孟魯司特鈉在抑制寨卡病毒、登革病毒及黃熱病病毒感染中的應用的製作方法

2023-09-14 00:43:55

本發明屬於生物技術、生物醫藥技術領域，特別是涉及到一種可用於抑制寨卡病毒、登革病毒及黃熱病病毒感染的小分子藥物及其應用。

背景技術：

寨卡病毒(zikavirus，zikv)、登革病毒(denguevirus，denv)及黃熱病病毒(yellowfevervirus，yfv)均屬於黃病毒科黃病毒屬，具有包膜蛋白的二十面體病毒。它們的基因組為一條正向單鏈rna,共有約10800個核苷酸，編碼3個結構蛋白(prm、env、capsid)和七個非結構蛋白(ns1、ns2a、ns2b、ns3、ns4a、ns4b、ns5)。

以近期流行的zikv為例，zikv是蟲媒病毒中的一種，主要由白天活動的伊蚊叮咬傳播，但其傳播方式還有母嬰垂直傳播、性傳播及輸血傳播。

第一株zikv於1947年在烏幹達寨卡森林的恆河猴中被首次分離得到，第二株病毒於1948年在同一地區的白線斑蚊(aedes.africanus)分離得到。在2007年前，只偶爾出現人類感染病例。2007年4月，zikv在西太平洋密克羅尼西亞的雅浦(yap)島上首次爆發，出現49例zikv感染確診病例，59例zikv感染疑似病例。2013年-2014年，zikv在法國玻里尼西亞、復活節群島、庫克群島、新蘇格蘭再次暴發流行。2015年4月在巴西的爆發導致目前(2016年5月18日)全球60個國家出現zikv的感染。

zikv感染導致發燒、疹子、關節疼痛、肌肉疼痛、頭痛和結膜炎等症狀，但症狀多較溫和，為自限性疾病，一般2～7天後自行好轉。人感染後可獲得持久的終生免疫，目前沒有感染後再次感染的報導。

但是目前已證實zikv感染孕婦後，病毒可穿透胎盤屏障，或可導致嬰兒出現小頭症或其他比較嚴重的腦損傷，尤其是在懷孕的前3個月。同時，zikv感染可能還與吉蘭-巴雷(guillain-barre)症候群有關。

登革熱是由denv引起的由蚊子傳播的熱帶病。患者大約會在感染後3到14天後發作，症狀包括發熱、頭痛、肌肉和關節痛，還有典型性的麻疹樣皮疹。少部分患者病情可進一步惡化，出現登革出血熱，威脅生命，患者有出血、血小板減少和血漿蛋白滲出，或者進展為登革休克症候群，此時會出現兇險的低血壓休克。

黃熱病是由yfv引起的由蚊子傳播的急性病毒病，症狀通常包括發燒、冷顫、食慾下降、噁心、肌肉痛(特別是背部)與頭痛。症狀通常在發病5天內會改善。有些病人會在症狀改善1到2天後，發燒再度發生，出現腹痛，肝臟損傷導致黃疸，這類病患並發出血和腎衰竭的風險較高。

然而，目前國際上尚未有效預防和/或治療zikv和denv感染的疫苗或藥物。雖然已經針對yfv感染已有一種疫苗被開發出來，但是目前尚未開發出特效的藥物。目前，預防zikv、denv和yfv感染的主要措施是防止蚊蟲的叮咬，而對zikv、denv和/或yfv感染的治療是對症治療，緩解其疾病症狀。所以亟需研究針對zikv、denv和/或yfv的特效藥物，希望能夠為感染zikv的孕婦提供特異性治療，以減少小頭症嬰兒的出生，同時也為了防止預防和/或治療吉蘭-巴雷症候群；還希望能夠預防或者治療由denv感染引起的登革熱以及由yfv感染引起的黃熱病。

技術實現要素：

本發明的目的在於提供一種可以抑制寨卡病毒(zikv)、登革病毒(denv)和/或黃熱病病毒(yfv)感染的小分子藥物，從而實現對zikv、denv和/或yfv感染的預防和/或治療。

在第一方面，本發明提供了一種抑制寨卡病毒、登革病毒和/或黃熱病病毒感染的方法，包括給予有效量的孟魯司特鈉。

在第二方面，本發明提供了孟魯司特鈉在製備用於抑制寨卡病毒、登革病毒和/或黃熱病病毒感染的藥物中的用途。

在第三方面，本發明提供了孟魯司特鈉在製備用於治療和/或預防寨卡病毒、登革病毒和/或黃熱病病毒感染相關病症或疾病的藥物中的用途。

通過使用孟魯司特鈉，zikv感染無論是在細胞水平上還是在動物水平上均被有效地且特異地抑制，denv和yfv感染也被有效地且特異地抑制。同時毒性實驗結果也顯示，孟魯司特鈉對細胞沒有明顯毒性。

附圖說明

圖1示出孟魯司特鈉對zikv毒株sz01感染bhk21細胞和vero細胞的抑制；從圖中可以看出，孟魯司特鈉可以有效抑制sz01對bhk21細胞和vero細胞的感染，ic50值分別約為0.33μm和1.21μm。

圖2示出孟魯司特鈉對zikv毒株flr感染bhk21細胞和vero細胞的抑制；從圖中可以看出，孟魯司特鈉可以有效抑制flr對bhk21細胞和vero細胞的感染，ic50值分別約為2.45μm和2.96μm。

圖3示出孟魯司特鈉對zikv毒株mr766感染bhk21細胞和vero細胞的抑制；從圖中可以看出，孟魯司特鈉可以有效抑制mr766對bhk21細胞和vero細胞的感染，ic50值分別約為1.78μm和1.92μm。

圖4示出孟魯司特鈉對denv-2和yfv-17d感染bhk21細胞的抑制；從圖中可以看出，孟魯司特鈉可以有效抑制denv-2和yfv-17d對bhk21細胞的感染，ic50值分別約為1.66μm和1.46μm。

圖5示出孟魯司特鈉在體外對人冠狀病毒hcov-oc43的抑制；從圖中可以看出，孟魯司特鈉對該毒株無明顯的抑制活性。

圖6示出孟魯司特鈉在體外對人冠狀病毒hcov-229e的抑制；從圖中可以看出，孟魯司特鈉對該毒株無明顯的抑制活性。

圖7示出孟魯司特鈉對bhk21細胞的毒性；從圖中可以看出，孟魯司特鈉無明顯毒性，其半數毒性濃度cc50>20000nm。

圖8示出孟魯司特鈉對ag6小鼠感染zikv毒株sz01的抑制；從圖中可以看出，與vehicle(dmso)相比，孟魯司特鈉明顯改善ag6小鼠的生存率。

具體實施方式

下面通過下文的實施例對本發明的具體技術方案作進一步清楚和完整的描述。需要理解的是，下文中具體描述的技術方案僅用於示例目的，無意於以任何方式對本發明的保護範圍進行限制。在不背離本發明的精神和宗旨的情況下，可以對本發明的技術方案進行修改。本發明的保護範圍由隨附的權利要求書來進行限定。

如上所述，本發明的目的在於提供一種可以抑制寨卡病毒(zikv)、登革病毒(denv)和/或黃熱病病毒(yfv)感染的小分子藥物，從而實現對zikv、denv和/或yfv感染的預防和/或治療。

為實現上述目的，本發明人以小分子藥物庫為基礎進行了篩選工作，目的是篩選出具有抑制zikv病毒活性的小分子，用於對zikv感染的預防和/或治療。經篩選，本發明人意外地發現，孟魯司特鈉表現出良好且特異的抑制zikv的活性。另外，本發明人還意外地發現，除了對zikv病毒良好且特異的抑制活性之外，孟魯司特鈉還表現出良好且特異的抑制denv和yfv的活性。

具體地，本發明人首先在細胞水平上研究了孟魯司特鈉對幾種zikv毒株感染bhk21和vero細胞的抑制作用，以及孟魯司特鈉對denv-2和yfv-17d感染bhk21細胞的抑制作用。結果發現，該藥物可以有效抑制zikv的活性，其中抑制毒株sz01對bhk21細胞和vero細胞感染的半數抑制濃度ic50分別約為0.33μm和1.21μm，抑制毒株flr對bhk21細胞和vero細胞感染的ic50分別約為2.45μm和2.96μm，抑制毒株mr766對bhk21細胞和vero細胞感染的ic50分別約為1.78μm和1.92μm。該藥物還能有效抑制denv-2和yfv-17d的活性，抑制denv-2對bhk21細胞感染的半數抑制濃度ic50約為1.66μm，抑制yfv-17d對bhk21細胞感染的半數抑制濃度ic50約為1.46μm。

其次，本發明人還在動物水平上研究了孟魯司特鈉對zikv的抑制作用，結果發現孟魯司特鈉對sz01毒株感染ag6小鼠也具有抑制作用，能明顯改善ag6小鼠的生存率。

再次，本發明人還在細胞水平上研究了孟魯司特鈉對兩株人冠狀病毒毒株感染hct-8和huh7細胞的抑制作用。結果發現，雖然孟魯司特鈉對寨卡病毒、登革病毒和黃熱病病毒感染具有抑制作用，但對人冠狀病毒感染卻無明顯的抑制活性，由此表明孟魯司特鈉對上述黃病毒的抑制作用是特異的。

另外，本發明人還發現，孟魯司特鈉不具有明顯細胞毒性。在本發明中，發明人以bhk21細胞為例對孟魯司特鈉的細胞毒性進行了驗證，結果發現其對細胞無明顯毒性，半數毒性濃度cc50>20000nm。因此，孟魯司特鈉具有較好的安全性。

基於以上發現，本發明人由此達成了本申請要求保護的發明。

在對本發明進行詳細描述之前，首先對孟魯司特鈉作簡單介紹。

孟魯司特鈉的英文名為montelukastsodium，其分子式為c35h35clno3s·na，化學結構式如下所示：

孟魯司特鈉目前是一種已經fda批准用於臨床治療哮喘和過敏性鼻炎的藥物，為口服的白三烯受體拮抗劑，能特異性抑制氣道中的半胱氨醯白三烯(cyslt1)受體，改善氣道炎症，有效控制哮喘症狀。孟魯司特鈉在fda制定的藥物對妊娠的危險性等級分類中為b類，具有較好的安全性，並且有文獻報導其還具有降低神經炎症，提升海馬神經發生，改善老年動物學習和記憶的作用。

因此，在第一方面，本發明提供了一種抑制寨卡病毒、登革病毒和/或黃熱病病毒感染的方法，包括給予有效量的孟魯司特鈉。

所述方法可以直接在動物體或者人體上實施，用於直接抑制寨卡病毒、登革病毒和/或黃熱病病毒感染，進而實現對寨卡病毒感染相關病症或疾病的預防和/或治療。所述方法也可以在組織或者細胞水平上實施，用於例如進行科學研究之目的。換言之，所述方法可以實施用於預防目的和/或治療目的，也可以實施用於非預防目的和/或非治療目的。

在此使用的術語「有效量」是指孟魯司特鈉能夠有效地抑制寨卡病毒、登革病毒和/或黃熱病病毒感染的量。本領域技術人員可以根據實驗對象、實驗目的、給藥方式等因素來確定所述有效量。

在第二方面，本發明提供了孟魯司特鈉在製備用於抑制寨卡病毒、登革病毒和/或黃熱病病毒感染的藥物中的用途。

在一個實施方案中，孟魯司特鈉與其它藥物聯合用於製備所述用於抑制寨卡病毒、登革病毒和/或黃熱病病毒感染的藥物。

所述其它藥物可以是，例如，恩利卡生(emricasan)、7-去氮-2』-c-甲基腺苷(7-deaza-2』-c-methyladenosine，7-deaza-2』-cma)、2』-c-甲基腺苷(2』-c-methyladenosine，2』-cma)、2』-c-甲基胞苷(2』-c-methylcytidine,2』-cmc)、2』-c-甲基鳥苷(2』-c-methylguanosine,2』-cmg)、2』-c-甲基尿苷(2』-c-methyluridine,2』-cmu)、(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯((-)-epigallocatechingallate,egcg)、氯硝柳胺(niclosamide)，但不限於此。

在第三方面，本發明提供了孟魯司特鈉在製備用於治療和/或預防寨卡病毒、登革病毒和/或黃熱病病毒感染相關病症或疾病的藥物中的用途。

在一個實施方案中，所述寨卡病毒感染相關病症或疾病是寨卡病毒感染引起的小頭症或吉蘭-巴雷症候群。

在本文中，當述及用於治療和/或預防寨卡病毒感染引起的小頭症時，是指將有效量的所述藥物直接給予寨卡病毒感染的孕婦，從而間接地治療該孕婦腹中胎兒所患小頭症和/或間接地預防胎兒患上小頭症。

小頭症是指頭部遠小於其他同齡和同性嬰兒頭部的新生兒畸形。若伴有腦發育不良，小頭症嬰兒可能會有發育障礙。小頭症從輕微到嚴重不等。造成小頭症可能有許多原因，其中包括寨卡病毒感染。

吉蘭-巴雷症候群是一種很少見但是很嚴重的疾病，往往發生在病毒或者細菌感染後的幾天到幾周內，會造成嚴重的神經損傷，常見症狀包括肌肉無力、疼痛、感官障礙，在相當嚴重的情況下會造成癱瘓。吉蘭-巴雷症候群是以周圍神經和神經根的脫髓鞘病變及小血管炎性細胞浸潤為病理特點的自身免疫性周圍神經病，經典型的吉蘭-巴雷症候群被稱為急性炎症性脫髓鞘性多發性神經病(aidp)，臨床表現為急性對稱性弛緩性肢體癱瘓。

在一個實施方案中，所述登革病毒感染相關病症或疾病是登革熱。

如前文所描述，登革熱是由denv引起的由蚊子傳播的熱帶病。患者大約會在感染後3到14天後發作，症狀包括發熱、頭痛、肌肉和關節痛，還有典型性的麻疹樣皮疹。少部分患者病情可進一步惡化，出現登革出血熱，威脅生命，患者有出血、血小板減少和血漿蛋白滲出，或者進展為登革休克症候群，此時會出現兇險的低血壓休克。

在一個實施方案中，所述黃熱病病毒感染相關病症或疾病是黃熱病。

如前文所描述，黃熱病是由yfv引起的由蚊子傳播的急性病毒病，症狀通常包括發燒、冷顫、食慾下降、噁心、肌肉痛(特別是背部)與頭痛。症狀通常在發病5天內會改善。有些病人會在症狀改善1到2天後，發燒再度發生，出現腹痛，肝臟損傷導致黃疸，這類病患並發出血和腎衰竭的風險較高。

在一個實施方案中，孟魯司特鈉與其它藥物聯合用於製備所述用於抑制寨卡病毒、登革病毒和/或黃熱病病毒感染的藥物。

所述其它藥物可以是，例如，恩利卡生、7-去氮-2』-c-甲基腺苷、2』-c-甲基腺苷、2』-c-甲基胞苷、2』-c-甲基鳥苷、2』-c-甲基尿苷、(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯或氯硝柳胺，但不限於此。

本申請實驗結果表明，zikv、denv和yfv感染均在細胞水平上被有效地且特異地抑制，使用孟魯司特鈉還可以在動物水平上有效地抑制zikv感染。同時毒性實驗結果還表明，孟魯司特鈉對細胞沒有明顯毒性。因此，可以使用孟魯司特鈉抑制寨卡病毒、登革病毒和/或黃熱病病毒感染，進而預防和/或治療寨卡病毒、登革病毒和/或黃熱病病毒感染相關病症或疾病，例如小頭症、吉蘭-巴雷症候群、登革熱或黃熱病。

實施例

實施例1.孟魯司特鈉在體外對zikv、denv和yfv感染的抑制

孟魯司特鈉抑制zikv、denv和yfv感染的實驗操作可以參考文獻：zhiwusun,etal.,intranasaladministrationofmaleicanhydride-modifiedhumanserumalbuminforpre-exposureprophylaxisofrespiratorysyncytialvirusinfection；viruses2015,7,798-819；doi:10.3390/v7020798，具體如下：

(1)將zikv、denv和yfv通過分別接種c6/36細胞進行擴增(參考scichinalifesci,doi:10.1007/s11427-016-5043-4)。

(2)使用無血清dmem在96孔板中梯度稀釋孟魯司特鈉，使其濃度分別為80μm、40μm、20μm、10μm、5μm、2.5μm、1.25μm、0.625μm，每孔加藥體積為50μl，每個濃度設置3個重複。

(3)使用無血清dmem稀釋zikv(毒株分別為sz01、mr766、flr)、denv-2或yfv-17d，使得病毒的終濃度為100tcid50(半數組織培養感染劑量)/ml,按照每孔50μl的量將病毒加入(2)中的96孔板，同時設置病毒感染的陽性組和無病毒無藥物的陰性組。病毒與藥物37℃條件下孵育1小時30分鐘。

(4)使用edta-egta消化液消化處理bhk21或vero細胞，使用含2％fbs的dmem將該細胞稀釋為2*105/ml，並按100μl/孔的量加入

(3)中的96孔板。之後在37℃、5％co2條件下培養。

(5)至陽性組細胞出現明顯cpe(致細胞病變效應)導致細胞全部死亡時，使用cck8檢測孟魯司特鈉對病毒的抑制活性。cck8檢測的具體操作如下：

a)小心吸棄96孔板中的培養基，加入新鮮的含2％fbs的dmem，繼續培養2-4小時。

b)將1mlcck8溶液加入9ml含2％fbs的dmem中(一塊96孔板的用量)，顛倒混勻，得到cck8反應液。

c)小心吸棄96孔板中的培養基，將b)中所述的cck8反應液加入96孔中，每孔100μl。

d)37℃條件下培養1小時，之後在酶標儀上測定各孔的od450吸光度值。

(6)計算孟魯司特鈉的抑制活性，使用的公式為：孟魯司特鈉的抑制活性＝(a藥物孔-a病毒孔)*100/(a無藥物孔-a病毒孔)，其中a藥物孔是指含有藥物、病毒、細胞和cck8的孔的吸光度，a病毒孔是指含有病毒、細胞和cck8的孔的吸光度，a無藥物孔是指只含有細胞和cck8的孔(無藥物無病毒)的孔的吸光度。

抑制試驗結果顯示：首先，孟魯司特鈉可以較好地抑制zikv的感染，抑制毒株sz01對bhk21細胞和vero細胞感染的半數抑制濃度ic50分別約為0.33μm和1.21μm(圖1)；抑制毒株flr對bhk21細胞和vero細胞感染的ic50分別約為2.45μm和2.96μm(圖2)；抑制毒株mr766對bhk21細胞和vero細胞感染的ic50分別約為1.78μm和1.92μm(圖3)。其次，孟魯司特鈉還可以較好地抑制denv-2和yfv-17d的感染，抑制denv-2對bhk21細胞感染的半數抑制濃度ic50約為1.66μm，抑制yfv-17d對bhk21細胞感染的半數抑制濃度ic50約為1.46μm(圖4)。

實施例2.孟魯司特鈉在體外對hcov-oc43和hcov-229e感染的抑制

(1)將人冠狀病毒毒株hcov-oc43(100tcid50)和hcov-229e(500tcid50)分別與如實施例1所製備的梯度稀釋的孟魯司特鈉混合，並將由此得到的混合液在37℃條件下孵育30分鐘。

(2)將hcov-oc43與孟魯司特鈉的混合液加入鋪有單層hct-8細胞的96孔板中，將hcov-229e與孟魯司特鈉混合液加入鋪有單層huh7細胞的96孔板中，每個濃度設置3個重複。將所述96孔板於33℃(hcov-oc43)或32℃(hcov-229e)孵育2小時，之後更換新鮮培養基。

(3)至陽性組細胞出現明顯cpe(致細胞病變效應)時，使用cck8檢測孟魯司特鈉對病毒的抑制活性，cck8檢測的具體操作參見實施例1。

抑制試驗結果顯示：孟魯司特鈉對hcov-oc43(圖5)和hcov-229e(圖6)均無明顯的抑制活性，結合實施例1的結果可以得出如下結論：孟魯司特鈉對上述黃病毒的抑制具有一定的特異性。

實施例3孟魯司特鈉對bhk21細胞的毒性檢測

孟魯司特鈉對bhk21細胞的毒性檢測操作可以參考文獻：zhiwusun,etal.,intranasaladministrationofmaleicanhydride-modifiedhumanserumalbuminforpre-exposureprophylaxisofrespiratorysyncytialvirusinfection.viruses2015,7,798-819；doi:10.3390/v7020798)，具體如下：

(1)使用無血清dmem稀釋孟魯司特鈉，使其濃度分別為40μm、20μm、10μm、5μm、2.5μm、1.25μm、0.625μm、0.3125μm，每孔加藥體積為100μl，每個濃度設置2個重複。

(2)使用edta-egta消化液消化處理bhk21細胞，使用含2％fbs的dmem將細胞稀釋為4*105/ml，並按100μl/孔的量加入(1)中的96孔板。之後在37℃、5％co2條件下培養4天。

(3)小心吸棄96孔板中的培養基，加入新鮮的含2％fbs的dmem，繼續培養2-4小時。

(4)將1mlcck8溶液加入9ml含2％fbs的dmem中(一塊96孔板的用量)，顛倒混勻，得到cck8反應液。

(5)小心吸棄96孔板中的培養基，將(4)中所述的cck8反應液加入96孔中，每孔100μl。

(6)37℃，5％co2條件下培養1小時，之後在酶標儀測定各孔的od450吸光度值。

(7)計算細胞的活性，使用的計算方法為：細胞活性＝(a藥物孔-a無細胞孔)*100/(a無藥物孔-a無細胞孔)，其中a藥物孔是指含有藥物、細胞和cck8的孔的吸光度，a無細胞孔是指不含藥物和細胞、只含有cck8的孔的吸光度，a無藥物孔是指不含藥物、只含細胞和cck8的孔的吸光度。

毒性實驗結果顯示：孟魯司特鈉對bhk21細胞無明顯毒性，其半數毒性濃度cc50>20000nm(圖7)。

實施例4.孟魯司特鈉在小鼠模型中對zikv感染的抑制

發明人在此以zikv病毒為例，進一步研究孟魯司特鈉在體內對黃病毒感染的作用。孟魯司特鈉在小鼠模型中對zikv感染的抑制實驗如下進行：

(1)將20隻ag6小鼠分成兩組(藥物組和對照組)，每組10隻，藥物組以45mg/kg腹腔注射給藥，對照組腹腔注射dmso。

(2)8小時後，每隻ag6小鼠腹腔注射1000pfu(空斑形成單位)的sz01病毒。病毒注射完畢後，藥物組以45mg/kg腹腔注射給藥，對照組腹腔注射dmso。

(3)藥物組連續7天以相同方式給藥，對照組連續7天以相同方式注射dmso，並每天觀測小鼠生存率。

小鼠模型抑制試驗結果顯示：孟魯司特鈉可以較好地抑制zikv毒株sz01對ag6小鼠的感染，從圖8中可以看出，與vehicle(dmso)相比，孟魯司特鈉明顯改善ag6小鼠的生存率。

對於本領域技術人員而言顯而易見的是，本發明並不限於上述示例的細節，在不背離本發明的精神和宗旨的情況下，本領域技術人員能夠想到本文所描述技術方案的變化方案，並且該變化方案也在本發明的保護範圍內。本發明的保護範圍由隨附權利要求所限定。

另外，應當理解，雖然本說明書通過實施方式來對本發明進行了描述，但是並非每個實施方式僅包含一個獨立的技術方案。本說明書的這種敘述方案僅為清楚起見，本領域技術人員應當將本說明書當作一個整體，各個實施方式中的技術方案可以適當組合，形成本領域技術人員可以理解的其它實施方式。