酮反應中顯示陽性結果，所述物質通過包含下列1) 4)的步驟來製備1)用水熱提取奇果菌(Grifola)的菌絲體或子實體的步驟；2)將醇加入到得到的水溶性提取物級分至終體積濃度為10％ 80％，將得到的溶液在1℃ 40℃的溫度下靜置，除去浮在溶液上或者溶液中，或者粘附在容器壁表面的物質以及其中形成的沉澱物的步驟；3)從經步驟2)後得到的包含醇的水溶性級分中除去醇，並經陰離子交換柱層析從得到的水溶性級分中收集被吸附的級分的步驟；4)經將吸附的級分進行分子篩分離，收集分子量為5000或更低的級分的步驟。
2.根據權利要求1所述的具有免疫增強活性和/或抗腫瘤活性並包含蛋白質_葡聚糖 複合物的物質，其中蛋白質與葡聚糖的比為85 15-99.5 0.5。
3.根據權利要求1或2所述的具有免疫增強活性和/或抗腫瘤活性並包含蛋白 質-葡聚糖複合物的物質，其中的奇果菌為「舞茸(Maitake) 」(貝葉奇果菌(Grifola frondosa))，「Shiromaitake，，(Grifola albicans Imaz·)，或者「豬等(Choreimaitake)，，( Dendropolyporus umbellatus)。
4.一種免疫增強劑或抗腫瘤劑，其包含權利要求1、2和3中任一項所述的包含蛋白 質_葡聚糖複合物的物質作為活性成分。
5.一種化療佐藥，其包含權利要求1、2和3中任一項所述的包含蛋白質-葡聚糖複合 物的物質作為活性成分。
6.一種食品或飲料，其包含權利要求1、2和3中任一項所述的包含蛋白質_葡聚糖復 合物的物質。
7.一種寵物食品、牲畜飼料或者寵物食品或牲畜飼料的添加劑，其包含權利要求1、2 和3中任一項所述的包含蛋白質-葡聚糖複合物的物質。
全文摘要
本發明公開了一種來自舞茸菇(Maitake mushroom)的物質，所述物質與常規糖-蛋白質複合物相比較低的分子量，以及與常規糖-蛋白質複合物不同的結構，而且還具有免疫刺激活性和抗癌活性。這種來自舞茸菇的低分子量物質通過以下步驟1)-4)來製備1)用熱水提取舞茸菇的菌絲體或子實體；2)將醇加入到步驟1)提取的水溶性級分中使得醇的終濃度按體積計為10％-80％，將得到的混合物在1℃-40℃下靜置，除去浮在溶液表面或溶液中的物質，粘附在容器壁表面的物質以及在溶液中形成的沉澱物；3)從前述步驟產生的含醇的水溶性級分中除去醇以獲得水溶性級分，並將水溶性級分進行陰離子交換層析，並收集被吸附的級分；以及4)將被吸附的級分經歷分子篩分離，並收集分子量為5000或更低的級分。
文檔編號A61K38/00GK101981060SQ20098011047
公開日2011年2月23日 申請日期2009年2月13日 優先權日2008年2月14日
發明者兒玉典子, 難波宏彰 申請人:株式會社雪國舞茸